發(fā)熱伴血小板減少綜合征表現(xiàn)、檢測和感染性物質(zhì)的包裝概述

1、發(fā)熱伴血小板減少綜合征表現(xiàn)、檢測和感染性物質(zhì)的包裝概述SFTSV的發(fā)現(xiàn)和研究概況 病毒性出血熱一類由病毒引起的，以發(fā)熱、出血、休克、多器官損害為主要表現(xiàn)的嚴(yán)重急性傳染病。 病毒性出血熱具有較高病死率。 病毒性出血熱的病原主要為4個(gè)病毒科 沙粒病毒科 布尼亞病毒科 黃病毒科 絲狀病毒科 均為有包膜單鏈RNA病毒 動物或昆蟲作為宿主和媒介2009-2010年，在河南、湖北和山東等地一些丘陵、山區(qū)相繼出現(xiàn)病原不明癥狀類似的病人，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、消化道癥狀、血小板減少、白細(xì)胞減少及多臟器功能損傷等，少數(shù)重癥病例死亡。中國疾病控制中心對該新發(fā)傳染病加強(qiáng)監(jiān)測，利用未知病原快速篩查技術(shù)體系，在湖北和山東3名

2、患者血清中同時(shí)發(fā)現(xiàn)新病毒基因序列。從湖北、山東、河南、安徽、江蘇、遼寧6省病人血清標(biāo)本中分離到20株同種病毒。解析了6省11株新病毒全基因組信息。并從70% 急性期病人血清中檢測到病毒RNA。確診病人恢復(fù)期血清中特異性抗體轉(zhuǎn)陽或4倍增高。鑒定新病毒 研究工作從病原體分離鑒定到病因關(guān)系的論證，成功確定該新發(fā)傳染病病原為： 布尼亞病毒科白蛉病毒屬的新病毒命名為發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus, SFTSV) SFTSV一般生物學(xué)特性SFTSV人感染后可出現(xiàn)病毒血癥，從早期病人血清中可分離到

3、病毒，病毒感染細(xì)胞譜較廣，培養(yǎng)上清超濾濃縮后經(jīng)蔗糖密度剃度離心可獲得純化的病毒顆粒，在電鏡下呈球形或橢球形，直徑約80100nm。病毒顆粒有雙層脂質(zhì)包膜，包膜表面有糖蛋白形成的突起，內(nèi)有病毒基因組與核蛋白形成的核衣殼結(jié)構(gòu)。 目前國際上公認(rèn)將白蛉病毒屬病毒分成兩大組，一組是對人類致病的，如立夫特谷熱病毒等，另一組一般對人類不致病，如烏庫病毒等，新發(fā)現(xiàn)的SFTSV為白蛉病毒屬第三組病毒。SFTSV感染流行病學(xué)特征 我國目前已在河南、湖北、山東、江蘇、安徽、遼寧、浙江、江西8省發(fā)現(xiàn)發(fā)熱伴血小板減少綜合征（SFTS）病例，多散發(fā)于呈丘陵地貌的農(nóng)村地區(qū)，呈散在分布。發(fā)病時(shí)間一般開始于3月，高峰期在5-7

4、月份，可延續(xù)至11月份。SFTSV易感人群年齡分布在39-83歲之間，其中50歲以上患者占75；沒有明顯性別差別。宿主和媒介 SFTSV傳播媒介主要是蜱蟲，人類可通過蜱蟲叮咬而得病，已從長角血蜱中分離到SFTS病毒，其核酸序列與人源病毒具有95左右同源性。SFTSV宿主范圍較廣，病毒可感染牛、羊、狗等脊椎動物和蜱等節(jié)肢動物，在牛、羊、狗、雞、豬血清中存在SFTS布尼亞病毒抗體，并已從牛、羊、狗中分離到病毒。發(fā)現(xiàn)SFTS死亡病人血清中病毒載量可達(dá)107TCID50，直接接觸高感染性病人血液可導(dǎo)致人人直接傳播。SFTSV病毒循環(huán)SFTS臨床特征及致病機(jī)理 SFTS患者沒有特異的臨床癥狀，主要表現(xiàn)為

5、發(fā)熱和胃腸消化道癥狀，可見局部淋巴結(jié)腫大。實(shí)驗(yàn)室化驗(yàn)常見血小板減少（100）和白細(xì)胞減少（99）。大多數(shù)患者很快發(fā)展為多器官功能異常，表現(xiàn)為血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶、磷酸肌酸激酶，磷酸肌酸激酶同工酶水平升高。常見蛋白尿（84）和血尿（59）。 臨床特征絕大多數(shù)患者預(yù)后良好，少數(shù)病例病情危重，出現(xiàn)意識障礙、皮膚淤斑、消化道出血等，可因休克、呼吸衰竭、彌漫性血管內(nèi)凝血（DIC）等多臟器功能衰竭死亡。動態(tài)監(jiān)測結(jié)果顯示幸存者中病毒載量多在發(fā)病后7天開始下降，但病死者其病毒載量仍維持在較高水平，可發(fā)生經(jīng)血液人人傳播。 在發(fā)病第7-13天，血清病毒載量、血清谷草轉(zhuǎn)氨酶，乳酸脫氫酶異常提示可

6、能會導(dǎo)致更為嚴(yán)重的出血癥狀、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、DIC、MOF及血清中組織酶升高。病死率約12左右。新型布尼亞病毒的致病機(jī)理尚待更多的臨床數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)室研究進(jìn)行闡明。選取發(fā)熱伴血小板減少綜合征病不同預(yù)后的患者，利用Luminex技術(shù)平臺，檢測了27種細(xì)胞因子的動態(tài)變化，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對每種因子進(jìn)行定量。 致病機(jī)理研究結(jié)果顯示SFTS患者急性期血清中促炎性細(xì)胞因子IL1-RA，IL-6，IL-8，IL-10，MCP-1，G-CSF及IP-10水平大幅度提升，而PDGF-BB和RNATES水平則顯著降低，且病毒載量與血清細(xì)胞因子水平具有相關(guān)性。 研究結(jié)果提示高病毒載量可能會導(dǎo)致危重病人的嚴(yán)重病理變化，

7、而促炎性細(xì)胞因子異?？赡芘cSFTS癥狀加重有關(guān)。 在SFTS患者血清中幾乎檢測不出干擾素。已有的布尼亞病毒的研究認(rèn)為，布尼亞病毒科的病毒通常不能有效促進(jìn)抗病毒復(fù)制的干擾素生成，有些非結(jié)構(gòu)蛋白具有拮抗干擾素的作用。 基于這些資料推測，新型布尼亞病毒可能通過抑制靶細(xì)胞生成干擾素而在體內(nèi)復(fù)制，在這一過程中可通過誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生炎癥性趨化因子而引發(fā)后續(xù)的免疫炎癥反應(yīng)。 將從患者血清中分離的SFTSV接種到小鼠體內(nèi)，在感染急性期可引發(fā)特征性臨床癥狀，即血小板減少和白細(xì)胞減少發(fā)現(xiàn)病毒核酸在血、肝、脾、腎中均可檢出病毒感染可有效地誘導(dǎo)病毒特異性IgM、IgG以及中和抗體的生成發(fā)現(xiàn)SFTSV在肝、脾、腎引起顯著病

8、理變化，與臨床觀察到的肝腎損傷癥狀一致。SFTSV感染動物模型、免疫學(xué)、病理學(xué)發(fā)現(xiàn)脾巨噬細(xì)胞為病毒感染復(fù)制的靶細(xì)胞，在SFTSV感染的脾組織中，巨噬細(xì)胞大量增加，血小板也出現(xiàn)大量沉積，并且熒光共定位研究顯示病毒與血小板共定位于巨噬細(xì)胞的胞漿中。結(jié)合細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SFTSV可以黏附于人血小板并引發(fā)巨噬細(xì)胞對血小板的吞噬，目前的研究提示SFTSV感染導(dǎo)致的血小板減少可能是由于脾巨噬細(xì)胞對病毒黏附血小板的異常清除所致。SFTSV實(shí)驗(yàn)室檢測方法 標(biāo)本-病人血清病毒核酸診斷病毒特異性IgM抗體診斷病毒分離培養(yǎng)雙份血抗病毒IgG抗體檢測（免疫熒光、ELISA）空斑減少或微量中和試驗(yàn)檢測中和抗體。 病毒血癥

9、期IgMIgM、IgG、中和抗體和總抗體：ELISA 和中和實(shí)驗(yàn)等病毒分離方法0IgG核酸檢測方法病程SFTSV病毒感染的動態(tài)指標(biāo)與檢測樣本病毒分離RNA提取cDNA合成一步法RT-PCRPCR電泳分析實(shí)時(shí)、定量分析基因序列分析IFA 或FA核酸檢測流程圖常用PCR檢測方法常規(guī)PCR檢測單輪PCR檢測2輪PCR檢測（套式或半套式PCR）實(shí)時(shí)定量PCR基于SYBR Green I的PCR檢測基于探針的PCR檢測方法：HybProbe/Taqman根據(jù)檢測靶標(biāo)單元PCR檢測方法多元PCR檢測方法核酸檢測流程反應(yīng)體系混合物正、反向引物混合物特異性熒光探針1) 核酸分離2) Real-time PCR

10、 檢測20 l5 l反應(yīng)條件取決于病原體特異性PCR儀合適的PCR管1、帶手套2、注意及時(shí)更換手套，盡量保持分離RNA的管子封閉。3、分離RNA保持在冰上4、使用滅菌和無RNA酶的耗材5、用0.1M NaOH，1mM EDTA（或氯仿）和無RNA酶水沖洗塑料耗材；玻璃器皿使用含去污劑的水反復(fù)沖洗，然后240干烤4小時(shí)，或充滿0.1%DEPC的水37 過夜（或不少于孵育12小時(shí)）。6、溶液：如果不能確認(rèn)是否無RNA酶（RNase-free)，應(yīng)用0.1%DEPC處理。7、分離的RNA保存于-20 或以下冰箱，避免反復(fù)凍融，可考慮添加額外的RNA酶抑制劑。需要時(shí)再分離RNA。核酸檢測的注意點(diǎn)：防止

11、RNA酶污染PCR交叉污染的來源與控制PCR不需無菌操作，但應(yīng)十分注意交叉污染常見的污染源：以前PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染；樣本處理污染；交叉污染的控制：隔離操作區(qū)：至少有三個(gè)區(qū)域，標(biāo)本核酸分離、PCR反應(yīng)體系配制、PCR擴(kuò)增及結(jié)果分析。實(shí)驗(yàn)中盡量減少各區(qū)之間交叉走動，穿著不同工作服。 操作技能：戴手套并及時(shí)更換、仔細(xì)操作、液體應(yīng)該分裝、用防氣溶膠的吸頭。妥善處理廢棄物污染的處理 及時(shí)清除操作廢棄物 次氯酸（2%-5%）+70%乙醇擦拭污染的工作區(qū)表面次氯酸（2%-5%）過夜浸泡使用過的PCR管存放架等以備下次使用耗材從倉庫直接運(yùn)送到PCR操作間，不經(jīng)過不必要的實(shí)驗(yàn)室UV照射：表面、液體等，由于UV

12、對500bp以下的DNA損害很小，所以可以處理已加入引物的反應(yīng)液。內(nèi)切酶和DNase I 可以對未加入模板和Taq酶的PCR反應(yīng)液進(jìn)行處理，處理完后加熱滅活這些酶，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)。 尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)。SFTSV細(xì)胞培養(yǎng)分離與鑒定1 目的用于患者、宿主動物及媒介生物標(biāo)本中發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（SFTSV）細(xì)胞培養(yǎng)分離與鑒定。2 適用范圍適用于SFTS患者、宿主動物及媒介生物樣本的檢測。3.樣品接收和準(zhǔn)備3.1 核對被檢患者的姓名、性別、年齡、編號及檢測項(xiàng)目；核對被檢樣本的來源、種類、編號、檢測項(xiàng)目等。3.2 用于檢測的待測樣品不能及時(shí)檢測的儲存在-70。4.實(shí)驗(yàn)原理標(biāo)本中

13、病毒通過在敏感組織細(xì)胞中培養(yǎng)放大，有利于病毒的進(jìn)一步分析與鑒定，可以用來分離SFTSV的敏感細(xì)胞包括：Vero, Vero-E6等。SFTS血清學(xué)檢測方法1.捕獲法Mac-ELISA2.間接法ELISA3.雙抗原夾心法ELISA4.雙抗體夾心法ELISA5. 空斑減少中和試驗(yàn)IgM捕捉法ELISA檢測SFTSV的IgM抗體1 目的檢測SFTSV IgM抗體。2 適用范圍適用于患者血清或血漿中SFTSV IgM抗體的快速檢測。3.樣品接收和準(zhǔn)備3.1 核對被檢樣品（血清或血漿）。3.2 人血清或血漿，含有EDTA、檸檬酸鈉或肝素等抗凝劑的樣品可用于本試驗(yàn)。樣品中無微生物，可在2-8儲存一周，超過

14、此期限建議-20以下凍存，避免反復(fù)凍融，使用前將樣品室溫平衡30分鐘以上，冷凍樣品實(shí)驗(yàn)前需混勻。間接法ELISA-IgG抗體1 目的：檢測新布尼亞病毒IgG抗體。2 適用范圍：適用于血清或血漿中抗新布尼亞病毒IgG抗體的快速檢測。3.樣品接收和準(zhǔn)備3.1 核對被檢樣品（血清或血漿）。3.2 本試劑使用人血清或血漿，含有EDTA、檸檬酸鈉或肝素等抗凝劑的樣品可用于本試驗(yàn)，樣品中無微生物，可在2-8儲存一周，超過此期限建議-20以下凍存，避免反復(fù)凍融，使用前將樣品室溫平衡30分鐘以上，冷凍樣品實(shí)驗(yàn)前需混勻。雙抗原夾心法ELISA-總抗體1.目的：檢測發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（SFTSV）特異性抗

15、體。2 適用范圍：適用于人或宿主動物血清或血漿中SFTSV抗體的快速檢測。3.檢測原理：本方法采用純化的重組SFTSV核蛋白抗原包被酶標(biāo)板，結(jié)合樣本中SFTSV特異性抗體，再加辣根過氧化物酶標(biāo)記的核蛋白抗原和已被板上抗原捕獲的抗體反應(yīng)。用以檢測SFTSV特異性抗體。適用于SFTSV感染狀況的調(diào)查及其它實(shí)驗(yàn)性研究。當(dāng)恢復(fù)期樣本總抗體滴度較急性期有4倍或4倍以上升高時(shí)，具有診斷意義。SFTSV雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)1 目的檢測發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（SFTSV）抗原。2 適用范圍適用于檢測組織培養(yǎng)、媒介、宿主動物標(biāo)本、患者急性期血中SFTSV抗原檢測。3 檢測原理本方法采用病毒特性性多克

16、隆抗體包被酶標(biāo)板捕獲標(biāo)本中病原抗原，加病毒特異性單克隆抗體結(jié)合病毒抗原，用以檢測病毒抗原。SFTSV空斑減少中和試驗(yàn)1 目的:檢測發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（SFTSV）中和性抗體和血清分型。2 適用范圍:適用于診斷、血清流行病學(xué)調(diào)查3 樣品接收和準(zhǔn)備 核對被檢樣品患者的姓名、性別、年齡、編號及檢測項(xiàng)目等。3.2 用于檢測的待測樣品，如不能及時(shí)檢測儲存在-20。4.檢驗(yàn)原理空斑就是對活性染料（中性紅）不著色的被病毒破壞的死細(xì)胞灶。有些病毒盡管不形成細(xì)胞病變卻可使細(xì)胞的一些代謝機(jī)制受影響，如對中性紅的吞噬能力減弱或喪失。在著色的活細(xì)胞單層紅色背景襯托下呈無色的斑點(diǎn)既空斑。測定形成空斑的數(shù)量可準(zhǔn)確

17、地了解病毒的感染滴度，獲得比50%細(xì)胞培養(yǎng)感染滴度(TCID50)更準(zhǔn)確的結(jié)果。利用抑制病毒繁殖減少空斑形成數(shù)，可提供一種測定血清中中和抗體和抗病毒物質(zhì)的敏感方法。SFTS樣本的包裝運(yùn)輸與準(zhǔn)運(yùn)申請 您 將 會 知 道 感染性物質(zhì)的正確包裝與分類 感染性物質(zhì)的正確運(yùn)輸與申請相關(guān)文件 衛(wèi)生部制定 人間傳染的病原微生物名錄 2006年1月11日起發(fā)布 國際民航組織 危險(xiǎn)物品航空安全運(yùn)輸技術(shù)細(xì)則 （Doc9284包裝說明PI602） 感染性物質(zhì)定義及分類 感染性物質(zhì)是那些已知或有理由認(rèn)為含有 致病原的物質(zhì)。 國際民航組織危險(xiǎn)物品航空安全運(yùn)輸技術(shù) 細(xì)則中將感染性物質(zhì)分為A、B 兩類。 名錄要求：通過其他

18、交通工具運(yùn)輸?shù)目蓞⒄找陨?標(biāo)準(zhǔn)包裝。SFTSV屬于A類標(biāo)準(zhǔn)的感染性物質(zhì)感染性物質(zhì)的A類包裝 A類：對健康人或動物造成永久性殘疾或致命 疾病的感染性物質(zhì)。 包裝：最耐用的三層包裝，并附上完整的危險(xiǎn)品申報(bào) 表。 運(yùn)輸人員的培訓(xùn)。 感染性物質(zhì)的A類包裝 航空運(yùn)輸A類包裝（UN2814號）感染性物質(zhì)的A類包裝 A類包裝 主容器感染性物質(zhì)的A類包裝 A類包裝 次級容器感染性物質(zhì)的A類包裝 A類包裝 外包裝A、B類包裝的異同點(diǎn) A類、B類包裝的相同點(diǎn) 三層包裝主容器和輔助包裝，都能承受-40至+55 溫度范圍內(nèi)95kPa的內(nèi)部壓力而無滲透。完整的包裝必須都能通過危險(xiǎn)物品航空安全運(yùn)輸技術(shù)細(xì)則規(guī)定的跌落測試。

19、包裝上都有包裝標(biāo)識、聯(lián)系人、地址等。樣本運(yùn)輸可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒） 種或樣本運(yùn)輸管理規(guī)定第三條 本規(guī)定適用于可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本的運(yùn)輸管理工作。第四條 運(yùn)輸?shù)谌龡l規(guī)定的菌（毒）種或樣本，應(yīng)當(dāng)經(jīng)省級以上衛(wèi)生行政部門批準(zhǔn)。未經(jīng)批準(zhǔn)，不得運(yùn)輸 運(yùn)輸審批權(quán)限： 省內(nèi)運(yùn)輸 由省級衛(wèi)生主管部門批準(zhǔn)； 省際和國際運(yùn)輸 由省級衛(wèi)生主管部門初審，報(bào)衛(wèi)生部批準(zhǔn)。樣本運(yùn)輸?shù)诹鶙l 申請運(yùn)輸高致病性病原微生物菌（毒）種或樣 本的單位，在運(yùn)輸前應(yīng)當(dāng)向省級衛(wèi)生行政部門提出申請，并提交以下申請材料。 1、病原微生物菌（毒）種或樣本運(yùn)輸申請表； 2、法人資格證明材料 3、接受單位同意接受證明文件； 4、病原微生物實(shí)驗(yàn)活動資格； 5、取得政府主管部門核發(fā)的從事病原微生物的活動的批準(zhǔn)文件； 6、容器或包裝材料的批準(zhǔn)文號、合格證書； 7、承諾書； 8、其他材料樣本運(yùn)輸?shù)谄邨l 接收單位應(yīng)當(dāng)符合以下條件： （一）具有法人資格； （