《生物制藥工藝學(xué)》課件02

1、第二章 生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)Basis of biopharmaceutical technology 一、生物材料的選擇：1生物活性物質(zhì)存在部位：胞內(nèi)、胞外、胞漿、質(zhì)膜、器膜、周質(zhì)2生物材料的采集與質(zhì)控 （1）品種鑒定；（2）防止污染與感染； （3）選擇富集目的物材料；（4）冷凍保存第一節(jié)生物藥物提取、分離、純化技術(shù)基礎(chǔ)二、生物活性物質(zhì)物質(zhì)常用的提取方法與優(yōu)化（一）幾種常用提取方法 1酸、堿、鹽水溶液提取方法 2表面活性劑提取方法與反膠束提取方法 3有機(jī)溶劑提取 4. 雙水相萃取法 5超臨界萃取法（二）提取方法與優(yōu)化1.溶劑選擇2.選擇添加劑 保護(hù)劑； 酶抑制劑3.提取條件 溫度； pH；

2、鹽； 表面活性劑三濃縮與干燥 1.濃縮方法： 鹽析； 有機(jī)溶劑沉淀； 高分子脫水 超濾； 真空濃縮或薄膜濃縮； （書P45頁）2.干燥：低溫真空干燥；噴霧干燥；冷凍干燥（書P47頁）四、分離純化1.生化制藥工藝中分離純化特點(diǎn): (1) 生物材料組成復(fù)雜 (2) 目的物含量低 (3) 易變性、失活 (4) 分離方法有很大經(jīng)驗(yàn)成分 (5) 步驟多，逐級分離 (6) 產(chǎn)品驗(yàn)證與化學(xué)上純度概念不完全相同(書P49頁)2. 分離純化原理 P49頁 (1)根據(jù)分子形狀與分子大小 (2)根據(jù)電荷差異 (3)根據(jù)分子極性與溶解度大小 (4) 根據(jù)吸附特性 (5) 根據(jù)生物配基特性3. 選擇原則（1）粗品分離：

3、大處理量,相對低分辨率 鹽析，分級沉淀，萃取，超濾（2）精制：高分辨率 多種色譜層析法,親和層析，HPLC，F(xiàn)PLC，電泳或等電聚焦 第二節(jié) 微生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)一、菌種的選育與保藏1自然選育 依據(jù)自發(fā)突變原理，通過不斷分離篩選，除去衰變菌落，選擇高產(chǎn)菌，達(dá)到強(qiáng)化、復(fù)壯、穩(wěn)定生產(chǎn)目的。 方法：（1）平板劃線法 （2）稀釋平板法2誘變育種（1）出發(fā)菌株的選擇 :穩(wěn)定性; :具備某種優(yōu)良性狀的菌株 :對誘變劑敏感; :生理狀態(tài)及生長時間（2）誘變處理: 化學(xué)誘變；物理誘變;生物誘變（3）篩選： 隨機(jī)篩選；半理性化篩選突變株篩選一般進(jìn)程如圖所示 第三第四輪同第二輪第三第四輪同第二輪3、現(xiàn)代菌種選育

4、技術(shù) ：雜交育種 ：原生質(zhì)體融合 ：基因工程技術(shù) (P55頁)3菌種保存（1）保存目的：防止退化（2）菌種退化檢查方法（3）菌種退化防止方法 防止基因突變：如低溫保藏 采用雙重缺陷型 制作平行的菌種斜面，少傳代 分離單菌落，自然篩選 選擇培養(yǎng)條件（4）菌種保藏方法： 斜面低溫保存 液體石蠟封藏法 甘油冷凍法 冷凍干燥法 液氮保藏法二、發(fā)酵工程技術(shù)基礎(chǔ)發(fā)酵工程：單細(xì)胞純培養(yǎng)工業(yè)化過程，以產(chǎn)生大量目的物。1液體培養(yǎng)深層發(fā)酵2固體培養(yǎng)淺盤培養(yǎng)發(fā)酵設(shè)備：空壓機(jī)、種子罐、發(fā)酵罐，蒸汽發(fā)生器、空氣過濾器、離心機(jī)及多種參數(shù)控制與檢測設(shè)備，以L-Lys生產(chǎn)設(shè)備為例，見圖1所示。圖1 L-Lys生產(chǎn)過程工藝設(shè)備

5、圖 第三節(jié) 生物技術(shù)藥物制造技術(shù)基礎(chǔ)一、重組DNA技術(shù)原理1基因工程操作過程：（1）獲得目的基因；（2）構(gòu)建DNA重組體；（3）將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞；（4）工程菌的克隆與鑒定；（5）目的基因擴(kuò)增與蛋白表達(dá)。2基因工程藥物制造過程二、基因工程主要操作技術(shù)1目的基因的獲得（1）cDNA文庫 純化目的mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA mRNA的分離 cDNA第一鏈的合成 cDNA第二鏈的合成 cDNA與載體連接 轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化 篩選目的克隆目的基因的獲得：cDNA文庫（2）PCR法或逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR） 典型PCR反應(yīng)包括 模板變性 94以上（12） 退火 5055（12） 延伸 72（12） 在高溫

6、聚合酶作用下， 以DNA單鏈為模板， 由引物起始從53 延伸。（3）化學(xué)合成法 在已知DNA序列或多肽的一般結(jié)構(gòu)時，如鏈長在 60bp100bp可用化學(xué)合成法直接合成DNA。2DNA重組體的構(gòu)建 根據(jù)宿主菌不同，選擇基因載體（Vector）（1）E.coli質(zhì)粒非表達(dá)型 pBR322，表達(dá)型pUC，實(shí)用型pBV220，PET系統(tǒng)，噬菌體DNA作為載體，非表達(dá)型gt10，表達(dá)型gt11。（2）芽孢桿菌 pUB110 pE194和pC194（3）鏈霉菌 pIJ101 pSG5 cDNA與載體連接方法 同聚尾連接法 人工接頭連接法3重組體的表達(dá)系統(tǒng)（1）原核表達(dá)系統(tǒng) E.coli；芽孢桿菌Bacil

7、lus；鏈霉菌Streptomyces 優(yōu)點(diǎn)：易大量生產(chǎn)，成本低，周期短 缺點(diǎn)：多為胞內(nèi)表達(dá)、提取困難，易生成包含體、含起始密碼Met(AUG)，有內(nèi)毒素毒性（2）真核表達(dá)系統(tǒng) 酵母表達(dá) 畢赤酵母（pichia psatoris）受甲醇誘導(dǎo) 優(yōu)點(diǎn)：易培養(yǎng)無毒性，易高密度發(fā)酵（100g/L），高表達(dá)，成本低，產(chǎn)物可糖基化，有分泌表達(dá)。 動物細(xì)胞 哺乳動物細(xì)胞CHO（倉鼠細(xì)胞） 昆蟲細(xì)胞家蠶細(xì)胞4表達(dá)產(chǎn)物的純化包含體 inclusion bodies: 大部分是表達(dá)產(chǎn)物，（還有細(xì)胞蛋白和膜蛋白）一級結(jié)構(gòu)正確、無活性，不溶于水，可用變?nèi)軇㏒DS尿素，鹽酸胍溶解，再稀釋透析除去變性劑，使其復(fù)性。 為防

8、止或減少包含體的形成常用方法： （1）降低培養(yǎng)溫度 從37降到30可顯著降低包含體形成率。 （2）以硫氧還原蛋白為載體進(jìn)行融合表達(dá)。 硫氧還原蛋白是E.coil的一種同源蛋白，定位于粘附區(qū)，富含-SH,可保目的蛋白不發(fā)生分子錯誤折疊，是一種熱穩(wěn)定蛋白，表達(dá)產(chǎn)物聚集于粘附區(qū)，通過振擾提取使產(chǎn)物進(jìn)入介質(zhì)中，再酶解就得到目的蛋白。三、酶工程制藥技術(shù)基礎(chǔ)1、酶工程(enzyme engineering) 研究內(nèi)容（1）酶的發(fā)現(xiàn)、分離純化與生產(chǎn)應(yīng)用。（2）酶與細(xì)胞的固定化技術(shù)與酶反應(yīng)器。（3）生物酶工程：以基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)研究酶工程。（4）抗體酶、模擬酶 合成酶及酶的人工設(shè)計(jì)。（書P102）

9、2、固定化酶(immobilized enzyme)（1）固定化穩(wěn)定性提高（2）可重復(fù)使用、提高使用效率、降低成本（3）提高強(qiáng)度，便于連續(xù)、自動、規(guī)?；a(chǎn)（4）便于產(chǎn)物的分離、純化共價鍵結(jié)合酶固定化間歇可溶交聯(lián)包埋吸附間歇連續(xù)酶的固定化技術(shù)和固定化酶3、制備方法：（1）吸附法：分為物理吸附法和離子交換吸附法（2）包埋法：將酶或細(xì)胞定位于凝膠高聚物網(wǎng)絡(luò)中，如卡拉膠，海藻膠，聚丙烯酰胺（3）共價鍵結(jié)合法：酶分子與載體分子，通過化學(xué)偶聯(lián)使酶與載體共價結(jié)合。（4）交聯(lián)法：用雙功能試劑 將酶與載體交聯(lián)固定化 圖: 酶固定化方法示意1. 離子結(jié)合 2.共價結(jié)合 3.交聯(lián)4. 聚合物包埋 5. 疏水作用6

10、. 脂質(zhì)體包埋 7. 微膠囊第四節(jié) 生物制藥工藝中試放大設(shè)計(jì)一、中試放大目的與規(guī)模1目的：（1）建立穩(wěn)定工藝、大批量制備足量合格產(chǎn)品，供應(yīng)臨床前與臨床研究；（2）研究工藝參數(shù)制定工藝規(guī)程和檢定規(guī)程，為正式生產(chǎn)提供工藝參數(shù)，保證能在以后生產(chǎn)中應(yīng)用。2規(guī)模： 中試是由小試轉(zhuǎn)入工業(yè)化生產(chǎn)的過渡性研究，是取得成功產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵。3、中試放大時應(yīng)具備的條件 （1）有穩(wěn)定的工藝：收率，質(zhì)量可靠 （2）操作條件基本確立 （3）已建立中間品和成品分析方法 （4）生物材料已鑒定 （5）物料平衡、三廢處理已基本解決 （6）中試規(guī)模、產(chǎn)品產(chǎn)量，規(guī)模已確定 （7）安全生產(chǎn)已有方案4中試放大要解決的問題（1）原輔材料規(guī)格

11、 （2）設(shè)備選型與材質(zhì)選用 （3）反應(yīng)條件（4）原輔料中間品、產(chǎn)品質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)與檢定方法（5）下游工藝優(yōu)化與穩(wěn)定制造規(guī)程的制定二中試放大方法與總結(jié)內(nèi)容1、放大方法 （1）經(jīng)驗(yàn)放大 （2）相似放大 （3）數(shù)學(xué)模型放大2、總結(jié)內(nèi)容：（1）確定工藝路線，優(yōu)化工藝條件，制定制造規(guī)程。（2）制定崗位操作、投產(chǎn)（3）進(jìn)行材料衡算（4）安全生產(chǎn)與處理（5）原輔料及產(chǎn)品質(zhì)控方法與標(biāo)準(zhǔn)測定。（6）產(chǎn)品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)制定（7）消耗定額，成本核算，工時，生產(chǎn)周期計(jì)算。 第五節(jié) 生物制藥工藝技術(shù)若干進(jìn)展一、21世紀(jì)的熱門生物技術(shù) 1組合生物合成 組合生物合成(combinatorial biosynthesis)或組合生物學(xué)(

12、combinatorial biology)是指應(yīng)用基因重組技術(shù)重新組合微生物藥物的基因簇,產(chǎn)生一些新的非天然的基因簇,從而合成許多新的非天然的化合物,為生物藥物的篩選提供豐富的化合物資源 微生物藥物通常是由非常簡單的化學(xué)物質(zhì), 如小分子羧酸或某些氨基酸作為合成起始單位和延伸單位合成的, 參與合成的酶為一系列基因編碼的多酶體系 (構(gòu)成一個合成途徑) 。研究表明, 參與這類小分子生物合成的基因通常是連鎖或鄰接而構(gòu)成一個基因簇(cluster) , 這為基因的克隆和操作提供了方便, 同時由于參與次級代謝生物合成酶系對底物的特異性, 專一性要求不是很嚴(yán)格的, 對結(jié)構(gòu)相類似的底物均可識別, 這一特點(diǎn)為

13、不同基因組合產(chǎn)生新的化合物創(chuàng)造了條件。組合生物合成技術(shù)在藥物研發(fā)中的應(yīng)用酮基合成酶(KS)、?；D(zhuǎn)移酶（AT）、脫氫酶（DH）、烯醇還原酶（ER）、酮基還原酶（KR）和?；d體蛋白（ACP）等功能域組合生物合成技術(shù)示意圖酶 1酶 2酶 3化合物 A B C D酶1 基因酶2 基因酶3 基因基因克隆AD質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至宿主菌酶或蛋白質(zhì) 2藥物基因組學(xué) 是一門研究個人的基因遺傳如何影響身體對藥物的反應(yīng)的一門科學(xué)。由對基因的研究發(fā)現(xiàn)帶有某種特定基因的人，會對某種特定的藥物成份，產(chǎn)生某種特定的反應(yīng)。將這個基因、藥物成份與服用后反應(yīng)的一連串關(guān)聯(lián)，運(yùn)用在用藥之上，就可以知道帶有某特定基因之人，不適合服用含有某特

14、定成份的藥物，進(jìn)而降低藥物副作用產(chǎn)生的風(fēng)險；反之，也可以知道帶有某特定基因之人，特別適合服用含有某特定成份的藥物，進(jìn)而提升治愈疾病的機(jī)率 3藥物蛋白質(zhì)組學(xué) 4蛋白質(zhì)工程 5基因治療與基因疫苗 6糖基化工程 7先導(dǎo)物高通量篩選與藥物合理設(shè)計(jì)（rational drug design） 8核酶、抗體酶、干擾RNA 9藥物生物信息學(xué) 10功能抗體與人工智能技術(shù)和虛擬人技術(shù)二、蛋白質(zhì)工程與蛋白質(zhì)的分子設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)工程： 在基因水平上設(shè)計(jì)表達(dá)新的功能蛋白 1產(chǎn)品的特點(diǎn) （1）改善穩(wěn)定性 （2）提高生物活性 （3）延長體內(nèi)半衰期 （4）降低免疫原性2蛋白質(zhì)工程研究基本程序3基因改造技術(shù)（1）基因定點(diǎn)突變技術(shù) （2）DNA改造技術(shù)（DNA Shuffling）（3）定向進(jìn)化技術(shù)(directed evolution)（4）融合蛋白表達(dá)（5）改變糖基化位點(diǎn)三、蛋白組學(xué)1蛋白質(zhì)組學(xué)：研究細(xì)胞、組織或個體全部蛋白質(zhì)的表達(dá)狀態(tài)與功能狀態(tài)是后基因組時代的重要研究方向，我國已承擔(dān)肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)的10%研究工作。2其研究平臺，包括四大部分（1）樣品制備；（2）雙向電泳；（3）成象分析；（4）自動切取蛋白及微量質(zhì)譜分析，信息處理。 雙向電泳工作流程如下： 3應(yīng)用：（1）鑒定與疾病相關(guān)的專一性蛋白（2）候選靶點(diǎn)的鑒定與確立（3）藥物作用靶點(diǎn)與藥物作用