二甲卡因,一種合成的可卡因類似物：通過色譜 - 線性(共10頁)

1、二甲卡因，一種合成(hchng)的可卡因類似物：通過色譜 - 線性離子阱（高分辨率）質(zhì)譜檢測大鼠模型尿中含量研究其體內(nèi)(t ni)代謝摘要(zhiyo)二甲卡因，可卡因人工合成衍生物，秉著“勝利即正義”，作為一種新的精神活性物質(zhì)廣為使用，然而并沒有進(jìn)行任何安全檢測如藥物代謝的實(shí)例研究。因此這項(xiàng)工作的目的是通過使用液相色譜（高分辨率）質(zhì)譜（LC-HRMSn）研究其體內(nèi)和體外代謝。向Wistar大鼠給藥二甲卡因（20 mg/kg），在偶聯(lián)物酶裂解后通過固相萃取或利用蛋白質(zhì)沉淀法來提取尿中的代謝物。利用LC-HRMS來分離和鑒別代謝產(chǎn)物。主要的相反應(yīng)是酯水解，脫乙基，芳香環(huán)的羥基化反應(yīng)。主要相反應(yīng)是

2、的母體化合物中對氨基苯甲酸和幾個(gè)相反應(yīng)代謝產(chǎn)物N-的乙?；Ｔ诮o予普通劑量后鑒別代謝產(chǎn)物用于大鼠尿中二甲卡因鑒別。通過使用GC-MS和LC-MS的標(biāo)準(zhǔn)尿液篩查，可以檢測到二甲卡因和它的代謝產(chǎn)物。關(guān)鍵字：策劃藥；二甲卡因；代謝產(chǎn)謝；尿液篩查；C-MS；LC-MS；LLC-HRMS前言二甲卡因（DMC，可卡因，3-二乙基氨基-2,2-二甲基丙基）-4-氨基苯甲酸酯）在20世紀(jì)30年代用作牙科和眼科的局部麻醉劑，也作為多巴胺再攝取抑制劑， 類似于可卡因具有興奮作用，因此不能在市場隨意流通，因?yàn)樗羞@些精神效應(yīng)。于此同時(shí)DMC吸引了全球藥物的關(guān)注，是合法可卡因替代品，正如所謂“新的精神活性物質(zhì)”（NP

3、S）。它甚至名列歐洲毒品和毒品成癮監(jiān)測中心 “合成可卡因衍生物”范疇還而在眾多的網(wǎng)上商店提供。食用二甲卡因后，消費(fèi)者有愉悅的感覺，但也呼吸困難和心絞痛的投訴。大鼠腹膜內(nèi)注射后比較體內(nèi)二甲卡因和可卡因的藥理性質(zhì)。對多巴胺（DA）水平和它的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了測量。研究表明二甲卡因通過刺激獎(jiǎng)賞系統(tǒng)度提高多巴胺在伏隔核的濃度。伍德沃德等，表明DMC在抑制多巴胺再攝取方面效力上類似于可卡因。威爾科克斯等比較不同的局部麻醉藥的藥理藥性，總結(jié)不同藥物抑制多巴胺攝取效力的順序?yàn)椋嚎煽ㄒ?二甲卡因丁卡因普魯卡因 氯卡因。他們還發(fā)現(xiàn)，在另一項(xiàng)研究中，DMC增加 DA的含量，而且比可卡因更有可能被猴子引發(fā)自辦。代謝和探

4、測生物樣本結(jié)果尚未公布。因此，這項(xiàng)工作的目的是用液相色譜 - 高分辨線性離子阱質(zhì)譜（LC-HR MS）鑒別大鼠尿中期和期代謝產(chǎn)物，并通過使用GC-MS和LC-MS標(biāo)準(zhǔn)尿液篩查方法（SUSAS），研究的正常使用者尿中的劑量探測限。實(shí)驗(yàn)(shyn)化學(xué)藥品和試劑(shj)二甲(r ji)卡因（英國特丁頓，LGC公司），Isolute HCX墨盒（130 mg，3mL）（瑞典，Uppsala）。所有的化學(xué)藥品和試劑來源VWR（德國，DarRmstadt公司），并且都屬于分析用純度。尿樣本在體內(nèi)代謝的研究是通過使用雄性大鼠（Wistar系，查爾斯河，Sulzfeld，德國）尿液，毒理診斷原因符合德國法

5、律。為鑒別代謝物，胃插管給單一、高（20mg/kg體重）劑量的二甲可因水性懸浮液。將大鼠置于代謝籠24 h，水可自由采食。在24小時(shí)內(nèi)分離糞便收集尿液作為樣品池。所有樣品直接分析儲(chǔ)存在-20。給藥前收集空白尿液，檢查是否有化合物干擾樣品。用于LC-HRMS檢測相反應(yīng)代謝產(chǎn)物的樣品制備和Welter等觀點(diǎn)一致，用乙酸（1 mol/L，大約50微升）將2.5毫升尿液的PH值調(diào)至5.2，50微升的葡萄糖醛酸酶（EC no.3.2.1.31; E.Merck公司，達(dá)姆施塔特，德國）和芳基硫酸酯酶（EC3.1.6.1無; E.Merck公司）混合，在56孵育1.5 h。然后用2.5毫升水稀釋尿液樣本，并

6、上載先前用1 ml甲醇和1ml水調(diào)好的HCX盒。樣品通過后，盒用1ml水，1ml 0.01mol/L的鹽酸，并再次用1mL水沖洗。保留的非基本化合物首先洗脫到裝有1ml甲醇（級分1）的1.5毫升反應(yīng)小瓶中，而第二步驟中基本化合物洗脫在裝有1mL 98/2（v/v）的混合物：新制備的甲醇-32氨水（級分2）不同的小瓶。該洗脫物在56氮?dú)饬髦姓舭l(fā)至干，重新溶于1:1的10mmol/L水性酸銨緩沖液和含有0.1（v/v）甲酸乙腈混合溶液中。用于LC-HRMS檢測相反應(yīng)代謝產(chǎn)物的樣品制備如其他地方所述葡糖苷酸和硫酸鹽反應(yīng)。簡言之，向200L尿加入200L乙腈混合，混合物離心14000g,5 min，和

7、取1 0L上清液用于LC- HRMS分析。LC-HRMS鑒別相反應(yīng)代謝產(chǎn)物按照Welter等所說， 通過由一臺(tái)脫氣機(jī)，一四元泵，和UltiMate 3000 RS自動(dòng)進(jìn)樣器，配備了加熱電噴霧離子化（HESI）II源的TF Velos軌道離子阱組成Dionex UltiMate3000 RS泵（賽默飛世 科學(xué)（TF），Dreieich，德國）來分析提取物。該LC柱是一個(gè)TF的Hypersil Gold（1502.1毫米，1.9微米）。用10mmol/L含有流動(dòng)相組分A：0.1甲酸銨緩沖液（v/v），流動(dòng)相B：含0.1甲酸（v/v）乙腈的甲酸銨緩沖液進(jìn)行程序梯度洗脫。洗脫梯度為A從98至0時(shí)間設(shè)置

8、為21分鐘，流速為500L/min,進(jìn)樣體積為10L。在MS操作條件為：ESI，正模式；套管氮?dú)鈿饬髀?0 AU；輔助氣體為20 AU；源電壓4 kV;源加熱器溫度為400；離子傳輸毛細(xì)管溫度為300；毛細(xì)管潛在的4 V. CID MS-MS實(shí)驗(yàn)在數(shù)據(jù)依賴掃描模式進(jìn)行（M / Z 100-800）。其他設(shè)置為：標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能量35；最小信號(hào)閾值100計(jì)數(shù);外存儲(chǔ) 30000；隔離寬度1.5 U；激活Q值為0.25；激活時(shí)間為30毫秒；動(dòng)態(tài)排除模式；重復(fù)計(jì)數(shù)為2；重復(fù)持續(xù)時(shí)間15秒；排除持續(xù)時(shí)間15秒。該TF校準(zhǔn)混合物用于日常質(zhì)量校正。GC-MS 尿液篩查鼠尿樣品(yngpn)制備按照之前公開的方

9、法。簡言之，將尿液樣品提交至相反應(yīng)(fnyng)酸水解后的結(jié)合物然后(rnhu)用二氯甲烷 - 異丙醇 - 乙酸乙酯混合液1：1：3（V / V）萃取。蒸發(fā)后，在微波照射（450瓦，5分鐘）下用乙酸酐 - 吡啶混合物乙?；瘹堄辔铮舭l(fā)，溶解在100L的甲醇。;通過使用帶有HP5972A MSD質(zhì)量光譜儀和HP MS化學(xué)工作站（DOS系列）HP G1034C軟件版本C03.00的惠普（安捷倫，德國Waldbronn HP）5890系列II氣相色譜儀，分析萃取液。氣相色譜條件分別為：不分流進(jìn)樣；Thermo Scientific的TG-1MS毛細(xì)管柱（12米0.2毫米 I.D.），交聯(lián)甲基聚硅氧烷

10、，330納米的薄膜厚度；注入口溫度為280；載氣氦氣;流速1 mL/min；碰撞氣體甲烷。該柱溫度2分鐘保持在100， 然后以每分鐘30程序升溫至310維持5分鐘。該MS條件為：全掃描模式下，M /Z 50-550 U；電子電離（EI）模式下，電離能為70 eV；離子源溫度為220；毛細(xì)管直接跨面，在280下加熱。質(zhì)量色譜儀峰的鑒別是由電腦比較峰下質(zhì)量光譜（背景扣除后）確定的。此外，由GC-MS系統(tǒng)獲得的全掃描的數(shù)據(jù)文件通過自動(dòng)化質(zhì)量光譜反卷積和鑒定系統(tǒng)（AMDIS）進(jìn)行了評價(jià)。LC-MS 尿液篩查尿液樣品（100L）用乙腈稀釋，搖勻，離心，蒸發(fā)，重新溶解在溶劑中。通過使配備了一個(gè)HESI二極

11、源的TF LXQ線性離子阱質(zhì)譜，并連接到TF的Accela液相色譜系統(tǒng)來分析樣品。該LC條件適用于LC-HRMS，MS設(shè)置如別處描述。簡言之，數(shù)據(jù)依賴型串聯(lián)質(zhì)譜法（DDA）是從MS1選擇母離子； 一次裂解進(jìn)行全掃描模式（M/Z 100-800）。 二次裂解和三次裂解在DDA模式進(jìn)行：選4個(gè)DDA MS2掃描過濾器，在一次裂解中四個(gè)最強(qiáng)烈的信號(hào)中提供二次裂解；另外，選擇8個(gè)三次裂解掃描過濾器來記錄MS2最強(qiáng)烈和第二最強(qiáng)烈的信號(hào)。結(jié)果和討論LC-HRMS分析的二甲卡因的相和相代謝物L(fēng)C分離鼠尿提取物之后用全掃描HRMS鑒定二甲卡因的尿代謝物。代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)通過不同的MS階段檢測到的碎片來推測，這是碎

12、片與母體化合物相關(guān)。LC- HR MS能在精確質(zhì)量的基礎(chǔ)上徹底鑒別代謝產(chǎn)物。根據(jù) HRMS光譜圖所示(Fig.1) ，I相代謝產(chǎn)物被鑒定為：2-（二乙基氨基）-2-甲基丙醇（光譜圖2），去乙基，羥基，羥乙基，二羥基，和羥基二去乙基 DMC。根據(jù)在圖中所示的HRMS譜（Fig.2）Fig.1 二甲(r ji)卡因相反應(yīng)代謝(dixi)產(chǎn)物的LC-HRMS的光譜(gungp)，它們PM的精確質(zhì)量記錄在MS1，在相應(yīng)的主要碎片記錄在MS2，和MS2的兩個(gè)最高峰的碎片記錄在MS3，如果有的話，元素組成的計(jì)算也給出精確質(zhì)量的精確質(zhì)量的偏差，以ppm錯(cuò)誤給出。 Fig.2 二甲(r ji)卡因相反應(yīng)(fn

13、yng)代謝產(chǎn)物的LC-HRMS的光譜(gungp)，它們PM的精確質(zhì)量記錄在MS1，在相應(yīng)的主要碎片記錄在MS2，和MS2的兩個(gè)最高峰的碎片記錄在MS3，如果有的話，元素組成的計(jì)算也給出精確質(zhì)量的精確質(zhì)量的偏差，以ppm錯(cuò)誤給出。我們確定為下列(xili)另外的化合物是以N-乙?；x物，葡糖苷(tnggn)酸，或兩者的組合形式(xngsh)排泄：N-乙酰，羥基N-乙酰，去乙基，N-乙酰，二去乙基 N-乙酰，羥去乙基 N-乙酰，羥基 - 雙 去乙基， N-乙酰，N-O葡糖苷酸，羥基去乙基-N-O葡糖苷酸，羥基葡糖苷酸，二 - 羥基葡糖苷酸，2-（二乙氨基(nj)）-2-甲基丙醇葡糖苷(tng

14、gn)酸，羥去乙基葡糖苷(tnggn)酸，羥基 - 雙 去乙基葡糖苷酸和羥基N-乙酰葡糖苷酸二甲卡因。（括號(hào)中的數(shù)字是圖1和圖2中對應(yīng)的質(zhì)譜的數(shù)目）。表1列出了計(jì)算和測量的質(zhì)量以及以ppm計(jì)量的所有相相反應(yīng)的數(shù)值。 ESI-HRMS測量的相相反應(yīng)代謝產(chǎn)物的鑒別及相應(yīng)的碎片二甲卡因的質(zhì)子化分子碎片（M/Z 279.2071，頻譜1）旁有一些特征的碎片。旁酯鍵旁的裂解產(chǎn)生有m/z 120.0446（對氨基苯甲酸）碎片離子以及從側(cè)鏈脫水產(chǎn)生有m /z142.1593的碎片離子。另一種裂解方式是側(cè)鏈胺的裂解，產(chǎn)生m/ z 206.1181（二乙基氨基的斷裂）碎片離子。二次質(zhì)譜裂解中最豐富的離子（m/z

15、 142.1593）在第三次質(zhì)譜裂解階段進(jìn)一步裂解為m/z 86.0964碎片離子。在這些碎片離子譜圖的基礎(chǔ)上，考慮到代謝反應(yīng)和不同元素組成引起質(zhì)量改變，通過比較不同階段的質(zhì)譜譜圖來鑒別二甲卡因的代謝產(chǎn)物。叔胺的脫乙基化會(huì)產(chǎn)生m/z 251.1754代謝產(chǎn)物。側(cè)鏈碎片離子m/z值改變了28u（在二次裂解中m/z由142.1593變?yōu)?14.1279；在三次裂解m/z值由86.0964變?yōu)?8.0650）表明去乙基化。如光譜圖8所示芳香環(huán)系統(tǒng)的羥基化產(chǎn)生了一次裂解碎片分子（m/z 295.2015）并使得對氨基苯甲酸部分相應(yīng)的二次裂解碎片離子改變了16 u（m/z由120.0446變?yōu)?36.0

16、395，m/z 206.1181變?yōu)?22.1129）。光譜圖5和7化合物分別代表芳香環(huán)去乙基和羥基化后的兩種異構(gòu)體。光譜圖4和6化合物分別代表芳香環(huán)雙去乙基化和羥基化后的兩種異構(gòu)體。對于相反應(yīng)代謝物，N-乙?；亲钪饕姆磻?yīng)。乙酰基化的二甲卡因的質(zhì)子化分子碎片（m/z 32。2177，光譜圖24）產(chǎn)生幾個(gè)特征性碎片。酯鍵旁的裂解導(dǎo)致乙?；膶Π被郊姿岵糠炙槠鍨閙/z 162.0552（由m/z 120.0446改變了42 u）。數(shù)值的變化也出現(xiàn)在光譜圖19和21中。側(cè)鏈的位斷裂會(huì)產(chǎn)生m/z 142.0446的碎片離子峰和相應(yīng)的m/z 180.0659碎片離子。在這些光譜圖的基礎(chǔ)上，考慮

17、到物質(zhì)不用元素組成和質(zhì)量的不同，二甲卡因的乙?；x產(chǎn)物通過比較不同階段裂解的質(zhì)譜圖來鑒別。例如，一個(gè)羥基化的芳香環(huán)乙?；髸?huì)引起碎片離子由m/z 136.03965到m/z 178.0502的改變（17，18，20，22和23）。二甲(r ji)可因的相反應(yīng)進(jìn)一步的反應(yīng)代謝(dixi)產(chǎn)物是葡萄糖醛酸苷化物。所有的羥基(qingj)化代謝產(chǎn)物都以葡萄糖醛酸形式排泄的，質(zhì)子化分子離子 m/z 176.0321的質(zhì)量改變以及通過比較相反應(yīng)代謝產(chǎn)物質(zhì)譜圖各自二次裂解峰可以證明。此外二葡萄糖醛酸苷（葡萄糖醛酸苷羥胺）先前描述的其他化合物是人類相關(guān)的可檢測的。除了乙?；蚱咸衍账峄硗庖环N相反應(yīng)在乙

18、?；推咸衍账峄笈判贡粰z測到。建議的代謝途徑在之前所述的代謝物基礎(chǔ)上，代謝途徑如圖所示。代謝途徑包括酯的裂解，去乙基化，雙去乙基化，芳香羥基化，羥基化以及這些組合反應(yīng)。相反應(yīng)產(chǎn)物包括乙?；推咸衍账峄皟烧呓M合反應(yīng)。為了與二甲卡因比較，選擇的結(jié)構(gòu)相關(guān)的普魯卡因主要被酶裂解為乙?；膶Π被郊姿岷?，二乙基己醇胺。 或的二甲卡因毒理檢測正如別處所述，利用尿液篩查法，在給藥mg/kg后 ，二甲卡因和幾個(gè)它的代謝產(chǎn)物可以再大鼠尿液中檢測到。因此，通過固定藥物和代謝產(chǎn)物的光譜圖和保留時(shí)間可以確定二甲卡因的攝入。作者尿液篩查法是在給藥1 mg/kg后利用GC-MS檢測到乙?；阁w化合物。因此，在幾個(gè)超劑量情況下，二甲卡因或者它的代謝產(chǎn)物在尿液中可以被檢測，可以參考已發(fā)表的特征光譜指紋圖。圖4a和4b所示的分別低劑量給藥后由LC-MS和GC-MS分析大鼠尿中所得的重建離子色譜圖。圖4結(jié)論(jiln)新藥二甲卡因的濫用的代謝研究