糖蛋白糖鏈結構異常與惡性腫瘤的診斷ppt課件

1、 聚丙烯酰胺凝膠電泳Polyacrylamide Gel Electrophoresis ，PAGE Li Li 一、PAG 的 組成 PAG是由丙烯酰胺acrylamide，Acr單體和N，N-亞甲雙丙烯酰胺N，N，N，N-methylene bixacrylamide，Bis交聯(lián)劑經(jīng)過自在基聚合而成的一種多孔三維網(wǎng)狀構造。Acr + Bis 多孔三維網(wǎng)狀構造 1丙烯酰胺構造式2亞甲雙丙烯酰胺 二、PAG 的 聚 合 需求催化劑氧化復原系統(tǒng)作用，使Acr單體帶有游離基，從而與Bis進展聚合。 一化學聚合：AP-TEMED系統(tǒng) 過硫酸胺(NH4)2S2O8Ammonium persulfate

2、，AP作為催化劑，四甲基乙二胺TEMED為加速劑。 AP在水溶液中能產(chǎn)生游離基SO42-，使丙烯酰胺單體的雙鍵翻開，活化構成自在基丙烯酰胺，然后游離Acr和Bis作用就能聚合構成凝膠。TEMED的游離堿基能促進AP的構成SO42- 。留意： TEMED量多少都會影響催化作用，須在堿性條件下聚合 分子氧存在，聚合不完全，須去除分子氧，隔絕氧 升高溫度能提高聚合，降低溫度能延遲聚合 二光聚合：核黃素-TEMED系統(tǒng)核黃素riboflavin在光照下可見光或紫外光分解，其黃素部分被復原成無色型，但在有氧條件下無色型又被氧化成帶有游離基的黃素，其也能使Acr和Bis聚合構成凝膠。留意：分別膠的合成普通

3、采用化學聚合。由于假設用光聚合，凝膠的孔徑受光照強度與時間的影響，導致孔徑大小不同，從而影響蛋白質的分別。 三、PAG的濃度與孔徑的關系 PAG孔徑的大小主要由Acr和Bis這兩種單體的濃度決議。可以根據(jù)要分別物質分子的大小，選擇適宜的單體濃度。Acr/Bis：2040 完全透明且有彈性； 10 很脆，易碎，不透明； 100 糊狀不成形，易破碎。 凝膠總濃度T100ml凝膠溶液中含有Acr和 Bis的總克數(shù)。T=a+b/m100% T越大，凝膠孔徑越小，適用于分別分子量較小的物質。 T越小，凝膠孔徑越大，適用于分別分子量較大的物質。 CBis占單體與交聯(lián)劑總量的百分比。C=b/a+b100%當

4、T固定時，Bis濃度在5%時孔徑最小。 四、不 連 續(xù) PAGE 按詳細操作分 垂直板形電泳 圓盤電泳按凝膠系統(tǒng)的均勻性分 延續(xù)PAGE 不延續(xù)PAGE Disc成分 作用樣品膠 T=3% C=20%單體欲分離的樣品溶液pH6.7 Tris-HCl緩沖液混在一起，用光聚合方法聚合而成的大孔凝膠有防對流作用 電極槽緩沖液通常為pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液 Disc成分 作用濃縮膠除不加樣品外，其余組成成分同樣品膠相同樣品在此膠中被濃縮 Disc成分 作用分離膠 T=7%C=2.5%單體溶液pH8.9 Tris-HCl緩沖液化學聚合法聚合成小孔膠主要的電泳分離部分 分 離 原 理1. 濃縮效

5、應1凝膠層的不延續(xù)性 兩層凝膠T與C不同孔徑不同 濃縮膠孔徑大，分別膠孔徑小，蛋白質在大孔徑濃縮膠中挪動，受阻力小，挪動速度快。 2緩沖液離子成分的不延續(xù)性甘氨酸pI=6.0在pH8.3帶負電，朝正極挪動，進入濃縮膠pH6.7，甘氨酸解離度很小，有效遷移率M 很低，挪動速度較慢，稱為慢離子。HCl 是強電解質，=1，Cl-有效遷移率大，挪動速度快，稱快離子。蛋白質pI6.0帶負電荷，有效遷移率介于兩者之間。 pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液甘氨酸HCl蛋白質樣品膠濃縮膠分別膠樣品低電導區(qū) 3pH值的不延續(xù)性 為了控制慢離子的解離度，從而控制其有效遷移率，必需使?jié)饪s膠與分別膠之間pH值有所區(qū)別。 3.分子篩效應與電荷效應 進入分別膠后，Gly-成為快離子 分別膠只需電荷效應和分子篩效應，根據(jù)各蛋白質所帶電荷不同、分子大小不同而分別 五、PAGE 的 特 點1.具有分子篩效應，分辨率高2.樣品不易分散，用量少，靈敏度可達10-6g3.化學性質穩(wěn)定，分子構造中富含酰胺基具有穩(wěn)定的親水基團4.凝膠不帶電荷，消除了電滲景象5.機械強度好，有彈性，在一定濃度范圍內(nèi)無色透明6.網(wǎng)孔可調(diào)理 小 結1.掌握不延續(xù)PAGE的原理2.掌握影響PAGE遷移率的要素3.掌握PAGE的操作留意點、試劑作用