醫(yī)學(xué)課件結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢查的臨床意義

1、主要內(nèi)容 一、結(jié)核桿菌的病原學(xué)基礎(chǔ) 二、結(jié)合分支桿菌全球的流行情況三、結(jié)核桿菌的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法及臨床應(yīng)用一、結(jié)核病的病原學(xué)基礎(chǔ)結(jié)核桿菌屬：一類細(xì)長(zhǎng)略帶彎曲，有時(shí)呈分枝狀的桿菌，本屬細(xì)菌多具有抗酸性，又稱抗酸桿菌（acid-fast bacillus），細(xì)菌體內(nèi)含有分枝菌酸，細(xì)胞壁含有大量脂類，這與分枝桿菌的染色性、抵抗力和致病性等密切相關(guān)。本屬細(xì)菌已經(jīng)被鑒定的有70多種，可分為三大類：結(jié)核分枝桿菌、非典型分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌；按生長(zhǎng)速度可分為三類，即緩慢生長(zhǎng)菌、迅速生長(zhǎng)菌和不能培養(yǎng)菌三種類型結(jié)核分枝桿菌群結(jié)核分枝桿菌，是人和動(dòng)物結(jié)核病的病原體，包括人結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium

2、tuberculosis）、牛分支桿菌（M.bovis）、非洲分支桿菌（M.africanum）和田鼠分枝桿菌（M.microti），前三種對(duì)人類治病，其中人型結(jié)核分枝桿菌感染發(fā)病率最高。結(jié)核分枝桿菌屬于緩慢生長(zhǎng)分支桿菌及時(shí)準(zhǔn)確的診斷結(jié)核病，有效地控制傳染源，對(duì)預(yù)防結(jié)核病至關(guān)重要。結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢查細(xì)菌學(xué)檢查免疫學(xué)檢查分子生物學(xué)檢查涂片染色鏡檢分枝桿菌分離培養(yǎng)分支桿菌藥敏試驗(yàn)分枝桿菌菌種鑒定最原始最基礎(chǔ)的檢測(cè)方法涂片染色鏡檢抗酸染色的原理分枝桿菌的細(xì)胞壁內(nèi)含有大量的脂質(zhì)。包圍在肽聚糖的外面，所以分支桿菌一般不易著色，需要經(jīng)過(guò)加熱或是延長(zhǎng)染色時(shí)間來(lái)促使其著色。但分支桿菌中的分支菌酸與染料結(jié)合后，就

3、很難被酸性脫色劑脫色，故名抗酸染色。涂片染色鏡檢臨床價(jià)值 適用于多種標(biāo)本； 操作簡(jiǎn)便，價(jià)格低廉。涂片鏡檢的臨床應(yīng)用 一、確診涂陽(yáng)結(jié)核病及開(kāi)放性結(jié)核2份痰標(biāo)本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽(yáng)性；1份痰標(biāo)本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽(yáng)性+影像學(xué)檢查符合活動(dòng)性肺結(jié)核表現(xiàn)。涂片鏡檢的臨床應(yīng)用二、肺結(jié)核治療評(píng)估的主要依據(jù)之一治愈：涂陽(yáng)肺結(jié)核患者完成規(guī)定療程，連續(xù)2次涂片結(jié)果陰性，其中1次是治療末的涂片。治療失?。盒峦筷?yáng)患者治療第5個(gè)月末或療程結(jié)束時(shí)，痰涂片檢查陽(yáng)性，涂陰肺結(jié)核患者治療過(guò)程中任何1次痰菌檢查陽(yáng)性，均為治療失敗。缺點(diǎn)：不能區(qū)別結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分支桿菌不能區(qū)別死菌跟活菌。 結(jié)核桿菌暴露于異煙肼時(shí)，某些條件

4、會(huì)失去抗酸性，出現(xiàn)假陰性。 檢測(cè)靈敏度較低（104-105 個(gè)細(xì)菌/毫升）。分枝桿菌分離培養(yǎng) 結(jié)核菌培養(yǎng)仍是目前診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)尤其是藥敏試驗(yàn)結(jié)果在指導(dǎo)臨床用藥及耐藥性檢測(cè)等方面具有重要作用, 是鑒定是否為活菌的可靠方法傳統(tǒng)的固態(tài)培養(yǎng)法 需要46周才能檢測(cè)到結(jié)核菌的生長(zhǎng)而且陽(yáng)性率也只有30-40 ；特異性差各種分枝桿菌均可生長(zhǎng)。要確定是否為結(jié)核菌需結(jié)合分枝桿菌菌種鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)?？焖倥囵B(yǎng)法:檢測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中代謝產(chǎn)生的CO2或消耗的O2，顯微鏡直接觀察、變色液體培養(yǎng)基等。快速培養(yǎng)法陽(yáng)性的報(bào)告時(shí)間大概是13周左右，比傳統(tǒng)的固態(tài)培養(yǎng)法快，但是儀器價(jià)格太昂貴。確診結(jié)核病 1份痰標(biāo)本直接涂片抗

5、酸桿菌鏡檢陽(yáng)性+1份痰標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性即可確診。 痰涂片陰性，肺部影像學(xué)檢查符合活動(dòng)性肺結(jié)核影像學(xué)表現(xiàn)+1份痰標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)核菌培養(yǎng)臨床價(jià)值用于耐多藥結(jié)核療效判定治愈：（1）患者完成療程，且在療程的后12個(gè)月，至少最后5次痰培養(yǎng)（每次間隔至少30天）連續(xù)陰性。 （2）如出現(xiàn)1次痰培養(yǎng)陽(yáng)性，其后痰培養(yǎng)（間隔至少30天）最少連續(xù)3次陰性。失敗： 治療的最后12個(gè)月，5次痰培養(yǎng)中有兩次或兩次以上陽(yáng)性；或者在最后的3次，培養(yǎng)中有任何一次是陽(yáng)性。分離培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)敏感性較直接涂片法高，理論上10-100條菌/毫升可檢出陽(yáng)性；特異性較直接涂片法高，可以從菌落生長(zhǎng)速度、色素產(chǎn)生初步判斷非結(jié)核

6、分枝桿菌；分離出具有活力的純培養(yǎng)物，為進(jìn)一步藥敏試驗(yàn)提供基礎(chǔ)。分離培養(yǎng)的缺點(diǎn)需時(shí)長(zhǎng)，根據(jù)接種量的大小，一般2-8周才能得到肉眼可見(jiàn)菌落。結(jié)果受標(biāo)本保存運(yùn)送時(shí)間、培養(yǎng)基成分和質(zhì)量、前處理方法等影響， 操作較直接涂片法復(fù)雜，需經(jīng)嚴(yán)格培訓(xùn) ，對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求也是較高。 成本是直接涂片法的7-8倍。結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢查細(xì)菌學(xué)檢查免疫學(xué)檢查分子生物學(xué)檢查涂片染色鏡檢分枝桿菌分離培養(yǎng)分支桿菌藥敏試驗(yàn)分枝桿菌菌種鑒定體液免疫學(xué)檢查細(xì)胞免疫學(xué)檢查體液免疫學(xué)檢查（血清學(xué)檢查）結(jié)核抗體測(cè)定結(jié)核抗原測(cè)定循環(huán)免疫復(fù)合物測(cè)定 血清學(xué)診斷血清學(xué)診斷技術(shù)優(yōu)勢(shì)：是一種對(duì)疾病進(jìn)行早期診斷的理想方法。無(wú)需活細(xì)胞培養(yǎng)和特殊儀器設(shè)備操作簡(jiǎn)便

7、結(jié)果顯示快速目前用于血清學(xué)診斷的主要方法:酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELlSA)斑點(diǎn)金免疫滲濾法(DIGFA)免疫印跡法(Western Blotting)等等2011年WHO正式公告：由于目前的商業(yè)血清學(xué)試劑在結(jié)核檢測(cè)中存在較大差異，且檢測(cè)結(jié)果很高比例的假陽(yáng)性和假陰性，因此不建議使用血清學(xué)方法作為結(jié)核桿菌的診斷實(shí)驗(yàn)1 。1WHO Commercial Serodiagnostic Tests for Diagnosis of Tuberculosis. /publications/2011/9789241502054_eng.pdf血清學(xué)檢測(cè)的評(píng)價(jià)原因：由于所用的測(cè)定方法、使用的試劑種類或抗原、抗體

8、的不同等，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果差異較大，并且缺乏可比性。WHO對(duì)來(lái)自不同國(guó)家的19種試劑盒產(chǎn)品進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果表明：與痰培養(yǎng)相比，這些試劑盒檢測(cè)的靈敏度為1%60%，特異度為5399% 1 。結(jié)核病細(xì)胞免疫學(xué)檢查結(jié)核菌素皮膚實(shí)驗(yàn)蛋白水平分子診斷:-干擾素釋放實(shí)驗(yàn)（IGRA)遲發(fā)型細(xì)胞超敏反應(yīng)1）方法：1:2000 OT或PPD液0.1毫升(5單位)，左前臂屈側(cè)中部皮內(nèi)注射，4872h測(cè)量皮膚硬結(jié)的直徑。結(jié)核菌素實(shí)驗(yàn)（PPD試驗(yàn)）2）判斷標(biāo)準(zhǔn)：陰性4mm弱陽(yáng)性5-9mm陽(yáng)性10-19mm，強(qiáng)陽(yáng)性20mm或局部出現(xiàn)水泡與壞死3)結(jié)核菌素試驗(yàn)的意義陰性：無(wú)結(jié)核菌感染；不能排除結(jié)核感染。陽(yáng)性：曾有結(jié)核感染，并不

9、一定現(xiàn)在患病。強(qiáng)陽(yáng)性：活動(dòng)性結(jié)核病可能 A、變態(tài)反應(yīng)尚未建立；B、免疫抑制如應(yīng)用皮質(zhì)激素或營(yíng)養(yǎng)不良等 PPD所含抗原為致病性分枝桿菌、環(huán)境分枝桿菌及卡介苗菌株所共有，其結(jié)果受到卡介苗接種及其他分枝桿菌感染的影響，特異性較差。 當(dāng)出現(xiàn)免疫功能低下時(shí)可出現(xiàn)假陰性結(jié)果，敏感性低。 免疫力正常的陰性有一定意義。強(qiáng)陽(yáng)性有一定意義。有結(jié)核變態(tài)反應(yīng)、淋巴結(jié)核強(qiáng)陽(yáng)性多。 經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便，可以用于流行病學(xué)大規(guī)模的篩查和普查，但存在著明顯的缺陷。PPD試驗(yàn)臨床價(jià)值結(jié)核感染者體內(nèi)存在特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，效應(yīng)T淋巴細(xì)胞再次受到結(jié)核抗原刺激時(shí)會(huì)分泌多種細(xì)胞因子（IFN-）。因此，檢測(cè)效應(yīng)T淋巴細(xì)胞可用于結(jié)核病或結(jié)核潛伏感

10、染者的診斷。由于效應(yīng)T細(xì)胞存活時(shí)間很短，而且具有特異性，因此可以作為機(jī)體是否正處于被感染的指標(biāo)，無(wú)論是否有臨床癥狀?；贗GRA原理的產(chǎn)品目前已被美國(guó)、加拿大、英國(guó)、德國(guó)、意大利、瑞士、法國(guó)、荷蘭、日本等二十余個(gè)國(guó)家寫(xiě)入本國(guó)的結(jié)核診療指南中。目前應(yīng)用的進(jìn)口IGRA主要有兩種商品化的試劑：1）澳大利亞Cellestis公司的 Quanti FERON-TB GOLD In Tube（QFT-GIT）2）英國(guó)Oxford Immunotec公司的T-SPOT.TB蛋白水平分子診斷:-干擾素釋放實(shí)驗(yàn)（IGRA)T-SPOT.TB原理T-SPOT.TB是以擁有專利的特異抗原（ESAT-6/CFP-10

11、），通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）檢測(cè)受試者體內(nèi)是否存在結(jié)核效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，從而判斷目前該受試者是否感染結(jié)核桿菌（現(xiàn)癥感染）的新方法。結(jié)核桿菌特異抗原：早期分泌抗原靶6（Early Secreted Antigenic Rarget 6，ESAT-6）培養(yǎng)濾液蛋白10（Culture Filtrate Protein 10，CFP 10）T-SPOT.TB臨床性能指標(biāo) 特異性只針對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群敏感，與絕大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌和卡介苗（BCG）無(wú)交叉反應(yīng) 美國(guó)FDA數(shù)據(jù)：特異性97.1%(297/306) 國(guó)內(nèi)臨床數(shù)據(jù)：特異性94.1%(478/508) 靈敏度基本不受免疫力低下/受抑

12、制影響，在肺外結(jié)核患者中有很高的檢出率 美國(guó)FDA數(shù)據(jù)：靈敏度95.6%(175/183) 國(guó)內(nèi)臨床數(shù)據(jù)：靈敏度95.3%(624/655)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解釋 陰性結(jié)果提示患者體內(nèi)不存在針對(duì)結(jié)核桿菌特異的效應(yīng)T細(xì)胞。假陰性結(jié)果：感染階段不同；少數(shù)免疫系統(tǒng)功能不全患者 陽(yáng)性結(jié)果提示患者體內(nèi)存在針對(duì)結(jié)核桿菌特異的效應(yīng)T細(xì)胞，患者存在結(jié)核感染。但是否是活動(dòng)性結(jié)核病，需結(jié)合臨床癥狀和其它檢測(cè)指標(biāo)綜合判斷。假陽(yáng)性結(jié)果： 4種環(huán)境分枝桿菌感染時(shí)：M.kansasii（堪薩斯）、M.szulgai（蘇氏）、M.marinum（海）、M.gordonae（戈登）方法學(xué)的優(yōu)點(diǎn)檢測(cè)特異性的提高幫助臨床區(qū)分卡介苗接種和

13、環(huán)境分枝桿菌感染引起的“假陽(yáng)性”，避免了臨床的無(wú)效用藥檢測(cè)靈敏度的提高有利于臨床對(duì)結(jié)核病的早發(fā)現(xiàn)、早治療，避免了疾病的傳播與擴(kuò)散快速48小時(shí)出結(jié)果方法學(xué)的局限不能區(qū)分活動(dòng)性TB與潛伏感染不能夠提示臨床患者的病變部位，需要結(jié)合臨床的判斷目前還不能夠根據(jù)斑點(diǎn)數(shù)量的多少來(lái)判斷患者是活動(dòng)性結(jié)核病或是潛伏感染者不適合用于結(jié)核病患者治療的療效監(jiān)測(cè)檢測(cè)收費(fèi)高（600-700元/次）體外r-干擾素釋放試驗(yàn)活動(dòng)性結(jié)核病通過(guò)有效的抗結(jié)核治療后，結(jié)核桿菌載量下降，效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量會(huì)隨之減少，所以理論上IGRA結(jié)果應(yīng)從陽(yáng)性轉(zhuǎn)變?yōu)殛幮?，但臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)IGRA結(jié)果轉(zhuǎn)陰率非常低。2012年發(fā)表的一篇meta分析中指出，T-

14、SPOT.TB在結(jié)核病患者抗結(jié)核治療后轉(zhuǎn)陰率為5.71%-13.93%，說(shuō)明IGRA在評(píng)價(jià)抗結(jié)核治療方面作用是有限的。 Chiappini E, Fossi F, Bonsignori F, et al. Utility of interferon- release assay results to monitor anti-tubercular treatment in adults and children. Clin Ther, 2012, 34: 1041-1048. IGRA在評(píng)價(jià)抗結(jié)核治療中的作用是有限的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢查細(xì)菌學(xué)檢查免疫學(xué)檢查分子生物學(xué)檢查涂片染色鏡檢分枝桿菌分離培養(yǎng)

15、分支桿菌藥敏試驗(yàn)分枝桿菌菌種鑒定體液免疫學(xué)診斷細(xì)胞免疫學(xué)診斷聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）DNA測(cè)序DNA探針技術(shù)基因芯片技術(shù)分子生物學(xué)檢測(cè)方法近年來(lái)核酸擴(kuò)增技術(shù)和雜交分析技術(shù)的發(fā)展，為分枝桿菌的檢測(cè)、鑒定和藥敏實(shí)驗(yàn)提供了極大的方便，可將診斷時(shí)間從幾周降低到幾天甚至是幾個(gè)小時(shí)。研究、應(yīng)用報(bào)道較多的結(jié)核病基因診斷技術(shù)主要包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、核酸探針雜交、DNA序列測(cè)定、基因芯片、基因分型等。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)本實(shí)驗(yàn)室所使用的結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）采用單管單人份的分裝技術(shù)，操作過(guò)程非常簡(jiǎn)便；并引入熒光檢測(cè)技術(shù)，簡(jiǎn)化了檢測(cè)步驟，并且整個(gè)擴(kuò)增及擴(kuò)增后檢測(cè)都無(wú)需打開(kāi)擴(kuò)增管蓋，從根本上

16、克服了PCR遺留污染。熒光探針PCR檢測(cè)技術(shù)綜合了PCR擴(kuò)增的高敏感性、探針雜交的高特異性及熒光能量轉(zhuǎn)移的實(shí)時(shí)跟蹤特性，使檢測(cè)的準(zhǔn)確性大大提高，并可充分保證檢測(cè)的穩(wěn)定性及重復(fù)性。結(jié)核桿菌PCR檢測(cè)的臨床意義1.在痰菌陰性結(jié)核快速診斷有重要臨床應(yīng)用價(jià)值。在臨床工作中，痰菌陰性，經(jīng)臨床綜合分析后診斷為肺結(jié)核的患者，約占肺結(jié)核患者的60%-70%。有報(bào)道指出痰菌陰性的肺結(jié)核患者，如果未經(jīng)抗結(jié)核治療，經(jīng)過(guò)1-3年的隨訪，將有40%-60%的患者發(fā)展為菌陽(yáng)甚至更典型的肺結(jié)核。所以獲得病原學(xué)的診斷至關(guān)重要結(jié)核桿菌PCR檢測(cè)的臨床意義2012年發(fā)表在中國(guó)防癆雜志中的一篇文章的研究指出在476例菌陰肺結(jié)核病患

17、者中，PCR法檢出116例陽(yáng)性，檢測(cè)的靈敏度為24.4%而菌陽(yáng)肺結(jié)核患者的檢測(cè)靈敏度為97.0%結(jié)核桿菌PCR檢測(cè)的臨床意義2、PCR法可以作為臨床痰涂片和痰培養(yǎng)的補(bǔ)充，為臨床診斷和治療提供幫助涂片陽(yáng)性并不能區(qū)分是結(jié)核分枝桿菌還是非結(jié)核分枝桿菌，這兩者的治療是有很大的差異的，NTM對(duì)于常用的抗結(jié)核藥經(jīng)常都是無(wú)效的，所以對(duì)于涂片陽(yáng)性的標(biāo)本，很有必要在在做MTB-DNA的檢測(cè)，進(jìn)一步確認(rèn)是否是真的MTB的感染。結(jié)核桿菌PCR檢測(cè)的臨床意義3.可作為結(jié)核性關(guān)節(jié)炎和泌尿系統(tǒng)結(jié)核早期診斷的一個(gè)可靠指標(biāo)。118 例疑似結(jié)核病患者, 其中關(guān)節(jié)炎患者 52 例, 泌尿系感染患者 66 例, 應(yīng)用 FQ-PCR

18、 技術(shù)分別檢測(cè)患者關(guān)節(jié)腔積液和尿液中的 TB-DNA ,并與抗酸染色法的檢出率比較。結(jié)果 52 例關(guān)節(jié)炎患者中 ,確診結(jié)核性關(guān)節(jié)炎患者36 例 , TB-DNA 陽(yáng)性 22 例,22 例全部為確診病例, 陽(yáng)性率61.1%?？顾崛旧年?yáng)性只有2例,陽(yáng)性率5.6%;66 例泌尿系統(tǒng)疾病患者中, 確診泌尿系結(jié)核患者52例 , TB-DNA 陽(yáng)性 32例 ,32 例全部為確診病例 , 陽(yáng)性率為 61.5 %, 抗酸染色的陽(yáng)性只有 4例, 陽(yáng)性率 7.7%。結(jié)論 應(yīng)用 FQ-PCR 技術(shù)檢測(cè)患者關(guān)節(jié)腔積液和尿液中的 TB-DNA ,具有高度敏感性和特異性,可作為結(jié)核性關(guān)節(jié)炎和泌尿系統(tǒng)結(jié)核早期診斷的一個(gè)可

19、靠指標(biāo)。 2010年發(fā)表在中國(guó)防癆雜志結(jié)核桿菌PCR檢測(cè)的臨床意義4、PCR用于臨床療效觀察比涂片、培養(yǎng)實(shí)用，對(duì)估計(jì)有可能復(fù)發(fā)的病例有一定的幫助有些耐藥菌或患者經(jīng)化療后痰排菌可能轉(zhuǎn)化為型結(jié)核分枝桿菌，抗酸染色不能有效檢測(cè)，而檢測(cè)細(xì)菌，不受其表型變化影響，所以較抗酸染色法對(duì) 有更強(qiáng)的檢出能力，能更有效地發(fā)現(xiàn)傳染源、降低漏診率，是早期診斷肺結(jié)核比較好的指標(biāo)。L 型的結(jié)核分支桿菌是形成慢性傳染源的主要原因, 也是結(jié)核病惡化、復(fù)發(fā)的細(xì)菌學(xué)根源。所以對(duì)年老體弱、合并有其它機(jī)體疾病、痰中含菌量多 、肺部結(jié)核病變廣泛 、有空洞存在 、化療期滿、微生物學(xué)檢查(涂片加培養(yǎng))陰轉(zhuǎn)但 PCR 仍持續(xù)陽(yáng)性的患者,應(yīng)采取繼續(xù)密切觀察,或同時(shí)考慮更改治療方案或延長(zhǎng)治療時(shí)間及隨訪時(shí)間等做法。美國(guó)CDC建議：在同時(shí)獲得核酸檢測(cè)和涂片結(jié)果后，根據(jù)其結(jié)果不同可分為4種情況1.對(duì)于核酸檢測(cè)和抗酸桿菌涂片結(jié)果均為陽(yáng)性的患者，需高度懷疑結(jié)核病，在等待培養(yǎng)結(jié)