藥物毒理學(xué)：第二十章 全身用藥的毒性研究

1、第二十章 全身用藥的毒性研究全身用藥的毒性研究急性毒性研究長(zhǎng)期毒性研究第一節(jié) 急性毒性試驗(yàn)一、急性毒性和急性毒性試驗(yàn)概念及目的二、急性毒性試驗(yàn)內(nèi)容三、急性毒性分級(jí)一、概念和目的急性毒性(acute toxicity)是指機(jī)體(人或試驗(yàn)動(dòng)物)一次接觸或24小時(shí)內(nèi)多次接觸化學(xué)物后在短期(最長(zhǎng)到14天)內(nèi)所發(fā)生的毒性效應(yīng)，包括一般行為、外觀改變、大體形態(tài)變化以及死亡效應(yīng)。 一、概念和目的動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)(acute toxicity test)是指研究動(dòng)物一次接觸或24小時(shí)內(nèi)多次接觸受試物后在短期內(nèi)所發(fā)生的毒性反應(yīng)。目 的 1、了解新藥急性毒性的強(qiáng)弱 LD50 ED50 治療指（ LD50/ED50

2、） 相對(duì)毒性 安全系數(shù)（ LD5/ ED95）7 效應(yīng)強(qiáng)度 藥物濃度 100% 50% 0 最小有效濃度（閾濃度） 半數(shù)有效量 (EC50或ED50) 引起50%陽(yáng)性反應(yīng) 50%最大效應(yīng)的量 8 半數(shù)中毒量（TD50或TC50） 產(chǎn)生毒性反應(yīng)劑量的50% 半數(shù)致死量（LD50或LC50） 引起死亡劑量的50%9 Some Acute Oral LD50 Values CategoryDoseSpecies Chemical(mg/kg body weight) Practically nontoxic 15 000 Slightly toxic10 000Mouse 乙醇 5 000 Mode

3、rately toxic 4 900Rat 氯化鈉 750Rat 阿托品 500 Highly toxic 250Rat 胺甲萘(殺蟲(chóng)藥) 50 Extremely toxic 13Rat 對(duì)硫磷(殺蟲(chóng)藥) 5 Supertoxic 3Rat 華法林 0.4Duck 黃曲霉素B110 安全范圍 (Safety range): ED95和TD5之間的范圍。 安全系數(shù) LD5和ED95之間的比值 2、為長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)和特殊毒性試驗(yàn)劑量設(shè)置提供依據(jù) 致突變作用評(píng)價(jià)為核試驗(yàn)的最高劑量 為1/2半數(shù)致死量。 生殖毒性試驗(yàn)中，雌性動(dòng)物最高量為 急毒中的最大耐受量。 長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)中為急性毒性的最大耐 受量。

4、3、獲取新藥毒性反應(yīng)信息 毒性反應(yīng)癥狀、靶器官、致死原因等 一般情況 毒性大小 有明顯種屬差異 特殊情況 無(wú)明顯種屬差異 對(duì)一期臨床的指導(dǎo)意義 4、為新藥藥學(xué)研究提供參考 急性毒性試驗(yàn) 毒性反應(yīng)類型 定性 出現(xiàn)和消失時(shí)間 可能的靶器官和死亡原因 致死量 定量 最大給藥量 半數(shù)致死量急性毒性試驗(yàn)常用的毒性參數(shù)：LD50 or LC50 半數(shù)致死劑量或濃度ALD or ALC 近似致死劑量或濃度MLD or MLC 最小致死劑量或濃度 MTD or LC0 最大耐受量ED0 or EC0 最大無(wú)作用劑量試驗(yàn)基本內(nèi)容一、半數(shù)致死量（LD50)的測(cè)定 傳統(tǒng)方法 （一）試驗(yàn)動(dòng)物原則：急性毒性試驗(yàn)要求選擇

5、對(duì)化學(xué)毒物的代謝和毒效應(yīng)表現(xiàn)與人的反應(yīng)盡可能一致的試驗(yàn)動(dòng)物。動(dòng)物易于獲得品系純化價(jià)格較低和易于飼養(yǎng)等條件。 1試驗(yàn)動(dòng)物的種屬和品系最好用兩種種屬的動(dòng)物嚙齒類:小鼠、大鼠、豚鼠或家兔非嚙齒類：狗或猴。急性皮膚毒性試驗(yàn)可選用成年大鼠、豚鼠或家兔，優(yōu)先考慮白色家兔。而急性吸入毒性試驗(yàn)和經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)則優(yōu)先考慮大鼠。試驗(yàn)動(dòng)物的年齡和體重：急性試驗(yàn)動(dòng)物不宜過(guò)老或過(guò)幼，通常要求選擇剛成年動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)，而且須是未曾交配和受孕的動(dòng)物。例如：大鼠180240g、小鼠1825g、家兔22.5kg、豚鼠200250g、狗1015kg。同一批試驗(yàn)動(dòng)物體重變異范圍不應(yīng)超過(guò)該批動(dòng)物平均體重的20。 3.試驗(yàn)動(dòng)物的性別：

6、急性毒性試驗(yàn)的主要內(nèi)容是求LD50，除特殊要求外，一般急性毒性試驗(yàn)對(duì)動(dòng)物性別要求為雌雄各半。如果在預(yù)試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)化學(xué)毒物(如農(nóng)藥)對(duì)雌、雄動(dòng)物毒效應(yīng)的敏感性有明顯差異，則應(yīng)單獨(dú)分別求出雌性與雄性動(dòng)物各自的LD50。如果試驗(yàn)是為致畸試驗(yàn)作準(zhǔn)備，也可僅作雌性動(dòng)物的LD50測(cè)試。 （二）試驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)環(huán)境恒定的溫度：223濕度：3070%照度：晝夜各半飼料合格、飲水合格、墊料合格（三）劑量與分組 1查閱文獻(xiàn)了解化學(xué)毒物的結(jié)構(gòu)式、分子量、常溫常壓下的狀態(tài)、熔點(diǎn)、沸點(diǎn)、密度、閃點(diǎn)、揮發(fā)度、蒸氣壓、水溶性和脂溶性等理化特性，生產(chǎn)批號(hào)及純度，雜質(zhì)成分與含量等。確定使用哪一種計(jì)算方法求LD50，然后再設(shè)計(jì)劑量分

7、組。LD50的計(jì)算方法常用寇氏法、概率單位法、霍思法等。找出與受試化學(xué)毒物結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)近似的化學(xué)物的毒性資料，并以文獻(xiàn)資料中相同的動(dòng)物種系和相同接觸途徑所測(cè)得的LD50(LC50)值作為受試化學(xué)物的預(yù)期毒性中值。 2、劑量設(shè)計(jì) 預(yù)試驗(yàn)得出0-100%的死亡劑量范圍內(nèi)，設(shè)計(jì)5-6個(gè)劑量組。各劑量組間距為1:0.65-0.85,高劑量70%死亡率以上，低劑量死亡率30%以下。 每組10只，雌雄分開(kāi)單獨(dú)進(jìn)行，也可以雌雄各半來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)。 分組嚴(yán)格遵守隨機(jī)分組原則，采用隨機(jī)分組表進(jìn)行。 （四）給藥途徑的選擇: 給藥途徑（exposure routes）的選擇需考慮：模擬人在生活和生產(chǎn)環(huán)境中實(shí)際接觸受試

8、物的途徑和方式；有利于不同化學(xué)物之間急性毒性大小的比較；受試物的性質(zhì)和用途；各種受試物毒性評(píng)價(jià)程序的要求等。 最常用的染毒途徑為經(jīng)口、經(jīng)呼吸道、經(jīng)皮及注射途徑。 經(jīng)口(胃腸道)接觸 : 灌胃:小鼠0.21.0ml/只或0.20.4ml/10g 大鼠一次灌胃體積不超過(guò)5ml/只 家兔不超過(guò)10ml/2kg 狗不超過(guò)50ml/10kg 吞咽膠囊: 經(jīng)呼吸道接觸 : 靜式吸入 動(dòng)式吸入 經(jīng)皮膚接觸 :注射途徑接觸: （五）試驗(yàn)周期與毒效應(yīng)觀察1.中毒癥狀器官或系統(tǒng)中毒后常見(jiàn)表現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和軀體運(yùn)動(dòng)叫聲異常、痙攣、抽搐、強(qiáng)直、麻痹、反應(yīng)過(guò)低或過(guò)高等自主神經(jīng)系統(tǒng)瞳孔散大或縮小、流涎、流淚等呼吸系統(tǒng)溢液

9、、呼吸困難或過(guò)速血液循環(huán)系統(tǒng)心動(dòng)過(guò)速或過(guò)緩、心律不齊等胃腸系統(tǒng)腹瀉、便秘、糞便形態(tài)異常等其它皮疹、水腫、黃疸、消瘦、眼球突出或充血等（五）試驗(yàn)周期與毒效應(yīng)觀察: 2.體重在觀察試驗(yàn)動(dòng)物中毒癥狀的過(guò)程中，應(yīng)同時(shí)觀察體重的變化。體重可以反映動(dòng)物中毒后的整體變化。體重改變的原因很多，若化學(xué)毒物刺激或損傷消化道可出現(xiàn)試驗(yàn)動(dòng)物飲食減少甚至拒食，表現(xiàn)為體重減輕。若化學(xué)毒物引起腹瀉，將影響食物吸收和利用，體重也會(huì)減輕。如果化學(xué)毒物影響水的攝取或腎功能急性損傷，也可能在體重上反映出來(lái)。所以，對(duì)存活動(dòng)物尤其是對(duì)低于LD50劑量組的存活動(dòng)物應(yīng)在觀察期14天內(nèi)稱量其體重的變化以便了解受試物引起毒效應(yīng)的持續(xù)時(shí)間。 （

10、五）試驗(yàn)周期與毒效應(yīng)觀察:3.病理檢查及其他指標(biāo):急性毒性試驗(yàn)中，對(duì)死亡的動(dòng)物均應(yīng)及時(shí)進(jìn)行大體解剖和病理組織學(xué)檢查，肉眼觀察主要臟器的大體病理變化，如臟器大小、外觀、色澤的變化，有無(wú)充血、出血、水腫或其它改變，對(duì)有改變的臟器進(jìn)行取材做組織病理學(xué)檢查。對(duì)存活動(dòng)物在觀察期結(jié)束時(shí)進(jìn)行大體病理檢查必要時(shí)做組織病理學(xué)檢查。根據(jù)試驗(yàn)需要可進(jìn)一步擴(kuò)大觀察項(xiàng)目如體溫、心電圖、腦電圖或進(jìn)行某些生化指標(biāo)測(cè)定等。（五）試驗(yàn)周期與毒效應(yīng)觀察4.死亡和死亡時(shí)間重點(diǎn)觀察和記錄每只動(dòng)物死亡的時(shí)間，特別是最早出現(xiàn)死亡的時(shí)間以及各個(gè)劑量組動(dòng)物的死亡數(shù)。分析中毒死亡時(shí)間的規(guī)律具有一定意義，可為深人研究化學(xué)物的毒作用機(jī)制提供參考。

11、(六)經(jīng)典急性毒性試驗(yàn)的局限性1.消耗的動(dòng)物量大2.獲得的信息有限3.測(cè)得的LD50僅僅是一個(gè)近似值4.在安全性評(píng)價(jià)中僅評(píng)價(jià)動(dòng)物死亡和簡(jiǎn)單的癥狀觀察是不夠的，更需要的是生理學(xué)、血液學(xué)及其它化驗(yàn)檢查所提供的深入細(xì)致的毒性信息。三、最大給藥量測(cè)定法 在受試藥物合理的最大容積和最大濃度條件下，仍未測(cè)出LD50，可只求MTD值。 方法：用最大濃度和最大允許容量一次或一日23次給20只動(dòng)物（雌雄各半）后，連續(xù)觀察7-14天，未見(jiàn)任何動(dòng)物死亡，即為最大給藥量。 四、近似致死劑量法主要用于非嚙齒動(dòng)物的試驗(yàn)。常用Beagel犬或猴。1、估計(jì)可能的致死范圍。2、按50%遞增法，設(shè)計(jì)10-20個(gè)劑量的序列表。3、

12、在劑量的序列表中找出可能致死劑量范圍。五、固定劑量法（Fixed-dose procedure) 試驗(yàn)不以死亡為觀察終點(diǎn)，而以明顯的毒性體征為評(píng)價(jià)指標(biāo)。 用5、50、500和2000 mg/kg4個(gè)固定劑量中的一個(gè)做初試劑量，單次給藥。首選雌性動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)。六、其他方法 1、上下法（階梯法、序貫法） 2、累積劑量設(shè)計(jì)法（金字塔法）上下法（Up-and-Down Procedure）UDP由限度試驗(yàn)和主試驗(yàn)組成。限度試驗(yàn)分為2000mg/kg劑量水平和5000mg/kg劑量水平，用于受試物毒性可能較小的情況。兩種劑量的限度試驗(yàn)具體步驟有細(xì)微差別，但最多僅用5只動(dòng)物。 上 下 法主試驗(yàn)是一個(gè)預(yù)先設(shè)

13、計(jì)的給藥程序，在此程序中，每次給藥一只動(dòng)物，若該動(dòng)物存活，第二只動(dòng)物給予高一級(jí)劑量，若第一只動(dòng)物死亡或出現(xiàn)瀕死狀態(tài)，第二只動(dòng)物給予低一級(jí)劑量。在對(duì)每只給藥動(dòng)物仔細(xì)觀察48小時(shí)后，可以決定是否對(duì)下一只動(dòng)物給藥，以及給藥劑量。當(dāng)出現(xiàn)在最高劑量下有連續(xù)3只動(dòng)物存活，或在6只動(dòng)物中有5只連續(xù)發(fā)生在高一級(jí)劑量死亡、在低一級(jí)劑量生存的生死轉(zhuǎn)換等情況時(shí)，可以停止試驗(yàn)。根據(jù)終止時(shí)所有動(dòng)物的狀態(tài)，用最大可能性法計(jì)算LD50值 用于該方法的LD50計(jì)算軟件可從以下地址免費(fèi)下載： /oppfead1/harmonization/ F系列抗癌活性物的急性毒性試驗(yàn)研究研究背景以G四鏈體結(jié)構(gòu)為靶點(diǎn)的端粒酶抑制策略，成為抗

14、腫瘤藥物的研究熱點(diǎn)。然而目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于此類藥物的毒性研究甚少，缺乏有效的G四鏈體穩(wěn)定劑安全評(píng)價(jià)體系，限制了其臨床應(yīng)用。吲哚喹啉（去甲基白葉藤堿）衍生物F318系列化合物和凡等. 參與抗癌新藥F318體外代謝的大鼠細(xì)胞色素P450酶, 中國(guó)新藥雜志 2007, 16（10）, 765-769.研究目的評(píng)價(jià)受試物的急性毒性，估算LD50及其可信限，進(jìn)行大致的毒性分級(jí)。觀察毒性表現(xiàn)，為毒性作用機(jī)制的研究提供線索。為受試物的篩選及結(jié)構(gòu)修飾提供依據(jù)。為建立有效的G四鏈體穩(wěn)定劑安全評(píng)價(jià)體系做出基本準(zhǔn)備。研究框架研究方法上下法（Up-and-Down Procedure, UDP）試驗(yàn)動(dòng)物：昆明小鼠，雌性劑

15、量級(jí)數(shù)因子：3.2 1.75 5.5 17.5 55 175 550 2000 （單位：mg/kg）起始劑量 研究方法上下法（Up-and-Down Procedure, UDP）停止標(biāo)準(zhǔn) 1、最高劑量下連續(xù)3只動(dòng)物存活 2、任意連續(xù)6只試驗(yàn)動(dòng)物中有5只連續(xù)發(fā)生存活/死亡轉(zhuǎn)換 3、第一只動(dòng)物發(fā)生轉(zhuǎn)換之后至少有4只動(dòng)物進(jìn)入試驗(yàn)，并且其LD50估算值的范圍超出臨界值（2.5倍）研究方法上下法（Up-and-Down Procedure, UDP）觀察與記錄： 中毒癥狀，癥狀出現(xiàn)、消失時(shí)間，死亡情況，大體解剖數(shù)據(jù)處理： AOT 425(Version1.0) 研究結(jié)果試驗(yàn)序號(hào)給藥劑量（mg/kg）死

16、亡情況LD50(95%CI)(mg/kg)155O2138.9X355X417.5O55(14.51-286)555O6175X表1 FM318小鼠經(jīng)腹腔注射給藥的急性毒性結(jié)果及LD50計(jì)算注：O=生存，X=死亡研究結(jié)果試驗(yàn)序號(hào)中毒癥狀死亡情況大體解剖所見(jiàn)1無(wú)存活無(wú)異常2豎毛,行動(dòng)遲緩,閉眼,蜷縮24h后發(fā)現(xiàn)死亡,尸體腹面向下,伸展腹腔有少量黃色液體，肝、胃、腸顏色變黃，其他無(wú)異常3豎毛,腹式呼吸,運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)48h后發(fā)現(xiàn)死亡,尸體腹面向上無(wú)異常4無(wú)存活無(wú)異常5無(wú)存活無(wú)異常6大小便失禁,震顫,站立不穩(wěn)24h后發(fā)現(xiàn)死亡,尸體腹面向上,蜷縮無(wú)異常表2 FM318小鼠經(jīng)腹腔注射給藥的急性毒性反應(yīng)癥狀研

17、究結(jié)果試驗(yàn)序號(hào)給藥劑量（mg/kg）死亡情況LD50(95%CI)(mg/kg)1175O255O3175X455O103(55-175)5175X655O7175X表3 F318成鹽化合物小鼠經(jīng)靜脈注射給藥的急性毒性結(jié)果及LD50計(jì)算注：O=生存，X=死亡研究結(jié)果試驗(yàn)序號(hào)中毒癥狀死亡情況大體解剖所見(jiàn)1無(wú)存活無(wú)異常2無(wú)存活無(wú)異常3注射時(shí)排尿，靜臥，腹部抽搐，呼吸困難，掙扎，眼睛深紅，紫紺死亡無(wú)異常4腹式呼吸存活無(wú)異常5腹部抽搐死亡無(wú)異常6興奮存活無(wú)異常7上下跳躍，排尿，眼凸死亡無(wú)異常表4 F318成鹽化合物小鼠經(jīng)靜脈注射給藥的急性毒性反應(yīng)癥狀研究結(jié)果試驗(yàn)序號(hào)給藥劑量（mg/kg）死亡情況LD50(95%CI)(mg/kg)117.5O255O3175X455O81.41(55-72.2)5103.6X655O772.2X注：O=生存，X=死亡表5 FM318成鹽化合物小鼠經(jīng)靜脈注射給藥的急性毒性結(jié)果及LD50計(jì)算研究結(jié)果試驗(yàn)序號(hào)中毒癥狀死亡情況大體解剖所見(jiàn)1無(wú)存活無(wú)異常2無(wú)存活無(wú)異常3注射時(shí)排尿，行動(dòng)遲緩，眼睛充血，豎毛，鼻出血，嘴紫紺死亡無(wú)異常4腹部顫動(dòng)，異常興奮存活無(wú)異常5上下跳躍，眼凸，排尿死亡無(wú)異常6興奮存活無(wú)異常7上下跳躍，排尿死亡無(wú)異常表6 FM318成鹽化合物小鼠經(jīng)靜脈注射給藥