分子生物學(xué)-PPT課件

1、醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) 課程主要內(nèi)容第一章 生物大分子的分離純化第二章 分子生物學(xué)常用技術(shù)（PCR、核酸 分子雜交、基因測(cè)序、生物芯片等）第三章 基因工程第四章 基因敲除與RNA干擾 第五章 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)組學(xué) 蛋白質(zhì)組（proteome）是指特定細(xì)胞、組織乃至機(jī)體作為一個(gè)生命單元中所有蛋白質(zhì)的集合，即某一時(shí)段所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。 蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics） 是研究蛋白質(zhì)組的科學(xué)，也即是研究生物體全套蛋白質(zhì)的組成、結(jié)構(gòu)與功能的科學(xué)。 蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics） 闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達(dá)模式與功能模式從整體的角度分析、鑒定細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)的組成、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、表達(dá)水

2、平與修飾狀態(tài)了解蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)與大分子之間的相互作用與聯(lián)系,揭示蛋白質(zhì)的功能與細(xì)胞生命活動(dòng)的規(guī)律 蛋白質(zhì)組研究的必要性 蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要執(zhí)行者，蛋白質(zhì)與基因之間在很大程度上是一種非線性的關(guān)系，蛋白質(zhì)在發(fā)揮功能的時(shí)候有其自身的特征和規(guī)律，這是在基因水平上難以預(yù)測(cè)的。 蛋白質(zhì)的數(shù)量比基因的數(shù)量多。 基因組是靜態(tài)的，而蛋白質(zhì)組是動(dòng)態(tài)的。 廣泛的修飾加工過(guò)程，這些修飾加工過(guò)程是蛋白質(zhì)功能發(fā)揮的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，也是蛋白質(zhì)高度多樣性的重要原因。 生物超分子體系是蛋白質(zhì)功能發(fā)揮的更高級(jí)的組織形式 任一層次的生命活動(dòng)都不是單個(gè)蛋白質(zhì)分子的獨(dú)立行為或功能的累加，蛋白質(zhì)之間及與其它分子之間存在廣泛的相互作用，

3、形成一個(gè)網(wǎng)絡(luò)狀的非線性復(fù)雜系統(tǒng)，孤立地研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能無(wú)法從整體上系統(tǒng)而透徹地闡釋生命活動(dòng)的規(guī)律。 蛋白質(zhì)組學(xué)的最終目的是全方位系統(tǒng)地解析蛋白質(zhì)的功能，而具體的研究過(guò)程只能分解為不同的層面相對(duì)獨(dú)立地進(jìn)行，因此這些相對(duì)獨(dú)立的蛋白質(zhì)功能信息必須有機(jī)地整合在一起，才能描繪出蛋白質(zhì)功能的全景圖。 DNAmRNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯基因蛋白質(zhì)細(xì)胞特異性基因表達(dá)生理狀態(tài)蛋白質(zhì)相互作用溫度應(yīng)激狀態(tài)培養(yǎng)條件藥物作用數(shù)量有限結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定復(fù)雜性多變性直接反應(yīng)生命現(xiàn)象復(fù)雜的調(diào)控遺傳信息的傳遞和表達(dá)蛋白質(zhì)組研究技術(shù)蛋白質(zhì)樣品制備：包括各種組織細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)沉淀、亞細(xì)胞組分分離及蛋白質(zhì)分步提取的方法；蛋白質(zhì)分離：2-D

4、E、雙向高效液相色譜、毛細(xì)管電泳等；圖象分析；蛋白質(zhì)鑒定：包括氨基酸組成及序列分析，用于肽質(zhì)量指紋圖、肽序列標(biāo)簽鑒定及相對(duì)分子量精確測(cè)定的質(zhì)譜技術(shù)（MS）或MS聯(lián)用技術(shù)、蛋白芯片技術(shù)等；蛋白質(zhì)與核酸的相互作用：凝膠阻滯分析，染色體免疫沉淀，DNAaseI足紋分析，核酸-蛋白質(zhì)雜交實(shí)驗(yàn)；蛋白質(zhì)之間的相互作用：如酵母雙雜交技術(shù)、酵母三雜交技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)及共沉淀技術(shù)等；蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位：熒光蛋白融合技術(shù)及免疫熒光技術(shù)等；蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)測(cè)定：X-射線晶體衍射及核磁共振波譜技術(shù)；蛋白質(zhì)的功能研究：不同的生物學(xué)功能有不同的研究技術(shù)與方法。另外還包括高通量實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)與大規(guī)模樣品處理機(jī)器人等，以實(shí)現(xiàn)大

5、規(guī)模高通量蛋白質(zhì)組研究。 蛋白質(zhì)組研究技術(shù) 根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度、分子大小及形狀、電離性質(zhì)、生物學(xué)功能的差異進(jìn)行： 1.根據(jù)等電點(diǎn): 等電聚焦 2.根據(jù)分子量: 透析和超濾, 平衡離心, 凝膠過(guò)濾 一、蛋白質(zhì)樣品的制備3.根據(jù)電荷: 毛細(xì)管電泳, 聚丙烯酰胺凝膠電泳 4.根據(jù)蛋白質(zhì)的親和能力:親和層析二維凝膠電泳（2-DE)技術(shù)目前蛋白質(zhì)組研究中最有效的分析鑒定技術(shù)之一由兩相組成： 第一相：等電聚焦凝膠電泳 (根據(jù)蛋白質(zhì)電荷差異) 第二相：SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 (根據(jù)蛋白質(zhì)分子量差異)+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH

6、 7.5pH 102-D Electrophoresis等電聚焦過(guò)程第一向等電聚焦酸堿IPG膠條pH梯度低分子量高分子量第二向SDS雙向凝膠電泳示意圖2-DE分析的基本步驟蛋白質(zhì)溶解變性還原去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)利用不同pK固定化電解質(zhì)配置不同pH范圍的凝膠利用軟件設(shè)計(jì)配置 第一相電泳(IPGIFE)平衡第二相電泳(SDSPAGE)考馬斯亮藍(lán)染色銀染色銅染色樣品制備IPG膠制備雙相電泳染色2-DE 技術(shù) 通過(guò)2-DE得到的蛋白質(zhì)分離圖譜，需要經(jīng)過(guò)攝像或掃描轉(zhuǎn)換為以像素為基礎(chǔ)的、具有不同灰度強(qiáng)弱和一定邊界方向的斑點(diǎn)電腦信號(hào)。 圖像分析技術(shù)2-DE獲得的蛋白質(zhì)圖譜原理 樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間的質(zhì)

7、量和電荷比值（m/e）的差異確定分子量。應(yīng)用 蛋白質(zhì)的序列分析 研究蛋白質(zhì)的修飾二、蛋白質(zhì)的鑒定質(zhì)譜技術(shù)（二） 其它蛋白質(zhì)鑒定方法Edman降解法測(cè)定蛋白質(zhì)多肽的排列順序核磁共振（NMR）、熒光光譜法測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)X射線衍射分析法、小角中子衍射法測(cè)定晶體蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)等第三節(jié)蛋白質(zhì)相互作用的研究一) 蛋白質(zhì)核酸二) 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)相互作用的研究一）蛋白質(zhì)-核酸間相互作用的研究 1、凝膠阻滯分析 2、染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù) 3、DNase足紋分析 4、核酸-蛋白質(zhì)雜交實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)可以與末端標(biāo)記的核酸探針特異性結(jié)合，所形成的復(fù)合物電泳時(shí)在凝膠中的泳動(dòng)速度比未與蛋白結(jié)合的游離探針慢，即

8、表現(xiàn)為相對(duì)滯后。該實(shí)驗(yàn)可以評(píng)價(jià)蛋白與核酸結(jié)合的特異性-體外1、凝膠阻滯分析（gel retardation assay） 電泳遷移率變動(dòng)分析（Electrophoretic mobility shift assays，EMSA），凝膠遷移分析（gel shift assay） 2、染色質(zhì)免疫沉淀（Chromatin immunoprecipitation，ChIP） 主要用來(lái)研究細(xì)胞內(nèi)基因組DNA的某一區(qū)域與特定蛋白質(zhì)（包括組蛋白如H3和非組蛋白如各種轉(zhuǎn)錄因子）相互作用的技術(shù)。 EMSA可用于研究DNA與蛋白質(zhì)的體外結(jié)合，但這并不能說(shuō)明這種結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)也是同樣真實(shí)存在的。而ChIP則可以用來(lái)證

9、實(shí)DNA與蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的特異性結(jié)合，因此，在研究DNA與蛋白質(zhì)的相互作用時(shí)，EMSA和ChIP往往聯(lián)合使用，互為佐證。化學(xué)交聯(lián)試劑使非組蛋白與所結(jié)合的DNA交聯(lián)固定 活細(xì)胞狀態(tài) 裂解細(xì)胞，釋放染色質(zhì) 超聲或酶切處理，染色質(zhì)DNA片段一般為200bp1000bp 特異性抗體沉淀蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物 解交聯(lián)釋放出DNA并純化 PCR等技術(shù)分析DNA片段 3、DNase足紋分析目前廣泛用于蛋白質(zhì)精確結(jié)合位點(diǎn)的研究方法。原理： DNase可以隨機(jī)水解核苷酸中的磷酸二酯鍵，將DNA切成單核苷酸，而結(jié)合有蛋白質(zhì)的DNA免于DNase的水解。 DNase足紋分析原理示意圖4、核酸-蛋白質(zhì)雜交實(shí)驗(yàn)TBE緩沖

10、液中DNA蛋白質(zhì)雜交放射自顯影 用于鑒定蛋白質(zhì)與DNA的特異性結(jié)合和確定結(jié)合蛋白質(zhì)的分子量。 基本步驟：蛋白質(zhì)SDS轉(zhuǎn)移至NC膜或Nylon膜緩慢復(fù)性、封閉、預(yù)雜交加入同位素標(biāo)記的DNA片段作探針多次洗膜（一）蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的形式 1.蛋白質(zhì)亞基的聚合 2.蛋白分子雜交 3.分子識(shí)別 4.分子的自我裝配 5.多酶復(fù)合體二）蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（二）蛋白質(zhì)之間的相互作用力氫鍵范德華力疏水鍵離子鍵二）蛋白質(zhì)之間的相互作用 1.酵母雙雜交系統(tǒng) 2.噬菌體展示技術(shù) 3.生物傳感芯片質(zhì)譜 4.定點(diǎn)誘變技術(shù) 1.酵母雙雜交系統(tǒng) （yeast two-hybrid system） 在真核生物的轉(zhuǎn)錄

11、起始階段，需要有轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。酵母蛋白GAL是一典型的真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活因子，其轉(zhuǎn)錄激活作用是由功能相對(duì)獨(dú)立的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（binding domain，BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activation domain，AD）共同完成的， 這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)連接建立起特有的空間聯(lián)系是導(dǎo)致結(jié)合和激活發(fā)生的關(guān)鍵。 1.酵母雙雜交系統(tǒng) DNA-BD具有與報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)特異結(jié)合的功能，DNA-AD則具有活化轉(zhuǎn)錄的功能。報(bào)告基因與BD融合的蛋白表達(dá)載體，表達(dá)的蛋白稱(chēng)誘餌蛋白（bait protein）；與AD融合的蛋白表達(dá)載體，表達(dá)的蛋白稱(chēng)捕獲蛋白或獵物蛋白（prey protein）；

12、帶報(bào)告基因的宿主細(xì)胞。 一、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) DNA-BD具有與報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)特異結(jié)合的功能，DNA-AD則具有活化轉(zhuǎn)錄的功能。 若X和Y沒(méi)有相互作用，則單獨(dú)不能激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄；若X與Y之間有且發(fā)生相互作用時(shí)，就可以將BD和AD在空間結(jié)構(gòu)上聯(lián)結(jié)、靠近形成一個(gè)有效的轉(zhuǎn)錄激活子而與報(bào)告基因的上游激活序列（upstream activation sequence，UAS）結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮激活轉(zhuǎn)錄的功能，使受調(diào)控的下游報(bào)告基因得到表達(dá)。 UASLacZ/His報(bào)告基因表達(dá)X外源基因 BDGAL4 DNA-BD外源基因GAL4 ADADDNA-BD 質(zhì)粒AD質(zhì)粒表達(dá)表達(dá)融合蛋白融合蛋白酵母雙雜交原理圖

13、Y BDXYADYADRNA多聚酶 BDXDNA-BD和DNA-AD分開(kāi)時(shí)不能激活轉(zhuǎn)錄，只有當(dāng)兩者在空間上接近時(shí)，才能呈現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子的活性。只有當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)X與蛋白質(zhì)Y間發(fā)生相互作用時(shí)，才能激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄，而當(dāng)兩者單獨(dú)作用時(shí)均無(wú)此功能 。第二章分子生物學(xué)常用技術(shù)核酸 (DNA, RNA) 堿基互補(bǔ)配對(duì)A=T, CG, A=U核酸變性與復(fù)性核酸合成 DNA復(fù)制（DNADNA）， 逆轉(zhuǎn) 錄（RNADNA）； 轉(zhuǎn) 錄（DNARNA）， RNA復(fù)制（RNARNA）； DNA復(fù)制 (replication) 由親代DNA合成兩個(gè)相同的子代 DNA的過(guò)程（DNA指導(dǎo)的DNA生物合成）。 半保留復(fù)制生物體內(nèi)D

14、NA復(fù)制非常復(fù)雜 按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA 的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。半保留復(fù)制的意義 遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對(duì)的。 DNA的酶促合成：模板 (template) : 解開(kāi)成單鏈的DNA分子；底物（substrate): 4種脫氧核苷三磷酸（dATP，dGTP，dCTP，dTTP）；DNA聚合酶 (polymerase) : 依賴(lài)DNA的DNA聚合酶（DDDP），簡(jiǎn)寫(xiě)為 DNA-pol ；如何獲得單鏈DNA模板？多種蛋白質(zhì)參與（以大腸桿菌為例）解鏈酶（helicase）；單鏈結(jié)合蛋白（singlestrand D

15、NA binding protein，SSB）；DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶（ DNA topoisomerase ）解鏈酶（ helicase ) 利用 ATP 供能，作用于氫鍵， 使DNA雙鏈解開(kāi)成為兩條單鏈。單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB） SSBDna BDna C解鏈方向DNA解鏈過(guò)程形成超螺旋拓?fù)洚悩?gòu)酶解除超螺旋DNA線性雙螺旋從中間解鏈上下都過(guò)度擰緊超螺旋進(jìn)一步解鏈就更加困難拓?fù)洚悩?gòu)酶 I切開(kāi)超螺旋的單鏈，再連接成雙鏈。無(wú)需ATP。拓?fù)洚悩?gòu)酶 II切開(kāi)超螺旋的雙鏈，解除超螺旋，再連接成雙鏈。參與復(fù)制全過(guò)程剪切-旋轉(zhuǎn)-連接DNA聚合酶DNA生物合成 大腸桿菌DNA聚合酶 （ E . Coli DN

16、A polymerase ）和Klenow片段 大腸桿菌DNA聚合酶復(fù)制中DNA鏈延伸 大腸桿菌DNA聚合酶323個(gè)氨基酸小片段5 核酸外切酶活性大片段 / Klenow片段 604個(gè)氨基酸木瓜蛋白酶Klenow片段是實(shí)驗(yàn)室合成DNA，進(jìn)行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。 N 端C 端FG5 DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性 DNA聚合酶（DNA-pol I） DNA聚合酶 大腸桿菌DNA聚合酶是單一多肽鏈的多功能酶，分子量為103kD，它具有3種酶活性： 5 3 DNA聚合酶活性。 3 5 核酸外切酶活性。 5 3 核酸外切酶活性。（DNA合成）（校對(duì)）（切除RNA引物和突變序列） DNA

17、聚合酶催化的反應(yīng) 5 至 3 的聚合活性 dTTP3(dNMP) n + dNTP (dNMP) n+1 + ppi3 A T G C A A T T G C 5 | | | |5 T A C G ppi T依賴(lài)DNA的DNA聚合酶（DNA-dependent DNA polymerase, DDDP） 5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 53 5 外切酶活性 5 3 外切酶活性?切除引物或突變的DNA片段辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對(duì)，將其水解校對(duì) 核酸外切酶活性 復(fù)制的保真性

18、 ( fidelity ) DNA聚合酶對(duì)模板的依賴(lài)性，是子鏈與母鏈能準(zhǔn)確配對(duì)的保證。 復(fù)制過(guò)程中，復(fù)制的保真性至少依賴(lài)三種機(jī)制：1、遵守嚴(yán)格的堿基配對(duì)規(guī)律2、聚合酶在復(fù)制延長(zhǎng)時(shí)對(duì)堿基的選擇功能3、復(fù)制出錯(cuò)時(shí)DNA-pol的及時(shí)校讀功能DNA生物合成條件：?jiǎn)捂淒NA模板 (template) ； 底物（substrate) :4種dNTPs；依賴(lài)DNA的聚合酶 (DDDP)； 引物（primer）DNA復(fù)制中為何需RNA引物？DNA聚合酶沒(méi)有從頭催化2個(gè)游離的脫氧核苷三磷酸聚合的能力；只能在3-OH端與按堿基配對(duì)的dNTP進(jìn)行反應(yīng)，生成磷酸二酯鍵；引物提供游離的3-OH末端；5 A-G 3 |

19、 | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5引物酶 ( primase ) 在模板的復(fù)制起始部位催化NTP的聚合, 形成短片段的RNA，即引物（primer）。 依賴(lài)DNA的RNA聚合酶DDRP半不連續(xù)復(fù)制（semidiscontinuous replication）一條鏈合成是連續(xù)的（前導(dǎo)鏈）， 一條鏈合成是不連續(xù)的（后隨鏈）；DNA聚合酶： 5 3 聚合酶活性聚合反應(yīng)的方向性: 5 3 DNA連接酶 (DNA ligase)崗崎片段的連接 連接DNA鏈 3-OH末端和相鄰DNA鏈5- P末端，使二者生成磷酸酯鍵，從而把兩段相

20、鄰的DNA鏈連接成完整的鏈。 一、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR) 在體外由引物介導(dǎo)的DNA序列酶促合成反應(yīng)，即體外DNA擴(kuò)增技術(shù)。DNA聚合酶（DNA dependent DNA polymerase，DDDP） 穆利斯 K. Mullis1945-，美國(guó) 1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)PCR酶促DNA合成 DNA聚合酶（DNA dependent DNA polymerase，DDDP） 合成DNA新鏈DNA模板：?jiǎn)捂淒NA引物：提供3OH末端底物：四種dNTP基本原理： 類(lèi)似體內(nèi)DNA復(fù)制(合成雙鏈DNA）- DNA聚合酶 核酸的熱變性和退火 變性-

21、 獲單鏈模板 退火- 單鏈模板與引物結(jié)合 延伸DNA新鏈合成 指數(shù)擴(kuò)增循環(huán)多次耐熱的DDDPPCR 循環(huán) 第一步 加熱變性靶序列靶序列PCR 循環(huán)- 第二步引物與靶序列退火靶序列靶序列Primer 1Primer 2BiotinBiotin53553533PCR 循環(huán) - 第三步 - 引物延伸靶序列靶序列Primer 1Primer 2BiotinBiotin53553533Taq DNAPolymerase第1個(gè) PCR 循環(huán)完成后 得到兩個(gè)拷貝的靶序列靶序列 靶序列BiotinBiotin30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Ta

22、rget122438416532664201,048,576301,073,741,7661 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Amplicon PCR的主要用途 （一）目的基因的克隆，序列分析（二）基因的體外突變，多態(tài)性研究（三）DNA的微量分析 PCR擴(kuò)增條件 94, 300S （預(yù)變性） 94, 30S（變性） 25 40cycles 5565, 30S

23、72, 30120S （退火，與引物有關(guān)） 72, 10min （延伸，與擴(kuò)增長(zhǎng)度有關(guān)） 45 65 209bp退火溫度的選擇 梯度PCR(多溫控) PCR反應(yīng)的影響因素： 模板 (DNA) 聚合酶（耐熱的Taq DNA聚合酶） dNTPs（dATP，dCTP, dGTP，dTTP) 緩沖液 引物(DNA引物，10M) 與待擴(kuò)增目的基因兩端序列互補(bǔ)的寡核苷酸鏈，決定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和長(zhǎng)度。 DNA聚合酶 耐高溫保真性（防止錯(cuò)配）活性（Mg2+)（35外切酶活性） Taq DNA聚合酶 (無(wú)35外切酶活性，35輪0.25%錯(cuò)配，與原始模板有差別) Ex Taq DNA聚合酶，Tth DNA

24、聚合酶，Pfu DNA聚合酶等 TaqDNA聚合酶活性依賴(lài)Mg2+(激動(dòng)劑) 不同的酶需不同濃度的Mg2+ Taq：Mg2+對(duì)反應(yīng)影響很大，0.5mM-1.5mM 終濃度 pfu：Mg2+ 2-3mM，dNTP、primer用量約增加一倍 外界影響： EDTA鰲合Mg2+ 選較低濃度TE(10mM Tris,1mMEDTA)； DNA模板、引物和dNTP的磷酸基團(tuán)均可與Mg2+ 結(jié)合，降低Mg2+有效濃度。 如果擴(kuò)增產(chǎn)物或效率不理想，要注意調(diào)整合適的 Mg2+濃度 Mg2+ 質(zhì)粒DNA 噬菌體DNA 染色體DNA cDNA 較小 較大 通常單拷貝 較小 變性較易 變性較難 非常大，變性難 變性

25、較易 模板用量 Plasmid:lng，Chromosome:300-500ng, cDNA:0.5-1l 注意： 模板質(zhì)量很關(guān)鍵，防止交叉污染模板DNA dNTP 四種脫氧核苷酸，濃度必須一致 終濃度：50-200 M 注意：不穩(wěn)定，保存時(shí)間長(zhǎng)會(huì)失效； 與待擴(kuò)增目的DNA兩端序列互補(bǔ)的寡核苷酸鏈，決定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和長(zhǎng)度。 DNA引物(primer)：解決方案: 避免反復(fù)凍融，分裝凍存；引物設(shè)計(jì)一般遵循的原則 長(zhǎng)度：1530bp堿基分布的隨機(jī)性 G+C含量在40%60%, Tm=4(G+C)+2(A+T)兩引物間避免互補(bǔ)，以防形成引物二聚體引物自身也不應(yīng)互補(bǔ)，以免引起自身折疊引物的3端：不能修飾，不應(yīng)錯(cuò)配引物的5端：可加修飾位點(diǎn)特異性：與非特異靶區(qū)之間的同源性不能超過(guò)70% 或有連續(xù)8個(gè)互補(bǔ)堿基同源 人工合成短寡核苷酸片段，Tm=55-80， 兩條引物Tm值要相近，最好一致。 上游Primer與下游Primer 正向/反向引物 一條鏈為設(shè)計(jì)模板，5端相同， 3端互補(bǔ)引物設(shè)計(jì)（一） rat beta-nerve growth factor sequence 5-301 gttctacact ctgatcacag cgtttttgat cggcgtacag gcagaaccgt acacagagat361 caatgtccca g