dna的粗提取與鑒定 1課件

1、討論2：如何證明他們是遺傳物質(zhì)？ 討論3：怎樣才能將細(xì)胞內(nèi)的這些物質(zhì)分離出來？ 討論1：構(gòu)成生物體的遺傳物質(zhì)是什么？DNA的粗提取與鑒定 一、基礎(chǔ)知識(shí)（一）提取DNA的方法1、提取生物大分子的基本思路選用一定的物理或化學(xué)方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子2、生物大分子主要指蛋白質(zhì)、酶和核酸3、提取DNA的基本思路利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分4、DNA的溶解性DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，利用這一特點(diǎn)，選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度就能使DNA充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀，或者相反5、討論：根據(jù)DNA在NaCl溶液中的

2、溶解度曲線圖，思考在什么濃度下， DNA的溶解度最??？ DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何變化的？8、DNA的鑒定 DNA與二苯胺（沸水?。?huì)染成藍(lán)色，因此，二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑 紫外燈照射法A、配制染色劑，用蒸餾水配制萬分之五的溴化已錠（EB）B、將玻璃棒上纏繞的白色絮狀物抹于蠟紙上，再滴一滴EB溶液染色C、將蠟紙放在紫外燈(260 nm)下照射（暗室中），可見橙紅色的熒光(DNA的紫外吸收高峰在260 nm處)甲基綠 （藍(lán)綠色）二、DNA的粗提取與鑒定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（一）實(shí)驗(yàn)材料的選取 1、材料：魚卵、豬肝、菜花、香蕉、雞血、哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞、獼猴桃、洋蔥、豌豆、菠菜、在液體培養(yǎng)基

3、中培養(yǎng)的大腸桿菌。（從中選取23種實(shí)驗(yàn)材料） 2、原則：凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，但選用DNA含量相對(duì)較高的生物組織，成功的可能性更大動(dòng)物細(xì)胞的破碎較易，例如，在雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餾水 ，同時(shí)用玻璃棒攪拌，過濾后收集濾液即可（二）破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液1、動(dòng)物細(xì)胞答：蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)胞來說是一種低滲液體，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞脹裂，再加上攪拌的機(jī)械作用，就加速了雞血細(xì)胞的破裂(細(xì)胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA討論：為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂？植物細(xì)胞需要先用一定的洗滌劑和食鹽溶解細(xì)胞膜2、植物細(xì)胞討論：加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？答：洗滌劑

4、是一些離子去污劑，能溶解細(xì)胞膜，有利于DNA的釋放；食鹽的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解實(shí)例：提取洋蔥DNA時(shí)，在切碎的洋蔥中加入一定的洗滌劑和食鹽，進(jìn)行從分的攪拌和研磨，過濾后收集研磨液答：研磨不充分會(huì)使細(xì)胞核內(nèi)的DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等討論：如果研磨不充分，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？（三）去除濾液中的雜質(zhì)為了純化提取的DNA需要將濾液作進(jìn)一步處理討論：此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分？答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質(zhì)討論：為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)答：用高鹽濃度的溶液溶解DNA，

5、能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過反復(fù)溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)討論：方案二與方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開；方案三利用的是DNA和蛋白質(zhì)對(duì)高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離（四） DNA的析出與鑒定DNA的析出用的是與濾液體積相等的冷卻的酒精溶液（體積分?jǐn)?shù)為95 ） ，靜置23min，溶液中會(huì)出現(xiàn)白色絲狀物，這就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水1、DNA的析出2、 DNA的鑒定鑒定DNA時(shí)在

6、試管中先加入物質(zhì)的量的濃度為2mol/L 的NaCl溶液5ml于兩只試管中，其中一只加入DNA絲狀物，各加入二苯胺4ml 試劑?；旌暇鶆蚝?，將試管置于沸水中加熱5min,待試管冷卻后，比較兩只試管中溶液顏色的變化，看看溶解有DNA的溶液是否有藍(lán)色（一）案例一：以雞血為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行DNA的粗提取三、實(shí)驗(yàn)案例雞血細(xì)胞極易吸水脹破，而用動(dòng)物肝臟細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)材料常常需要?jiǎng)驖{和離心，對(duì)設(shè)備要求較高，操作繁瑣，歷時(shí)較長(zhǎng)1、雞血細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)材料的原因雞血細(xì)胞核的DNA含量豐富，材料易得2、實(shí)驗(yàn)原理 DNA在NaCl溶液中的溶解度，是隨著NaCl的濃度的變化而改變的。當(dāng)NaCl的物質(zhì)的量濃度為0.14 molL時(shí)

7、,DNA的溶解度最低。利用這一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。 DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)可以溶于酒精溶液。利用這一原理，可以進(jìn)一步提取出含雜質(zhì)較少的DNA。 DNA遇二苯胺（沸水浴）會(huì)染成藍(lán)色，因此，二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。3、實(shí)驗(yàn)材料和用具：雞血細(xì)胞液（510ml）；體積分?jǐn)?shù)為95%的冷酒精溶液（實(shí)驗(yàn)前置于冰箱內(nèi)冷卻24h）；蒸餾水；質(zhì)量濃度為0g/ml的檸檬酸納溶液；務(wù)質(zhì)量的濃度分別為2mol/L和0015mol/L的氯化納溶液；二苯胺試劑。鐵架臺(tái)；鐵環(huán)；鑷子；三角架；酒精燈；石棉網(wǎng)；載玻片；玻璃棒；濾紙；滴管；量筒（100ml，一個(gè)）；燒杯；（1

8、00ml，一個(gè)，50ml、500ml各二個(gè)）；試管（20ml，二個(gè)）；漏斗；試管夾；紗布。 4、課前準(zhǔn)備雞血細(xì)胞液取質(zhì)量濃度為01g/ml的檸檬酸納溶液（抗凝劑）100ml，置于500ml燒杯中。注入新鮮的雞血（約180ml），同時(shí)用玻璃棒攪拌，使血液與檸檬酸納溶液充分混合，以免凝血。將燒杯中的血液置于冰箱內(nèi)，精置一天，使血細(xì)胞自行沉淀。（也可以將血液倒入離心管內(nèi)，用1000r/min（轉(zhuǎn)每分）的離心機(jī)離心2min，血細(xì)胞沉淀于離心管底部。實(shí)驗(yàn)時(shí)。用吸管除去離心管上部的澄清液，就可以得到雞血細(xì)胞液。）過程檸檬酸鈉作用防止血液凝固作用機(jī)理檸檬酸鈉能與血漿中的Ca2+發(fā)生反應(yīng)，生成檸檬酸鈣絡(luò)合物，

9、血漿中游離的Ca2+大大減少，血液就不會(huì)凝固雞血細(xì)胞破碎以后釋放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取過程中為了減少DNA的損失，最好使用塑料的燒杯和試管盛放雞血細(xì)胞液注意事項(xiàng)討論：提取雞血中的DNA時(shí)，為什么除去血液中的上清液？答：血液分為兩部分，一部分是血漿，一部分是血細(xì)胞，離心后除去的上清液是血漿5、方法步驟 將制備好的雞血細(xì)胞液5 mL10mL，注入到50 mL燒杯中。向燒杯中加入蒸餾水20 mL，同時(shí)用玻璃棒充分?jǐn)嚢? min，使血細(xì)胞加速破裂。然后，用放有紗布的漏斗將血細(xì)胞液過濾至500mL。取其濾液。提取雞血細(xì)胞的細(xì)胞核物質(zhì)討論：答：讓細(xì)胞內(nèi)濃度大于周圍溶液的濃度，細(xì)胞會(huì)吸水

10、以至脹破（1）為什么要加入蒸餾水？加入蒸餾水后細(xì)胞會(huì)有什么變化？（2）用玻璃棒攪拌有什么意義？答：用玻璃棒攪拌可以加速血細(xì)胞和細(xì)胞核的破裂。注意應(yīng)沿一個(gè)方向快速攪拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA（3）濾去的是什么物質(zhì)？得到的是什么？答：過濾將濾去的是細(xì)胞膜和核膜等物質(zhì)；得到的是與蛋白質(zhì)等物質(zhì)結(jié)合在一起的DNA溶解細(xì)胞核內(nèi)的DNA將氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為 2 mol的溶40mL加入到濾液中，并用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌1min，使其混合均勻，這時(shí)DNA在溶液中呈溶解狀態(tài)沿?zé)瓋?nèi)壁緩緩加入蒸餾水，同時(shí)用玻璃棒不停地輕輕攪拌，這時(shí)燒杯中有絲狀物出現(xiàn)，注意觀察絲狀物呈什么顏色。繼續(xù)加入蒸餾水，溶液中出

11、現(xiàn)的粘稠物會(huì)越來越多。當(dāng)粘稠物不再增加時(shí)停止加入蒸餾水（這時(shí)溶液中氯化鈉的物質(zhì)的量濃度相當(dāng)于0.14 molL）析出含DNA的粘稠物討論：加入蒸餾水的目的？降低NaCl溶液濃度到使DNA溶解度最低點(diǎn)，使DNA從NaCl溶液中析出將溶液中的DNA與其他雜質(zhì)分離，這一步驟是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該緩慢貼壁加入蒸餾水，并輕輕地沿一個(gè)方向不停地均勻攪拌，以利于DNA分子的附著和纏繞注意事項(xiàng)：濾取含DNA的粘稠物用放有多層紗布的漏斗，過濾步驟3中的溶液至 500mL的燒杯中，含 DNA的粘稠物被留在紗布上將DNA的粘稠物再溶解取 1個(gè) 50 mL燒杯，向燒杯內(nèi)注入氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為 2 molL的

12、溶液 20mL。用鈍頭鑷子將紗布上的粘稠物夾至氯化鈉溶液中，用玻璃擇不停地?cái)嚢瑁拐吵砦锉M可能多地溶解于溶液中過濾含有DNA的氯化鈉溶液取1個(gè)100 mL燒杯，用放有兩層紗布的漏斗過濾步驟5中的溶液。取其濾液，DNA溶于濾液中提取含雜質(zhì)較少的DNA在上述濾過的溶液中，加入冷卻的、酒精的體積分?jǐn)?shù)為 95的溶液 50mL（使用冷卻的酒精，對(duì)DNA的凝集效果較佳），并用玻璃棒攪拌，溶液中會(huì)出現(xiàn)含雜質(zhì)較少的絲狀物。用玻璃棒將絲狀物卷起，并用濾紙吸取上面的水分。這種絲狀物的主要成分就是DNA答：因?yàn)镈NA不溶于冷酒精，而其他物質(zhì)可以溶解在酒精中，使含雜質(zhì)較少的DNA絲狀物可以析出,懸浮于溶液中討論：（2

13、）觀察絲狀物呈什么顏色？答：白色（1）為什么要加50mL的冷酒精？取兩支20 mL的試管，各加入氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為0015 molL的溶液5 mL，將絲狀物放入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向兩支試管中各加入4mlL的二苯胺試劑?；旌暇鶆蚝?，將試管置于沸水中加熱 5 min，待試管冷卻后，觀察并且比較兩支試管中溶液顏色的變化 DNA的鑒定討論：答：有絲狀物的試管變成藍(lán)色，另一試管還是原來顏色（2）這一鑒定結(jié)果說明什么問題？（1）比較兩個(gè)試管中溶液的顏色有什么不同？答：提取出的絲狀物是DNA（3） DNA的直徑約為2010-10 m，實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的絲狀物的粗細(xì)是否表示1個(gè)D

14、NA分子直徑的大?。看穑?DNA分子直徑只有2 nm。絲狀物是多個(gè)DNA子聚在一起形成的 答：整個(gè)實(shí)驗(yàn)共“兩次蒸餾水，三次過濾，兩次析出，六次攪拌”6、討論：兩次蒸餾水第一次：細(xì)胞吸水脹破 第一步第二次：使 DNA黏稠物析出 第三步（1）此實(shí)驗(yàn)過程中有幾次使用蒸餾水？幾次過濾，幾次析出，幾次攪拌？分別在哪一步？過濾時(shí)使用的紗布層數(shù)與需用濾液或黏稠物有關(guān)，第二次要用其濾出的黏稠物有關(guān)，所以要使用多層紗布，第一次和第三次均要用其濾液，使用的紗布為12層三次過濾第一次： DNA存在于濾液里 第一步第二次： DNA被留在紗布上 第四步第三次： DNA存在于濾液里 第六步兩次析出第一次：用0.14 mo

15、lL 的NaCI溶液含雜質(zhì)多第三步第二次：用冷卻的95的酒精第七步六次攪拌：第一、二、三、五、七步其中除第八步外，其余均要朝一個(gè)方向攪拌，在第三、五步攪動(dòng)還要輕緩，玻璃棒不要直插燒杯底部，這樣才能保證得到完整的DNA（2）為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)？答：用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過反復(fù)溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)（二）案例二：以菜花為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行DNA的粗提取1、課前準(zhǔn)備將新鮮菜花和體積分?jǐn)?shù)為95的乙醇溶液放入冰箱冷凍室24 h2、提取DNA的具體步驟取材：

16、稱取30 g菜花，去梗取花，切碎研磨：將碎菜花放入研缽中，倒入10 mL研磨液，充分研磨10 min研磨液的配制方法如下：將10.1 g Tris加入到50 mL蒸餾水中，使其溶解，然后，用2 moL/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，再加入8.76 g NaCl 、37.2 g EDTA 、20 g SDS。待上述藥品全部溶解后，再用蒸餾水定容至1 000 mLTris/HCl:提供緩沖體系，DNA在這一體系中呈穩(wěn)定態(tài)（Tris為三羥甲基氨基甲烷）EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）：是DNA酶的抑制劑，可以防止細(xì)胞破碎后DNA酶降解DNASDS（十二烷基磺酸鈉）：可以使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離過濾：在漏斗中墊上尼龍紗布，將菜花研磨液過濾到燒杯中(有條件的學(xué)校可將濾液倒入塑料離心管中進(jìn)行離心，用1000 r/min的轉(zhuǎn)速，離心25 min，取上清液放入燒杯中)。在4 冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液沉淀：將一倍體積的上清液倒入兩倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95的預(yù)冷乙醇溶液中，并用玻璃棒緩緩、輕輕地?cái)嚢枞芤?玻璃棒不要直插到燒杯底部)。沉淀35 min后，可見白色的DNA絮狀物出現(xiàn)。用玻璃棒緩緩旋轉(zhuǎn)，將絮狀物纏繞在玻璃棒上觀察你提取的DNA顏