DCFHDA活性氧檢測方法

1、ROS活性氧檢測試劑盒-DCFHDA法產(chǎn)品組成:產(chǎn)品編號BB-47053規(guī)格200-1000TDCFHDA100ul活性氧陽性對照誘導(dǎo)劑lOOOul儲存條件：-20lC保存。有效期：年。注意事項：本試劑盒僅供科學(xué)研究使用，不可用于診斷或治療。螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋和管內(nèi)壁上的液體離心至管底，避免開蓋時試劑損失。禁止與其他品牌的試劑混用，否則會影響使用效果。樣品或試劑被細(xì)菌或真菌污染或試劑交叉污染可能會導(dǎo)致錯誤的結(jié)果。最好使用一次性吸頭、管、瓶或玻璃器皿，可重復(fù)使用的玻璃器皿必須在使用前潔洗并徹底淸除殘留清潔劑。避免皮膚或粘膜與試劑接觸。產(chǎn)品簡介：活性氧(Reactiv

2、eoxygenspecies,ROS)包括超氧自由基、過氧化氫、及其下游產(chǎn)物過氧化物和羥化物等，參與細(xì)胞生長增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。貝憚活性氧檢測試劑盒是一種利用熒光探針DCFH-DA進(jìn)行活性氧檢測的試劑盒。DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細(xì)胞膜，從而使探針很容易被標(biāo)記到細(xì)胞內(nèi)。在活性氧存在的條件下，DCFH被氧化生成熒光物質(zhì)DCF,綠色熒光強度與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平成正比,檢測DCF的熒光就可以知道細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。在激發(fā)波長502nm,發(fā)射波長530nm附近，使用熒光顯微鏡、激光共聚

3、焦顯微鏡、熒光分光光度計、熒光酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀等檢測DCF熒光，從而測定細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。本試劑盒可以用于各種真核培養(yǎng)細(xì)胞的檢測。本試劑盒提供了活性氧陽性對照試劑，以便于活性氧的檢測。產(chǎn)品特點：使用方便：可用激光共聚焦顯微鏡直接觀察、熒光分光光度計、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測；背景低，靈敏度高；線性范圍寬，使用方便。試劑盒以外自備試劑和儀器培養(yǎng)基移液器及吸頭離心機激光共聚焦顯微鏡或熒光分光光度計或酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀，激發(fā)波長500土15nm,發(fā)射波長53020nm,或者按照FITC熒光檢測條件檢測。使用方法：使用注意事項：螺旋蓋微雖試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)墜上的液體收集至管底

4、，避免開蓋時液體灑落.熒光探針標(biāo)記后，定要洗凈殘余的未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針，否則會導(dǎo)致背呆較高.探針標(biāo)記完畢并洗凈殘余探針后，可以進(jìn)行激發(fā)波長的掃描和發(fā)射波長的掃描，以確認(rèn)探件的標(biāo)記悄況是否正常.盡量縮短探針標(biāo)記后到測定所用的時間，以減少各種可能的謀荃.對丁藥物作用時間較短（2小時以內(nèi)）的細(xì)胞，先標(biāo)記探針，后用藥物刺激細(xì)胞.對丁藥物作用時間較長（6小時以上）的細(xì)胞，先用活性氧陽性對照誘導(dǎo)劑或相應(yīng)的藥物刺激細(xì)胞，后標(biāo)記探件.陽性對照誘導(dǎo)劑可以按照1:1000的比例使用例如標(biāo)記妤探針的細(xì)胞共1毫升，可以加入1微升的陽性對照誘導(dǎo)劑刺激.通常刺激后20-30分鐘內(nèi)可以觀察到非常顯著的活性氧水平升高.對丁不

5、同的細(xì)胞，活性氧陽性對照的效果可能冇較大的羞別.如果在刺激后30分鐘內(nèi)觀察不到活性氣的升高，可以適當(dāng)提高活性氣陽性對照誘導(dǎo)劑的濃度如果活性氧升高得過快，可以適當(dāng)降低活性氧陽性對照誘導(dǎo)劑的濃度.對丁某些細(xì)胞，如來發(fā)現(xiàn)沒冇刺激的陰性對照細(xì)胞熒光也比較強，可以按照1:2000-1:10000稀粹DCFH-DA.探針標(biāo)記的時間也可以根擁情況在15-60分鐘內(nèi)適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整.探針標(biāo)記：原位標(biāo)記：僅適用于貼壁培養(yǎng)細(xì)胞。按照1:1000-2000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DAo去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DAo加入的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜，通常對于六孔板的一個孔加入稀釋好的DCFH-DA

6、不少于1亳升。37C細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DAo通?；钚匝蹶栃詫φ赵诖碳ぜ?xì)胞20-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。收集后標(biāo)記：按照1:1000用無血淸培養(yǎng)液稀釋DCFH-DAo細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細(xì)胞濃度為1*106-2*107/毫升,37C細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無血淸細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DAo直接用活性氧陽性對照或自己研究的藥物刺激細(xì)胞，或把細(xì)胞等分成若干份后刺激細(xì)胞。通?；钚匝蹶栃詫φ照T導(dǎo)劑在刺激細(xì)胞20

7、-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。僅在陽性對照孔中加入陽性對照誘導(dǎo)劑，其余孔不必加入。檢測：對于原位標(biāo)記探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細(xì)胞后用熒光分光光度計、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測。對于收集細(xì)胞后標(biāo)記探針的樣品可以用熒光分光光度計、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測，用激光共聚焦顯微鏡直接觀察也可以。使用48Smn激發(fā)波長，525mn發(fā)射波長，實時或逐時間點檢測刺激前后熒光的強弱。DCF的熒光光譜和FITC非常相似，可以用FITC的參數(shù)設(shè)置檢測DCFo相關(guān)產(chǎn)品:產(chǎn)品產(chǎn)品號產(chǎn)品產(chǎn)品號AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒BB-4101細(xì)胞周期檢測試劑盒BB-4104AnnexinV-EGFP/PI凋亡試劑盒BB-4102JC-1線粒體膜電位試劑盒BB-4105MTT細(xì)胞增殖及毒性檢測試劑盒BB-4201Caspase3活性檢測試劑盒BB-4106CCK-8細(xì)胞增殖毒性檢測試劑盒BB-4202Caspase8活性檢測試劑盒BB-4107WST-1細(xì)胞增殖毒性檢測試劑盒BB-4203Caspase9活性檢測試劑盒BB-4108MTS細(xì)胞增殖與毒性檢測試劑盒BB-4204Caspase10活性檢測試劑盒BB-4