電子克隆基因

1、電子克隆簡介1什么是電子克隆拼圖游戲一樣的原理 如何做拼接常用軟件及網(wǎng)絡(luò)資源簡介 優(yōu)點與缺點的討論 2什么是電子克隆Watson & Crick 成功解析了DNA分子二級結(jié)構(gòu)，開創(chuàng)了分子生物學(xué)時代。Karry Mullis 發(fā)明了PCR反應(yīng)，體外大規(guī)模、有目的和快速地克隆目標(biāo)基因成為可能 。信息科學(xué)技術(shù)特別是數(shù)據(jù)庫技術(shù)在戰(zhàn)后飛速發(fā)展。3什么是電子克隆表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tags，EST）是對某個基因cDNA克隆測序所得的部分序列片段，長度大約為200600bp 。由于基因表達(dá)調(diào)控作用不同，同一個基因的mRNA剪接位點和方式不同，所以同一個基因的全長cDNA可能包

2、含多個EST。EST既代表了基因cDNA的某一區(qū)段，也表征了成熟mRNA可能的剪接方式。4什么是電子克隆電子克隆技術(shù)是生物學(xué)數(shù)據(jù)庫中EST數(shù)據(jù)庫、核酸序列數(shù)據(jù)庫、基因組數(shù)據(jù)庫，采用同源性序列比對和歸類分析、重疊區(qū)域組裝和拼接等方法延長EST序列，直至沒有與之同源的序列可供拼接為止，所得到的序列可以認(rèn)為是相對應(yīng)基因的全長cDNA，根據(jù)所得的cDNA序列設(shè)計囊括開放閱讀框兩端的引物，進(jìn)行RT-PCR克隆出相應(yīng)基因的方法。 5什么是電子克隆傳統(tǒng)的克隆方法是利用基因特異性引物大量擴(kuò)增cDNA末端或構(gòu)建cDNA文庫并采用原位雜交進(jìn)行篩選，實驗進(jìn)程長、步驟繁瑣、成本高、得率低；運(yùn)用電子克隆的方法延伸得到的

3、cDNA幾乎囊括了所有疑似為目的基因的cDNA序列，無論表達(dá)轉(zhuǎn)錄如何調(diào)控，都能通過PCR擴(kuò)增出表達(dá)的那一段基因。傳統(tǒng)的方法如同小規(guī)模地捕撈一條或幾條魚，電子克隆與之相比就如同集約化地捕撈一群魚6拼圖游戲一樣的原理 相近的物種在核酸序列上有相似性，相近物種中的同源基因序列在一定程度上可以代表目的基因的序列。可代表程度與兩序列的相似度直接相關(guān)，加之遺傳密碼的簡并性，這種混同在理論上是可行的 ，但需要作同源性檢驗以克服主觀因素的影響。7拼圖游戲一樣的原理借助計算機(jī)找到具有相同或相似圖案的圖塊，拼成完整的圖案，我們需要做的是進(jìn)行局部的微調(diào)。剩下的工作就是對拼接出的cDNA進(jìn)行可能的開放閱讀框的分析，設(shè)

4、計囊括開放閱讀框兩端的引物，RT-PCR擴(kuò)增侯選基因。8應(yīng)用電子克隆主要應(yīng)用于兩個方面：一個是利用EST序列檢索同源性序列，并由此拼接cDNA序列以期挖掘新基因。另一方面是在全基因組已經(jīng)測序的物種中，研究整個基因組序列以推測其中可能尚未發(fā)現(xiàn)的基因。目前應(yīng)用比較廣泛的是第一方面 9如何做拼圖游戲以電子克隆新的水稻過氧化氫酶（catalase，CAT）基因為例，簡介延伸cDNA的流程：以登錄號為CA759712的EST在對其在核酸序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST檢索比對時，發(fā)現(xiàn)登錄號為CB652681的序列推測為水稻CAT基因的部分序列，與信息標(biāo)簽 EST具有比較高的同源性，該EST序列將作為種子序列。

5、 10如何做拼圖游戲?qū)z索得到的同源序列保存到PC機(jī)上，運(yùn)行DNAStar軟件包，將上述序列輸入，由于基因測序是借助質(zhì)粒載體完成的，序列中難免混有載體序列，因此需要運(yùn)行程序查找載體序列，對序列進(jìn)行末段修剪去掉冗余部分。 11如何做拼圖游戲程序根據(jù)外顯子和內(nèi)含子的編碼規(guī)則和排布方式搜索和定位開放閱讀框，開放閱讀框是電子克隆的重點研究對象；接著，程序?qū)Ω鞫涡蛄械闹貜?fù)序列和差異序列進(jìn)行逐一檢索和比對，并對重疊區(qū)域進(jìn)行拼接和組裝，構(gòu)建重疊序列群。以上各步驟由程序自動完成12如何做拼圖游戲以構(gòu)建的重疊序列群為信息標(biāo)簽，進(jìn)一步檢索比對，搜索其高度同源序列如果發(fā)現(xiàn)了與之高度同源的未知序列，則重復(fù)上述步驟；若

6、沒有新的發(fā)現(xiàn)，說明拼接組裝得到的EST可能囊括了所以可能的目的基因序列 根據(jù)以上步驟，得到了一個全長為1678 bp的EST序列 13如何做拼圖游戲以此EST序列為cDNA序列，對其設(shè)計囊括整個開放閱讀框的特異性引物，設(shè)計得到的上游引物為：5-CTA-GCC-CAC-TAC-CAT-GGA-TCC-TTG-3，下游引物為：5-CAG-AAT-TTC-TGT-AGC-CTT-GCT-GAT-3， 引物的具體合成可交由經(jīng)營分子生物學(xué)相關(guān)產(chǎn)業(yè)的公司商業(yè)化合成 14如何做拼圖游戲?qū)ρ由斐龅腸DNA其作人工的可靠性驗證 提取水稻中總RNA，進(jìn)行RT-PCR，電泳檢測結(jié)果 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究 15常用軟件及網(wǎng)

7、絡(luò)資源簡介 DNAStar是一款電子克隆中常用的軟件包，它以功能全面和強(qiáng)大而著稱，它主要包括以下幾個應(yīng)用程序：EditSeq、GeneMan、GeneQuest、MapDraw、MegAlign、PrimerSelect、Protean、和SeqMan II 16常用軟件及網(wǎng)絡(luò)資源簡介美國國家生物信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）， 美國冷泉港實驗室（Cold Spring Habor Laboratory，CSHL）， 歐洲分子生物學(xué)信息網(wǎng)（European Molecular Biology Net，EMBnet）

8、， 17常用軟件及網(wǎng)絡(luò)資源簡介歐洲分子生物學(xué)實驗室（European Molecular Biology Laboratory，EMBL）， 日本國立遺傳研究所（National Institute of Genetics，NIG）， 北京大學(xué)生物信息學(xué)中心（Peking University Center of Bioinformatics，PKUCBI）， 18優(yōu)點與缺點的討論與傳統(tǒng)的基因克隆方法相比，電子克隆有以下的優(yōu)點：簡便快速，成本低廉，設(shè)備簡單 對操作人員技術(shù)要求不高成功率高 19優(yōu)點與缺點的討論盡管電子克隆在理論上已沒有什么障礙，然而在實際操作中依然存在些不足之處：電子克隆得到的cDNA序列是由計算機(jī)虛擬出來的，現(xiàn)實中可能并不存在研究人員不可完全迷信軟件提供的結(jié)果，最好對分析做人工可靠性驗證 普遍適用性較差電子克隆后需要研究其指導(dǎo)合成的蛋白質(zhì)的功能才更有實際意義20現(xiàn)狀與展望隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，以及數(shù)據(jù)庫準(zhǔn)確