第1部分環(huán)境監(jiān)測(cè)中的微生物學(xué)方法教學(xué)課件

1、第1部分環(huán)境監(jiān)測(cè)中的微生物學(xué)方法教學(xué)課件如何監(jiān)測(cè)？化學(xué)方法：快速、定性定量反映污染物濃度，但為瞬時(shí)值； 生物學(xué)方法：利用生物種類、數(shù)量的變化，生物學(xué)特性的改變來(lái)監(jiān)測(cè)污染物對(duì)環(huán)境的影響。可監(jiān)測(cè)到污染物對(duì)環(huán)境的綜合影響，但不易精確反映污染物的性質(zhì)、濃度和數(shù)量。一、空氣微生物來(lái)源空氣并非微生物的繁殖場(chǎng)所，空氣中缺乏水分和營(yíng)養(yǎng)，紫外線的照射對(duì)微生物也有致死作用。土壤中飛揚(yáng)起來(lái)的灰塵；水面吹起的水霧、人和動(dòng)物體表干燥脫落的物質(zhì)，微生物附著于這些物質(zhì)的微粒上隨氣流傳播。 第一節(jié) 空氣的衛(wèi)生學(xué)檢驗(yàn)微生物產(chǎn)生的孢子本身也可以飄浮到空氣中，形成 “氣溶膠”，借風(fēng)力傳播。空氣中的微生物中，真菌的孢子數(shù)量最多，細(xì)菌

2、較少。而且藻類、酵母菌、病毒都會(huì)存在于空氣中 。二、空氣微生物的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)目前，還無(wú)統(tǒng)一的關(guān)于空氣的衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)，一般以室內(nèi)1m3 空氣中細(xì)菌總數(shù)為501,000個(gè)以上作為空氣污染的指標(biāo)。病原菌在空氣中一般很易死亡，但結(jié)核菌、白喉?xiàng)U菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎雙球菌、炭疽桿菌、流感病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒等，也可以在空氣中存活一段時(shí)間。 塵埃多的地方，如畜舍、公共場(chǎng)所、醫(yī)院、城市街道的空氣中，微生物數(shù)量較多。高山、海洋、森林、積雪的山脈和高緯度地帶的空氣中，微生物較少。場(chǎng)所畜舍宿舍城市街道市區(qū)公園海洋上空北緯80微生物(12)106 2104 5103200120表2-1 不同場(chǎng)所上空微生物的數(shù)量（個(gè)/

3、m3 ）表2-2 以細(xì)菌總數(shù)評(píng)價(jià)空氣的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（個(gè)/m3 ）清潔程度細(xì)菌總數(shù)最清潔的空氣（有空調(diào)）12清潔空氣30普通空氣31125臨界環(huán)境150輕度污染301三、空氣的微生物監(jiān)測(cè)通常采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板計(jì)數(shù)法。我國(guó)檢測(cè)空氣微生物所用的培養(yǎng)皿直徑為d90mm，有用d100mm的。評(píng)價(jià)空氣的清潔程度，需要測(cè)定空氣中的微生物數(shù)量和空氣污染微生物。測(cè)定的細(xì)菌指標(biāo)有細(xì)菌總數(shù)和綠色鏈球菌，在必要時(shí)則測(cè)病原微生物。 (一)空氣微生物的測(cè)定方法 1固體法固體法有平皿落菌法(沉降平板法)、撞擊法(有縫隙采樣器、篩板采樣器、針孔采樣器)和過(guò)濾法。(1)平皿落菌法：將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基融化倒人d90mm無(wú)菌平皿中制成平板

4、。將它放在待測(cè)點(diǎn)(通常設(shè)5個(gè)測(cè)點(diǎn))，打開皿蓋暴露于空氣510min，以待空氣微生物降落在平板表面上，蓋好皿蓋，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后取出計(jì)菌落數(shù)，即為落菌數(shù)?？赏ㄟ^(guò)前蘇聯(lián)奧梅梁斯基公式換算出浮游細(xì)菌數(shù)。奧氏認(rèn)為：5 min內(nèi)落在面積100mm2營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上的細(xì)菌數(shù)和10L空氣中所含的細(xì)菌數(shù)相同。奧氏公式： 式中：C空氣細(xì)菌數(shù)； A捕集面積，cm2 ； t 暴露時(shí)間，min； N菌落數(shù)，個(gè)。5t100A100010 NC =簡(jiǎn)化后的奧氏公式：經(jīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，用奧式公式計(jì)算的浮游細(xì)菌數(shù)比實(shí)測(cè)的浮游細(xì)菌少。此公式?jīng)]有考慮塵埃粒子大小、數(shù)量、氣流情況、人員密度和活動(dòng)情況。 C = 100050NAt(

5、2)撞擊法：以縫隙采樣器為例，用吸風(fēng)機(jī)或真空泵將含菌空氣以一定流速穿過(guò)狹縫(狹縫寬有0.15 mm、0.33 mm和1 mm三種)而被抽吸到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上。狹縫長(zhǎng)度為平皿的半徑，平板與縫的間隙有2mm，平板以一定的轉(zhuǎn)速(1 rmin、5-60rmin、60rmin)旋轉(zhuǎn)。通常平板轉(zhuǎn)動(dòng)一周，取出置于37恒溫箱中培養(yǎng)48h，根據(jù)空氣中微生物的密度可調(diào)節(jié)平板轉(zhuǎn)動(dòng)的速度。采集含菌高的空氣樣品時(shí)，平板轉(zhuǎn)動(dòng)的速度要比含菌量低的空氣樣品的轉(zhuǎn)速快。根據(jù)取樣時(shí)間和空氣流量算出單位空氣中的含菌量。采樣器的規(guī)格各國(guó)不一，可按說(shuō)明書操作。撞擊法檢測(cè)空氣中微生物數(shù)量培養(yǎng)前培養(yǎng)后2 液體法液體法用于測(cè)定空氣中的浮游

6、微生物，主要是浮游細(xì)菌。該法將一定體積的含菌空氣通入無(wú)菌蒸餾水或無(wú)菌液體培養(yǎng)基中，依靠氣流的洗滌和沖擊使微生物均勻分布在介質(zhì)中，然后取一定量的菌液涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，或取一定量的菌液于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，倒入15-18ml融化(45)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，混勻，待冷凝制成平板，置于37恒溫箱中培養(yǎng)48h，取出計(jì)菌落數(shù)。再以菌液體積和通入的空氣量計(jì)算出單位體積空氣中的細(xì)菌數(shù)。例如：將10m3含菌空氣通入100mL的無(wú)菌水中，使10m3空氣中的微生物全部截留在100mL水中。然后取0.1 mL菌液涂布于平板上，若長(zhǎng)出100個(gè)菌落，10mL水中共含菌10,000個(gè)，則10m3空氣含有10,000個(gè)。1m3空

7、氣含有1,000個(gè) 。(二)空氣微生物的檢測(cè)點(diǎn)數(shù)空氣微生物的測(cè)點(diǎn)數(shù)越多越準(zhǔn)確，為照顧到工作方便，又相對(duì)準(zhǔn)確，以2030個(gè)測(cè)點(diǎn)數(shù)為宜，最少測(cè)點(diǎn)數(shù)為56，見表。 時(shí)間 標(biāo)準(zhǔn) 名稱最少測(cè)點(diǎn)數(shù)建議測(cè)點(diǎn)數(shù) 點(diǎn)距（m）每點(diǎn)測(cè)定次數(shù) 1987 JIS B 9920潔凈室中浮游粒子測(cè)定方法和潔凈室的評(píng)價(jià)方法 6 20，30原則上3空間太大 可放寬 3 1987 空氣清凈協(xié) 會(huì)標(biāo)準(zhǔn)潔凈室性能評(píng)價(jià)指南 5 20, 30原則上3表2.1 日本有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)點(diǎn)數(shù)的規(guī)定 摘自許鐘麟空氣潔凈技術(shù)原理P522同濟(jì)大學(xué)出版社，1998 表2.2 按美國(guó)聯(lián)邦標(biāo)準(zhǔn)209E方法計(jì)算的必要測(cè)點(diǎn)數(shù) 潔 凈 度進(jìn)風(fēng)面積(單向流)或室面積(亂

8、流)m2100級(jí)及高于100級(jí) 1000級(jí)10000級(jí) 100000級(jí) 10 10 20 40 80 100 200 400 23 4 8 16 32 40 80 160 2 3 6 13 25 32 63 126 2 2 2 4 8 10 20 40 2 2 2 2 2 3 6 13表2.3 浮游菌最小采樣量 浮游菌上限濃度個(gè) m-2 min-1 計(jì)算最小采樣量m3 10 5 1 0.5 0.1 0.05 0.3 0.6 3 6 30 60表2.4 落菌法測(cè)細(xì)菌所需要的最少培養(yǎng)皿數(shù)(沉降0.5h) 含塵濃度最大值 需要d90mm培養(yǎng)皿數(shù) 0.35 3.5 35 350 3 50035 000

9、 40 13 4 2 1第二節(jié) 水質(zhì)的細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)一、細(xì)菌總數(shù) 是將定量水樣（原水樣或經(jīng)一定稀釋后的水樣1mL）接種于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基平板上，于37C培養(yǎng)24hr后觀察結(jié)果，計(jì)算細(xì)菌菌落數(shù)，最后算出原水樣每毫升的細(xì)菌總數(shù)。 具有相對(duì)的衛(wèi)生學(xué)意義，菌數(shù)越高，反映出水體受有機(jī)物污染或糞便污染越重，病原菌污染的可能性亦大。二、糞便污染指示菌人畜糞便中常常帶有大量的微生物，其中有些屬于正常的、對(duì)人體無(wú)害的腸道微生物，有些則是病原微生物，進(jìn)入水體后，可造成水體的污染，從而引發(fā)各種腸道疾病。因此，水質(zhì)的衛(wèi)生學(xué)檢驗(yàn)，對(duì)于保護(hù)人群健康，具有重要意義。致病菌數(shù)量少，檢測(cè)比較復(fù)雜，故選用間接指標(biāo)即糞便污染的指

10、示菌為代表。常用腸道正常細(xì)菌在水中的存在及數(shù)量情況作為糞便污染的指示。健康成人糞便內(nèi)的微生物數(shù)量微生物名稱每克糞便中平均生長(zhǎng)菌落數(shù)主要微生物擬桿菌屬1010乳酸桿菌屬109大腸埃希氏菌屬108糞鏈球菌108次要的微生物檸檬酸桿菌屬105-106梭菌屬105-106葡萄球菌屬105-106克雷伯氏菌屬104-105腸桿菌屬104-105芽孢桿菌屬酵母屬104-105霉菌104-105較少的微生物變形菌屬102-103銅綠假單胞菌屬102-103（一）指示菌的理想條件大量存在于人的糞便中，且數(shù)量比病原菌多；受糞便污染的水中易檢測(cè)出該指示菌，未受污染的水中無(wú)此菌；在水體中不會(huì)自行繁殖；存活時(shí)間略長(zhǎng)于

11、致病菌，對(duì)消毒劑的抵抗略強(qiáng)于致病菌；檢出及鑒定方法比較簡(jiǎn)易迅速；適用于各種水體。（二）適宜的指示菌總大腸菌群，糞大腸菌群、大腸桿菌埃希氏菌（大腸桿菌）、克雷伯氏菌屬。三、大腸桿菌（一）特征定義：一群需氧或兼性厭氧性的G-無(wú)芽孢桿菌，能在37C培養(yǎng)24hr使乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣，包括了糞便內(nèi)全部兼性需氧性的G-桿菌，以大腸桿菌埃希氏菌屬為主，尚有檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬等。成人每日糞便中排出的菌數(shù)可達(dá)(5100)106個(gè)。（二）大腸菌群的測(cè)定常用多管發(fā)酵法與濾膜法：發(fā)酵法： 又稱多管發(fā)酵法或三步發(fā)酵法初發(fā)酵（推測(cè)試驗(yàn)）：將不同稀釋度的水樣，分別接種于含有乳糖等糖類的培養(yǎng)液中（3倍或1倍乳

12、糖液），經(jīng)37C培養(yǎng)24hr，觀察產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況，以初步判斷是否有大腸菌群存在。2）平皿分離（證實(shí)試驗(yàn)）水中除大腸菌群外，尚有其它細(xì)菌可能引起糖類發(fā)酵，因此需要進(jìn)一步證實(shí)。將初發(fā)酵管中已發(fā)酵的菌液接種于伊紅美蘭培養(yǎng)基或遠(yuǎn)藤氏培養(yǎng)基上，37C培養(yǎng)24hr，根據(jù)菌落特征，挑取可能為大腸菌群的菌落制片，經(jīng)革蘭氏染色，進(jìn)一步證實(shí)是否為大腸菌群。3） 復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)（完成試驗(yàn)）將上述可能為大腸菌群的菌落再次轉(zhuǎn)接入1倍乳糖培養(yǎng)液中，經(jīng)37C培養(yǎng)24hr，產(chǎn)酸產(chǎn)氣者即最后確證為存在大腸菌群。產(chǎn)酸、產(chǎn)氣分別記為陽(yáng)性反應(yīng)，不產(chǎn)酸、產(chǎn)氣則記為陰性反應(yīng)；根據(jù)陽(yáng)性管數(shù)量，查表求得水體大腸菌群的數(shù)量。2 濾膜法發(fā)酵法全部檢測(cè)需要的時(shí)間較長(zhǎng)，為縮短時(shí)間，可以采用濾膜法，其步驟為：1）水樣過(guò)濾：選用具有微孔的濾膜，滅菌后通過(guò)抽濾一定量的待測(cè)水樣，將水中的細(xì)菌截留在無(wú)菌濾膜上；2）培養(yǎng)：將濾膜有菌面朝上貼于特定的固體培養(yǎng)基平板上（伊紅美蘭培養(yǎng)基或遠(yuǎn)藤氏培養(yǎng)基），經(jīng)37C培養(yǎng)16hr18hr；3）結(jié)果觀察： 培養(yǎng)16hr18hr后，挑選深紅色或紫紅色、不帶或帶有金屬光澤的菌落，或者淡紅色、中心色較深的菌落進(jìn)行革蘭氏染色觀察，確定大腸菌群細(xì)菌。 G- ：接入乳糖培養(yǎng)液中，復(fù)發(fā)酵； G+：陰性結(jié)果。經(jīng)染色證實(shí)為G-無(wú)芽孢桿菌者，再接入乳糖蛋白胨半固體培養(yǎng)基中，37C培養(yǎng)68hr，產(chǎn)氣