藥物分析學：第七章甾體激素類藥物的分析

1、第七章 甾體激素類藥物的分析Analysis of Steroid Hormon Drugs7.1.1第一節(jié)基本結(jié)構(gòu)和分類環(huán)戊烷并多氫菲 7.1.1第一節(jié)基本結(jié)構(gòu)和分類環(huán)上雙鍵的表示方法：雙鍵位置4 1,4 5 5(10) 1,5(10),8(14) 7.1.1基本結(jié)構(gòu)與分類甾體激素腎上腺皮質(zhì)激素性激素雄性激素及蛋白同化激素孕激素雌激素7.1.1基本結(jié)構(gòu)與分類1. 腎上腺皮質(zhì)激素 氫化可的松氫化潑尼松地塞米松磷酸鈉地塞米松：氫化可的松結(jié)構(gòu)的基礎上1，2位間引入一個雙鍵，9位上引入-F，16位上引入-CH3 氫化潑尼松：在氫化可的松結(jié)構(gòu)的基礎上1，2位間引入一個雙鍵7.1.1基本結(jié)構(gòu)與分類 氫化

2、可的松醋酸曲安耐德1. 腎上腺皮質(zhì)激素A環(huán)有4-3-酮結(jié)構(gòu)：UVC17位有-酮醇基或成酯：強還原性部分藥物C11-OH或C11=O部分藥物C6-X，C9-X含有21個C人工合成品：1、2位間有雙鍵，6位，9位引入鹵素，16位或16位引入甲基，16位引入羥基等。12967.1.1基本結(jié)構(gòu)與分類2. 雄性激素及蛋白同化激素 甲睪酮 苯丙酸諾龍7.1.1基本結(jié)構(gòu)與分類 2. 雄性激素及蛋白同化激素A環(huán)有4-3-酮結(jié)構(gòu)：UVC17位有-OH或成酯：含有19個C雄性激素母核19個C 蛋白同化激素母核18個C7.1.1基本結(jié)構(gòu)與分類3. 孕激素 黃體酮醋酸甲地孕酮7.1.1基本結(jié)構(gòu)與分類 3. 孕激素A環(huán)

3、有4-3-酮結(jié)構(gòu)：UVC17位有甲酮基或乙炔基：多數(shù)C17-OH或部分羥基被酯化含有21個C黃體酮炔諾酮7.1.1基本結(jié)構(gòu)與分類4. 雌激素 雌二醇炔雌醇A環(huán)為苯環(huán)，C3位有酚羥基：C17-OH或部分成酯或成醚部分藥物C17-CC含有18個C口服避孕藥，如炔諾酮、異炔諾酮、安宮黃體酮等 A環(huán)有4-3-酮結(jié)構(gòu)；有的第17位有羥基和乙炔基；7.1.1基本結(jié)構(gòu)與分類小結(jié)甾體激素碳原子數(shù)A環(huán)17位取代基腎上腺皮質(zhì)激素214-3-酮-醇酮基雄性激素194-3-酮-OH-CH3孕激素214-3-酮甲酮基雌激素18苯環(huán)C3-酚OH-OH-CCH7.2二. 鑒別試驗1. 強酸呈色反應鑒別試驗2. 官能團的反應

4、3. 制備衍生物測定熔點4. 紫外分光光度法5. 紅外光譜法（特征性強） 6. 薄層色譜法7. HPLC化學法物理法7.2二. 鑒別試驗1.強酸呈色反應鑒別試驗H2SO4 , H3PO4 , HClO4 , HCl甾體激素類藥物呈色2.官能團的反應(1) C17 醇酮基:強還原性（堿性酒石酸酮）2.官能團的反應(2) 酮基的呈色反應:甾酮類激素類藥物呈色羰基試劑羰基試劑：2,4-二硝基苯肼, 異煙肼 硫酸苯肼, 氨基脲, 苯肼異煙腙（黃色）7.2鑒別試驗異煙雙腙（黃色）黃體酮2.官能團的反應(3) 活波亞甲基的反應具甲酮基或活潑亞甲基的甾體激素類藥物呈色亞硝基鐵氰化鈉間二硝基酚芳香醛甲酮基亞硝

5、基鐵氰化鈉黃體酮藍紫色亞硝基鐵氰化鈉其他甾體淡橙色/不顯色如：7.2鑒別試驗黃體酮藍紫色在受精后不久，胎盤滋養(yǎng)層細胞就會分泌一種人絨毛膜促性腺激素（HCG）是由受孕婦女體內(nèi)胎盤產(chǎn)生的一種糖蛋白類激素，在孕婦的尿液中大量存在。而在非妊娠婦女尿液中幾乎不含有HCG。 活潑亞甲基反應（Zimmermann 反應）羰基鄰位的次甲基叫活潑亞甲基。 羰 基 C3、C11、C20次甲基 C2、C12、C21羰 基 C17次甲基 C16可的松雌酮2122117162.官能團的反應(4) 酚羥基的呈色反應雌激素類藥物紅色偶氮染料重氮苯磺酸(5) 乙炔基含炔基的甾體激素銀鹽沉淀AgNO37.2鑒別試驗2.官能團的

6、反應(6) 鹵素的反應7.2鑒別試驗有機氟F有機破壞有機氯茜素氟藍硝酸亞鈰HNO3AgNO3AgCl 呈色 Cl2.官能團的反應(7) 水解產(chǎn)物的反應7.2鑒別試驗香特臭特臭7.2二. 鑒別試驗1. 強酸呈色反應鑒別試驗2. 官能團的反應3. 制備衍生物測定熔點7.3三. 雜質(zhì)檢查1. 有關(guān)物質(zhì)的檢查雜質(zhì)檢查2. 硒的檢查3. 殘留溶劑的檢查4. 游離磷酸的檢查7.3三. 雜質(zhì)檢查1. 有關(guān)物質(zhì)的檢查雜質(zhì)檢查1.1 來源: 原料,中間體,異構(gòu)體,降解產(chǎn)物1.2 方法:高低濃度對比法 TLC法 HPLC法 規(guī)定雜質(zhì)斑點數(shù)目 規(guī)定雜質(zhì)斑點顏色 規(guī)定雜質(zhì)峰數(shù)目 規(guī)定雜質(zhì)峰峰面積15.3雜質(zhì)檢查醋酸氟

7、輕松 檢查 有關(guān)物質(zhì)供試品溶液： 3.0mg/ml對照溶液： 3.0mg/ml 0.06mg/ml固 定 相：硅膠G展 開 劑：氯仿-甲醇（97:3）點 樣 量： 5L檢 視：堿性四氮唑藍試液判定依據(jù)：供試品溶液如顯雜質(zhì)斑點， 不得多于2個， 其顏色與對照液的主斑點比較，不得更深。12供對主斑點供試品溶液：10 mg/ml對照溶液(1)：10mg/ml 0.1mg/ml對照溶液(2)：10mg/ml 0.2mg/ml固 定 相：硅膠GF254展 開 劑：二氯甲烷-乙醚-甲醇-水 （77 : 15 : 8 : 1.2）點 樣 量： 5 L檢 視：紫外燈254 nm判定依據(jù)：供試品如顯雜質(zhì)斑點，與

8、對照溶液(1)所顯的主斑點比較不得更深，如有一個斑點深于對照溶液(1)，與對照溶液（2）所顯的主班點比較，不得更深。醋酸去氧皮質(zhì)酮 檢查 有關(guān)物質(zhì)供對1對21%2%主斑點12315.3雜質(zhì)檢查甲睪酮 檢查 有關(guān)物質(zhì) 取對照溶液10l注入液相色譜儀，調(diào)整儀器靈敏度，使主成分峰高度達記錄儀的滿量程的25%。再精密量取供試品溶液和對照溶液各10l ，進樣。記錄至主成分峰保留時間的2倍。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，不得超過3個，單個雜質(zhì)峰面積不得大于對照溶液主峰面積的0.5倍， 各雜質(zhì)峰面積總和不得大于對照溶液主峰面積的3/4。12供試品溶液：0.6 mg/ml對照溶液：0.6mg/ml 0.012

9、mg/ml315.3雜質(zhì)檢查甲睪酮 檢查 有關(guān)物質(zhì)供對主峰300050010007.3雜質(zhì)檢查2.1 來源：合成中用二氧化硒(SeO2)脫氫。2.2 方法：三. 雜質(zhì)檢查2. 硒的檢查(A378nm)15.3雜質(zhì)檢查醋酸氟輕松 檢查 硒對照品溶液的制備：精密量取標準砷溶液（每1mL相當于1g的Se）5mL, 置100mL燒杯中，加硝酸溶液(130) 25mL和水10mL，即得。供試品溶液的制備：取本品50mg，照氧瓶燃燒法進行破壞后，將吸收液轉(zhuǎn)移至100ml燒杯中，用水15ml沖洗燃燒瓶及鉑絲，并入吸收液中，即得。檢查法：將上述硒對照品溶液和供試品溶液分別用氨試液調(diào)節(jié)pH值2.00.2后，轉(zhuǎn)移

10、至分液漏斗中，用水少量分次洗滌燒杯，洗液并入分液漏斗中，使成60ml，各加鹽酸羥胺溶液(12)1ml，搖勻后，立即精密加二氨基奈試液5ml，搖勻，在室溫下放置100min，精密加環(huán)己烷5ml，強烈振搖2，靜置分層，取環(huán)己烷脫水后，測A378nm。規(guī)定A供A對。7.3雜質(zhì)檢查三. 雜質(zhì)檢查3. 殘留溶劑的檢查甲醇：0.3%丙酮：0.5%（g/g)GC法 內(nèi)標加校正因子測定樣品中甲醇和丙酮的含量 頂空進樣法 限量要求：7.3雜質(zhì)檢查三. 雜質(zhì)檢查3. 游離磷酸的檢查3.1 原理：地塞米松磷酸鈉氫化可的松磷酸鈉倍他米松磷酸鈉氫化潑尼松磷酸鈉7.3雜質(zhì)檢查三. 雜質(zhì)檢查3. 游離磷酸的檢查地塞米松磷酸

11、鈉 精密稱取本品20mg，置25ml量瓶中，加水15ml溶解，精密加鉬酸銨硫酸試液2.5ml與1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶液1ml，加水至刻度，搖勻，在20放置3050分鐘，照分光光度法，在740nm處測定吸收度，與對照液4.0ml同法處理的吸收度比較，不得更大。（對照液 0.0035%KH2PO4）（對照液 0.0035%KH2PO4）7.4四. 含量測定含量測定4.1 UV法-3-酮 240nm ()腎上腺皮質(zhì)激素雄性激素和蛋白同化激素孕激素 苯環(huán) 280nm ()雌激素適用于原料藥。 樣品中“其它甾體”不合格時，不適用。7.4四. 含量測定含量測定4.2 比色法 異煙肼比色法 四氮唑比

12、色法 kober反應比色法7.4含量測定 異煙肼比色法1. 原理 C3酮基及某些其他位置上的酮基能與羰基試劑異煙肼在酸性條件下形成黃色異煙腙，在一定波長下具有最大吸收，可用于定量。7.4含量測定 異煙肼比色法2. 反應條件溶劑：無水乙醇，無水甲醇（溶解度和可逆）酸的種類、濃度及異煙肼的濃度：常用HCl HCl：異煙肼 = 2M:1M時，獲最大吸收度。 水分、O2、光線的影響含水量腙水解A%O2與光線無影響7.4含量測定 異煙肼比色法2. 反應條件反應的專屬性 反應條件下，4-3-酮具有一定專屬性 C20酮基反應慢， C17酮基反應慢； C11酮基不反應 4-3-酮室溫下，不到1h反應完全含量測

13、定倍他米松磷酸鈉的含量測定取本品適量= 420 nm50mL量瓶精密量取1.0mL異煙肼溶液20 mL60水浴, 1 h甲醇25 mL量瓶供試液：對照液： 取倍他米松磷酸鈉適量搖勻冷卻甲醇Ai7.4含量測定 四氮唑比色法1. 原理 腎上腺皮質(zhì)激素類C17-醇酮基強還原性7.4含量測定 四氮唑比色法2. 四氮唑鹽的種類：不溶于水的三苯甲瓚深紅氯化三苯四氮唑（TTC）有名：紅四氮唑（RT）7.4含量測定 四氮唑比色法2. 四氮唑鹽的種類：雙甲瓚（暗藍）藍四氮唑（BT）7.4含量測定 四氮唑比色法3. 討論 結(jié)構(gòu)、反應溫度和時間、水分、堿濃度、空氣中氧、試劑類別和濃度等，對反應速度、呈色強度和穩(wěn)定性

14、有影響。3.1 官能團對反應速度的影響 C11: V11C=O V11C-OH V游離體V酯類 V簡單酯V復雜酯 醋酸酯磷酸酯琥珀酸酯三甲基醋酸酯7.4含量測定3.2 溶劑、水分的影響含水量5%含水10%A10%含水30%幾無反應無醛無水乙醇醛 A溶劑：無水乙醇7.4含量測定3.3 堿的種類和加入順序的影響采用氫氧化四甲基銨能得到滿意結(jié)果。 加入順序：先加TTC或BT，后加(CH3)4N+OH-原因： 皮質(zhì)激素與(CH3)4N+OH-長時間接觸，有部分分解。7.4含量測定3.4 O2與光線的影響反應過程反應產(chǎn)物怕光避光、快速O2影響顏色強度和穩(wěn)定性隔絕空氣充N2、快速7.4含量測定3.5 溫度

15、與時間的影響t甲瓚分解%ChP 25 4045BP 30 1h7.4含量測定3. Kober反應比色法：*max= 465max= 5157.4含量測定3. Kober反應比色法：(1) 條件較難控制，易出雙色黃+紅(2) 重現(xiàn)性較差： 呈色強度和穩(wěn)定性受試劑濃度、組成、反應時間和溫度的影響。 甾體激素提取物中其他物質(zhì)及制劑中穩(wěn)定劑，賦形劑，溶劑對測定有干擾為克服這些缺點，對Kober反應所用試劑進行進鐵酚試劑法7.4含量測定 鐵酚試劑法4.1 鐵酚試劑的組成： 硫酸亞鐵銨、濃硫酸、過氧化氫、苯酚4.2 各試劑的作用 Con.H2SO4和H2O2的作用即：Fe2+Fe3+7.4含量測定4.2

16、各試劑的作用 三價鐵的作用加快黃色生成的速度促進黃色向紅色的轉(zhuǎn)變增加紅色的穩(wěn)定性苯酚的作用消除反應產(chǎn)生的熒光促進紅色的生成7.4四. 含量測定含量測定4.3 HPLC法（甾體激素類藥物常含有結(jié)構(gòu)相似的其他甾體雜質(zhì)，對利用結(jié)構(gòu)特征設計的比色法有干擾）特點：用樣量少，靈敏度高，分離效果好USP、BP、JP均采用RP-HPLC（大多內(nèi)標法）15.4含量測定黃體酮注射液的含量測定取本品適量乙醚50mL量瓶精密量取5.0mL揮散乙醚殘渣甲醇振蕩提取10 min/次/4 次離心上清液內(nèi)標溶液5.0 mL甲醇25mL量瓶供試品溶液的制備對照品溶液的制備15 min黃體酮約25mg甲醇25mL量瓶精密量取5.

17、0mL內(nèi)標溶液5.0 mL25mL量瓶含量測定黃體酮注射液的含量測定測定與計算供試品溶液 5 L對照品溶液 5 LHPLCAi供，As供Ai對，As對含量測定黃體酮注射液的含量測定專屬性 “干擾” 方法學驗證 對照品色譜圖陰性對照溶液色譜圖供試品溶液的制備(不加內(nèi)標)陰性對照溶液供試品溶液色譜圖缺黃體酮的模擬注射液供對陰性對照As對Ai對Ai供As供含量測定黃體酮注射液的含量測定方法學驗證 儀器精密度 方法重復性 儀器穩(wěn)定性同一工藝下平行制備6份供試液測定值的RSD。 標準曲線及線性范圍x：Ciy：Ai/As 回收率試驗準確度發(fā)現(xiàn)量與加入量的接近程度R = 發(fā)現(xiàn)量/加入量1 耐受性同一溶液6次

18、測定的RSD。供試品制備工藝的穩(wěn)定性方法學驗證 標準曲線及線性范圍 精密吸取黃體酮對照品儲備液(1.0mg/mL)溶液1.0、2.0、3.0、5.0 、10.0 mL分別置5個25mL容量瓶中，分別精密加入內(nèi)標儲備液5.0mL，用甲醇稀釋并定容至刻度。在上述色譜條件下依法測定，記錄黃體酮和內(nèi)標物峰面積。以對照品與內(nèi)標峰面積比值(Ai/Ais)為縱坐標，黃體酮對照品濃度（Ci）為橫坐標，繪制標準曲線。結(jié)果表明，黃體酮在40.0400 gmL-1范圍內(nèi)峰面積與濃度呈良好線性關(guān)系，回歸方程為：Ai/Ais = 0.0054 C + 0.0093 （n = 5，r 2 = 0.9998），結(jié)果見表1。

19、12345C (gmL-1)40.080.0120.0200.0400.0Ai1305022653024021566525121302650Ais602202612202595821600255602520Ai/Asi0.2170.4330.6751.0872.162*標準曲線圖 方法學驗證 標準曲線及線性范圍含量測定黃體酮注射液的含量測定方法學驗證 儀器精密度 方法重復性 儀器穩(wěn)定性同一工藝下平行制備6份供試液測定值的RSD。 標準曲線及線性范圍x：Ciy：Ai/As 回收率試驗準確度發(fā)現(xiàn)量與加入量的接近程度R = 發(fā)現(xiàn)量/加入量1 耐受性同一溶液6次測定的RSD。供試品制備工藝的穩(wěn)定性方法

20、學驗證 準確度（回收率實驗）黃體酮約25mg乙醚50mL量瓶精密量取5.0mL揮散乙醚殘渣甲醇振蕩提取10 min/次/4 次離心15 min上清液內(nèi)標溶液5.0 mL甲醇25mL量瓶上述溶液 5 LHPLC（6份）（Ai1，Ais1）（Ai2，Ais2）（Ai3，Ais3）（Ai4，Ais4）（Ai5，Ais5）（Ai6，Ais6）方法學驗證 準確度（回收率實驗）上述溶液 5 LHPLC（Ai1，Ais1）（Ai2，Ais2）（Ai3，Ais3）（Ai4，Ais4）（Ai5，Ais5）（Ai6，Ais6）Ai/Ais = aC + b加入量mg測定量mg回收率（%）平均回收率RSD25.01

21、23.2595.025.1024.1096.024.8525.01100.698.63.5%25.6823.5695.624.1524.60101.924.7125.36102.6CV = C250含量測定黃體酮注射液的含量測定方法學驗證 儀器精密度 方法重復性 儀器穩(wěn)定性同一工藝下平行制備6份供試液測定值的RSD。 標準曲線及線性范圍x：Ciy：Ai/As 回收率試驗準確度發(fā)現(xiàn)量與加入量的接近程度R = 發(fā)現(xiàn)量/加入量1 耐受性同一溶液6次測定的RSD。供試品制備工藝的穩(wěn)定性1. 熟悉本類藥物的分類，掌握其結(jié)構(gòu)特征與分析方法的關(guān)系；2. 掌握某些官能團的呈色反應，了解其他鑒別方法；3. 掌握

22、本類藥物中其他甾體的檢查方法，了解其他特殊雜質(zhì)的檢查；第七章 復習內(nèi)容4. 掌握各種比色法的原理、方法及測定條件；5. 了解UV法和HPLC法在其含量測定中的應用。謝謝1四氮唑比色法可用于下列哪個藥物的含量測定（ ） A 可的松 B 睪丸素 C 雌二醇 D 炔雌醇 E 黃體酮2黃體酮在酸性溶液中可與下列哪些試劑反應呈色（ ）A 2，4-二硝基苯肼 B 三氯化鐵C 硫酸苯肼 D 異煙肼E 四氮唑鹽3Kober反應用于定量測定的藥物（ ）A 鏈霉素 B 雌激素 C 維生素B1 D 皮質(zhì)激素 E 維生素C4雌激素類藥物的鑒別可采用與（ ）作用生成偶氮染料A 四氮唑鹽 B 重氮苯磺酸鹽C 亞硝酸鐵氰化

23、鈉 D 重氮化偶氮試劑5符合四氮唑比色法測定甾體激素藥物的條件為（ ） A 在室溫或30恒溫條件下顯色 B 用避光容器并置于暗處顯色 C 空氣中氧對本法無影響 D 水量增大至5%以上，使呈色速度加快E 最常采用氫氧化四甲基胺為堿化試劑6. 甾體激素類藥物的結(jié)構(gòu)中能和四氮唑鹽發(fā)生顯色反應的基團 A. 酚羥基 B. 活潑次甲基 C. 甲酮基 D. C17 -醇酮基 E. 酮基7. 用異煙肼比色法測定甾體激素藥物含量時，其溶液的環(huán)境是 A強酸性 B中性 C強堿性 D弱堿性 E以上都不對問題812 A維生素B1 B醋酸地塞米松 C兩者皆是 D兩者皆不是 8. 異煙肼比色法 9. 硫色素反應 10. 紫外分光光度法 11. 羥肟酸鐵反應 12. 綠奎寧（Thaciaquin）反應BACDD13. 可用于氫化可的松鑒別的試劑有 A氨制硝酸銀 B異煙肼 C紅四氮唑 D硫酸 E重氮苯磺酸14. 可用于甾體激體類藥物的測定法有 A高效液相色譜法 B四氮唑鹽法 C紫外分光光度法 D異煙肼比色法 EKober反應比色法 15. 能與亞硝基鐵氰化鈉反應生成蘭紫色的藥物是 A雌二醇 B黃體酮 C醋酸可的松 D苯丙酸諾龍