乙肝病毒檢測(cè)

1、關(guān)于乙肝病毒的檢測(cè)第一張，PPT共二十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月HBV 的三種形態(tài)1,Hepatitis B virion(Dane particle)2,secreted filament3,secreted sphere6第二張，PPT共二十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月乙型肝炎病毒HBVHBV是嗜肝脫氧核糖核酸病毒科的哺乳動(dòng)物屬的一員。HBV陽(yáng)性的血清中有三種病毒顆粒.大球形顆粒，完整的HBV顆粒直徑為42nm，又名Dane顆粒，分為包膜與核心的兩部分，外衣殼及包膜含有表面抗原，衣殼內(nèi)為核心結(jié)構(gòu)，有核心抗原，核心抗原下面藏有e抗原。第三張，PPT共二十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月.小球形顆粒，

2、陽(yáng)性血清中最多的顆粒，主要為表面抗原，不含核酸及成分，為不完整的.管形顆粒，實(shí)際上是一串小球形顆粒聚合在一起的，也含有表面抗原第四張，PPT共二十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月5生物化學(xué)檢測(cè)1HBV血清標(biāo)志物的檢測(cè)2HBV 分子生物學(xué)診斷3HBV臨床藥物療效檢測(cè)4HBV感染的實(shí)驗(yàn)室檢查第五張，PPT共二十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1.乙型肝炎的生物化學(xué)檢測(cè)主要指標(biāo)：ALT, AST, ASTm，血清白蛋白，血清膽紅素，膽堿酯酶,甲胎蛋白,凝血酶原時(shí)間(PT)及部分凝血因子；6第六張，PPT共二十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月方法學(xué)ELISA：靈敏性高，成本低，適用于普通病人篩查；膠體金免疫層析法(金標(biāo)

3、法)：簡(jiǎn)便易行，可用于急診病人快速檢測(cè)；化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)：價(jià)格昂貴，可用于HBVMs為臨界值的病人的確證；可間接反映宿主HBV的復(fù)制水平，在評(píng)價(jià)抗病毒治療的病毒學(xué)應(yīng)答、療效和判斷預(yù)后方面有重要意義。新增檢測(cè)指標(biāo)PreS1、PreS2及其相應(yīng)抗體對(duì)乙肝兩對(duì)半認(rèn)識(shí)72. HBV 血清標(biāo)志物檢測(cè)第七張，PPT共二十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月8PreS1檢測(cè)的臨床價(jià)值前S1蛋白主要存在于Dane顆粒和管型顆粒上，在HBV感染宿主細(xì)胞 過(guò)程及在病毒復(fù)制和刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)中起重要作用;前S1抗原與HBeAg之間有高度相關(guān)性，并可區(qū)別因變異種及其他原因造成的乙肝病毒e抗原(HBeAg)假陰性，可作為H

4、BeAg假陰性補(bǔ)充，從而準(zhǔn)確反映患者體內(nèi)病毒復(fù)制情況；可作為HBV感染及復(fù)制的標(biāo)注，與其它血清標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)，相互補(bǔ)充。Back第八張，PPT共二十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月乙型肝炎的兩對(duì)半1.乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和表面抗體(HBsAb)， 2.e抗原(HBeAg)和e抗體(HBeAb)，3.核心抗原(HBcAg)和核心抗體(HBcAb)這三對(duì) 乙肝病毒的抗原和抗體。由于HBcAg主要存在于受感染的肝細(xì)胞及乙肝病毒顆粒的核心內(nèi)，一般血清中較難檢測(cè)到，只有用特殊的方法處理后才能查到，所以通常只能檢測(cè)到HBcAb，也就是說(shuō)這第三對(duì)通常只能檢測(cè)到半對(duì)，所以稱之為兩對(duì)半。兩對(duì)半是乙肝病毒最常

5、用的血清學(xué)標(biāo)記。 第九張，PPT共二十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月乙肝五項(xiàng)的32種組合第十張，PPT共二十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第十一張，PPT共二十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第十二張，PPT共二十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月13大三陽(yáng)小三陽(yáng)vs第十三張，PPT共二十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月14HBV DNA 定量檢測(cè)病毒復(fù)制水平最可靠，最直接的證據(jù)，與傳染性和疾病進(jìn)展密切相關(guān)；主要用于HBV感染的判斷，治療適應(yīng)癥的選擇及抗病毒療效的判斷。HBV基因分型基因分型的必要性；基因分型的主要方法；HBV耐藥突變的檢測(cè)3.HBV 分子生物學(xué)診斷第十四張，PPT共二十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月病毒基因

6、突變疾病進(jìn)展臨床表現(xiàn)對(duì)干擾素應(yīng)答耐藥變異生化學(xué)改善HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換HBV DNA清除急性乙型肝炎慢性乙型肝炎肝硬化 (LC)肝細(xì)胞癌 (HCC)15HBV基因型/基因亞型第十五張，PPT共二十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月分型方法優(yōu)缺點(diǎn)序列測(cè)定法最直接，最可信，是HBV基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)，但繁瑣費(fèi)時(shí)而且價(jià)格昂貴，混合型檢測(cè)能力差，不適于大樣本檢測(cè)。 聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法 (PCR-RFLP)較測(cè)序法簡(jiǎn)便，適于大樣本檢測(cè)，但由于需要進(jìn)行酶切，所以操作仍較為繁瑣，成本較高，并存在酶切不徹底等問(wèn)題。 pre-S2單克隆抗體酶聯(lián)免疫測(cè)定 (mAbs EIA法)簡(jiǎn)單、快速，已商品化，適

7、于大樣本檢測(cè)，但檢測(cè)費(fèi)用較高并不能有效鑒別有些混合型感染和HBsAg低表達(dá)及某些表位表達(dá)不充分的標(biāo)本。分子探針雜交法簡(jiǎn)單、快速，對(duì)混合型檢測(cè)非常敏感，已商品化，適于大樣本檢測(cè)，但檢測(cè)費(fèi)用較高而且靈敏度和特異度還有待提高。型特異性引物PCR法簡(jiǎn)單、快速，成本低，具有較高的靈敏度，適于流行病學(xué)研究和臨床大樣本檢測(cè)。但特異度還有待提高。常用HBV基因分型方法比較16第十六張，PPT共二十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月客觀看待乙肝DNA1.乙肝病毒DNA 定量往往被描述成為判斷乙肝傳染性大小、病情嚴(yán)重程度以及治療效果的“金指標(biāo)”，其實(shí)這些認(rèn)識(shí)都是片面的。乙肝病毒DNA 定量檢測(cè)為了解乙肝病毒在體內(nèi)的變化增

8、添了新的手段，彌補(bǔ)了以往乙肝病毒“兩對(duì)半”檢測(cè)的不足，只要抽血化驗(yàn)檢測(cè)乙肝病毒DNA 呈陽(yáng)性，無(wú)論其他乙肝病毒檢測(cè)結(jié)果如何，都說(shuō)明患者體內(nèi)存在復(fù)制狀態(tài)的乙肝病毒，血液具有一定傳染性，這對(duì)于評(píng)估治療效果和了解病情變化有一定幫助。但是目前乙肝病毒DNA 檢測(cè)尚處于研究階段，并非完美無(wú)缺 第十七張，PPT共二十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月乙肝病毒DNA 定量不能說(shuō)明病情輕重乙肝病毒DNA 定量數(shù)值只能說(shuō)明游離在血液中病毒的含量，病毒多少、含量高低與病情嚴(yán)重程度沒(méi)有直接關(guān)系。乙肝病情嚴(yán)重程度必須通過(guò)檢測(cè)肝功系列指標(biāo)確定，這些指標(biāo)包括：轉(zhuǎn)氨酶、膽堿酯酶、膽紅素、白蛋白、凝血酶原活動(dòng)度、轉(zhuǎn)肽酶、蛋白電泳等等

9、，凝血酶原活動(dòng)度、白蛋白、膽堿酯酶數(shù)值越低，說(shuō)明病情越嚴(yán)重。病毒定量數(shù)值高低與病情無(wú)直接關(guān)系。相反，絕大多數(shù)無(wú)癥狀乙肝病毒攜帶者，尤其是少年兒童患者，乙肝病毒DNA 檢測(cè)都為陽(yáng)性，乙肝病毒處于高復(fù)制狀態(tài)，而他們的病情十分輕微，肝穿結(jié)果顯示，他們的肝組織僅為輕度的非特異性炎癥改變；而大多數(shù)肝硬化或肝癌患者的乙肝病毒DNA 檢測(cè)多為陰性，而病情卻十分嚴(yán)重。乙肝病毒本身不引起肝細(xì)胞病變，感染的肝細(xì)胞仍然是長(zhǎng)壽的，半衰期6 12個(gè)月或更長(zhǎng)。乙肝病情輕重決于很多因素，例如患者的免疫狀態(tài)、遺傳因素、病毒的變異等，病毒數(shù)量多少不是病情演變的決定因素。 第十八張，PPT共二十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4.HB

10、V 臨床藥物治療監(jiān)測(cè)乙肝病毒的耐藥性檢測(cè)，是精準(zhǔn)治療乙肝的關(guān)鍵！目前由于治療不夠規(guī)范，造成我國(guó)目前超過(guò)95%的乙肝患者發(fā)生耐藥、病毒變異、病毒耐藥，變異檢測(cè)勢(shì)在必行！19第十九張，PPT共二十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月乙肝五項(xiàng)檢測(cè)的影響因素1. 樣本采集與處理的影響1.1標(biāo)本嚴(yán)溶血及混有紅細(xì)胞的血清易沉淀或附著在聚乙烯孔內(nèi)不易洗凈，殘留在孔內(nèi)的血紅蛋白具有過(guò)氧化物酶樣的活性，催化底物顯色造成假陽(yáng)性，嚴(yán)重溶血標(biāo)本禁用。1.2塑料試管能吸附抗原物質(zhì)，樣本久置在塑料管內(nèi)會(huì)使樣本內(nèi)抗原含量下降造成假陰性。最好使用一次性玻璃試管或真空管采血管；并使用非抗凝標(biāo)本，肝素抗凝血漿會(huì)增加OD值，可能與高濃度肝素

11、具有強(qiáng)大的負(fù)電荷能吸附酶標(biāo)記物不易洗脫有關(guān)；EDTA、酶抑制劑（如NaN3）可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過(guò)氧化物酶活性。1.3標(biāo)本凝固不全 ，正常血液采集后1/22h開(kāi)始凝固，1824h血塊完全收縮。在工作中，有時(shí)為了爭(zhēng)取時(shí)間快速檢測(cè)，常在血液還未開(kāi)始凝固時(shí)即強(qiáng)行離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測(cè)定過(guò)程中可以形成肉眼可見(jiàn)的纖維蛋白塊，易造成假陽(yáng)性結(jié)果；因此血液標(biāo)本采集后必須使其充分凝固后再分離血清，或標(biāo)本采集時(shí)用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽?。第二十張，PPT共二十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2、試劑的影響2.1乙肝兩對(duì)半試劑廠家較多；不同廠家出產(chǎn)的試劑靈敏度

12、與特異性存在一定的差別，有資料顯示，不同廠家試劑的特異性和敏感性分別為89.4%99.3%,7889%存在較大差異。有的廠家酶標(biāo)板孔間A值差大于15%；標(biāo)記酶的活性及顯色液的穩(wěn)定比較差。使用質(zhì)劣的試劑必然導(dǎo)致結(jié)果的假陽(yáng)性或假陰性。因此。選擇高質(zhì)量的試劑是保證結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵之一。2.2不同方法學(xué)的檢測(cè)試劑，會(huì)使兩對(duì)半結(jié)果出現(xiàn)一些不同。例如：在實(shí)際工作中常用ELISA檢測(cè)HBsAg結(jié)果為陰性，而電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)為陽(yáng)性。除方法學(xué)的靈敏度外；還存在使用單抗或多克隆抗體試劑的差別。單抗對(duì)變異抗原或亞型乙肝標(biāo)志物檢測(cè)存在差異，建議試劑廠家對(duì)劑的制備應(yīng)該考慮亞型及型濃度的問(wèn)題。第二十一張，PPT共二十六頁(yè)，創(chuàng)

13、作于2022年6月3、操作技術(shù)的影響3.1加樣吸嘴的潔凈與否和吸量的準(zhǔn)確性，直接影響檢測(cè)結(jié)果。由于吸嘴構(gòu)造特殊，導(dǎo)致清洗困難，加大了交叉污染的機(jī)會(huì)。建議用一次性吸嘴。加樣器也要經(jīng)常清洗，定期校準(zhǔn)。3.2溫浴影響，96孔酶標(biāo)板結(jié)構(gòu)特別；易產(chǎn)生邊緣效應(yīng)，抗原抗體結(jié)合及酶促反應(yīng)對(duì)溫度有嚴(yán)格要求，酶標(biāo)板周?chē)c內(nèi)部孔升降溫速率不同，造成周邊與內(nèi)部孔結(jié)果差異；干浴與水浴存在明顯的差異，盡可能使用水浴，并要求固相板放入水中，減少受熱不均，貼密封膜，防止污物浸入。3.3冼滌是ELISA操作的重要環(huán)節(jié)，手冼條件一致性較差，對(duì)結(jié)果影響較大，半自動(dòng)與全自動(dòng)冼板機(jī)使用不當(dāng)也會(huì)影響結(jié)果，血清中殘留的的纖維蛋白絲或洗滌液

14、析出的結(jié)晶易使洗板機(jī)針小孔全阻塞或半阻塞狀態(tài)，造成未結(jié)合標(biāo)記酶洗脫不徹底，導(dǎo)致“花板”造成假陽(yáng)性或假陰性；所以操作洗板機(jī)過(guò)程中要不時(shí)觀察洗板機(jī)針孔內(nèi)洗液的通暢狀況，及時(shí)糾正，洗板機(jī)不用時(shí)應(yīng)用去離子水清冼幾遍。3.4肉眼判斷結(jié)果時(shí)，顯色淺不易觀察，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，必須使用酶標(biāo)儀檢測(cè)，以保結(jié)果一致性。第二十二張，PPT共二十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4、HooK效應(yīng)影響鉤狀效應(yīng)即HOOK效應(yīng),是指由于抗原抗體比例不合適而導(dǎo)致假陰性的現(xiàn)象，其中抗體過(guò)量叫做前帶效應(yīng)；抗原過(guò)量叫做后帶效應(yīng)。 隨著ELISA一步法的應(yīng)用，一些標(biāo)本中抗原含量過(guò)高，產(chǎn)生HooK效應(yīng)。影響檢測(cè)結(jié)果，采用同步稀釋測(cè)定或使用線性

15、范圍高的兩對(duì)半定量法可以減HooK反應(yīng)的發(fā)生。第二十三張，PPT共二十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月5、干擾物質(zhì)的影響有人認(rèn)為大約40%的人血清標(biāo)本中含有非特異性干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢測(cè)結(jié)果；常見(jiàn)的干擾物質(zhì)有：類(lèi)風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig 抗體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其它物質(zhì)等。如RF因子可與標(biāo)記二抗的FC段法結(jié)合造成假陽(yáng)性，補(bǔ)體從C1q活化，使一抗和酶標(biāo)二抗的抗體分子發(fā)生變構(gòu)，F(xiàn)c的C1q分子結(jié)合點(diǎn)暴露出來(lái)，則補(bǔ)體C1q可將二者連接起來(lái)造成假陽(yáng)性，采用5630分鐘滅活補(bǔ)體可降低假陽(yáng)性率，高濃度的AFP（如孕婦），在儲(chǔ)存過(guò)程中可能形成二聚體會(huì)導(dǎo)致本底過(guò)深影響檢測(cè)結(jié)果。第二十四張，PPT共二十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月6、藥物的影響6.1、高效價(jià)的乙肝免疫球蛋白會(huì)與HBsAg形成復(fù)合物，影響HBsAg的檢出，所以一些HBsAg陽(yáng)性患者注射乙肝免疫球蛋白后，HBsAg檢測(cè)會(huì)呈陰性反應(yīng)，導(dǎo)致乙肝兩對(duì)半少見(jiàn)模式的出現(xiàn)，如我們常遇到乙肝大三陽(yáng)的孕婦，為阻斷乙肝母嬰垂直傳播時(shí)，在孕第8、9、10月常規(guī)注射乙肝免疫球蛋白，不僅影響孕婦HBsAg的檢出；而且其所生產(chǎn)的生新兒也常出現(xiàn)HBsAg陰性，HBeAg 陽(yáng)性和HBcAb陽(yáng)性等少見(jiàn)模式、可能是乙肝免疫球蛋白屬I(mǎi)g