《生物化學(xué)》本科課件第14章+核酸物理化學(xué)性質(zhì)

1、第14章 核酸物理化學(xué)性質(zhì)一、核酸的水解 酸、堿、酶水解作用于磷酸二酯鍵和糖苷鍵DNA/RNA對酸/堿的耐受程度有差別糖苷鍵比磷酸酯鍵更易被酸水解；嘌呤堿比嘧啶堿的糖苷鍵對酸更不穩(wěn)定；對酸最不穩(wěn)定的：嘌呤與脫氧核糖間糖苷鍵（一）酸水解DNA:pH2.8、100加熱1h，或pH1.6，37 對水透析可除去嘌呤堿形成無嘌呤酸（apurinic acid，APA）（二）堿水解RNA磷酸酯鍵被水解生成2/3 -核苷酸DNA則不受影響脫氧核糖無2OH，不能形成堿水解中間產(chǎn)物DNA在1mol/LNaOH中加熱至1004h，可得到小分子的寡聚脫氧核苷酸。（三）酶水解磷酸二酯鍵1、酶分類 根據(jù)底物分為： DN

2、ase、RNase 根據(jù)作用方式：核酸外切酶 從一端（3/5）逐個水解核酸內(nèi)切酶 從中間開始在某個位點切斷按照作用的化學(xué)鍵 磷酸二酯酶（phosphodiesterase） 斷3-OH形成的酯鍵 5-磷酸核苷 斷5-OH形成的酯鍵 3-磷酸核苷 磷酸單酯酶（phosphomonoesterase） 切去核酸分子末端磷酸基 及核苷酸的磷酸基其它：對底物二級結(jié)構(gòu)的專一性 雙鏈酶：作用于雙鏈核酸 單鏈酶：作用于單鏈核酸+PyPyPyPyPyPyPuPuPPPPPPPPPP2H2O2、RNase （1）牛胰核糖核酸酶（RNase ）作用：嘧啶核苷3磷酸與其它核苷酸連鍵 專一性極高的內(nèi)切酶產(chǎn)物： 3嘧啶

3、核苷酸/其結(jié)尾的寡核苷酸PPPPPPP2H2OPP+OHOHPPPPPGAGAAAGGCUUC （2）核糖核酸酶T1 （RNase T1）作用：3鳥苷酸與相鄰核苷酸5OH連鍵產(chǎn)物：3鳥苷酸或以其為末端的寡核苷酸（3）核糖核酸酶T2 （RNase T2 ） 作用位點為Ap殘基 可將tRNA完全降解為3腺苷酸結(jié)尾的寡核苷酸DNase：牛胰脫氧核糖核酸酶 Mg2+激活、檸檬酸鹽抑制 切斷雙鏈或單鏈DNA 以5磷酸為末端的寡聚核苷酸 DNase ：牛脾脫氧核糖核酸酶 Na+激活；Mg2+抑制 3磷酸為末端的寡聚核苷酸，平均長度為6核苷酸。3、DNase鏈球菌脫氧核糖核苷酸酶： 內(nèi)切酶，作用于DNA，

4、Mg2+激活 產(chǎn)物為5磷酸為末端的碎片，長度不一。限制性內(nèi)切酶(細(xì)菌) 主要降解外源DNA 具嚴(yán)格的堿基序列專一性是基因工程最重要的工具酶。 EcoR命名原則 E：大腸桿菌E.coli屬名 co：種名的頭兩個字母 R：大腸桿菌的菌株 ：該細(xì)菌中已分離出的這類酶的編號例如EcoR I ，需Mg離子，不需ATP，專一性強，能識別DNA鏈上6個堿基組成的回文序列，交錯切割，形成粘性末端產(chǎn)物。GAATTC CTTAAG GCTTAAAATTC G限制性內(nèi)切酶通常與甲基化酶成對存在：具有相同的底物專一性，識別相同堿基序列。 甲基供體：S腺苷甲硫氨酸 甲基受體：DNA上的A與C甲基化使細(xì)菌自身的DNA帶上

5、標(biāo)記,限制性內(nèi)切酶專用于降解外來入侵的異種DNA 非特異性的糖苷酶 堿基特異N糖苷酶水解糖苷鍵4、N糖苷酶二、核酸的酸堿性質(zhì)具有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)特點能發(fā)生酮式/烯醇式、氨式/亞氨式互變嘌呤和嘧啶堿基都具有弱堿性 _主要是環(huán)內(nèi)氨基的貢獻(xiàn)1、堿基的解離二 胞嘧啶中 尿嘧啶及胸腺嘧啶中鳥嘌呤和次黃嘌呤中質(zhì)子則結(jié)合到N7上腺嘌呤中，質(zhì)子結(jié)合于N1上2、核苷的解離戊糖可增強堿基的酸性解離核糖中的羥基也可發(fā)生解離3.核苷酸的解離磷酸基使核苷酸具有很強的酸性DNA等電點為44.5；RNA等電點為22.5三、核酸的紫外吸收 堿基含有共軛雙鍵最大吸收峰260nm左右 可用紫外分光光度計加以定量和定性。OD260的應(yīng)用

6、：1.判斷核酸樣品的純度DNA純品: OD260/OD280 = 1.8RNA純品: OD260/OD280 = 2.0含雜蛋白及苯酚，降低2. 純DNA或RNA的紫外分光定量 OD260=1.0相當(dāng)于50g/ml雙鏈DNA40g/ml單鏈DNA（或RNA）20g/ml寡核苷酸有些核酸溶液紫外吸收以摩爾磷的吸光度來表示，摩爾磷即相當(dāng)于摩爾核苷酸。 ：摩爾吸光系數(shù) A：吸收值 W：每升溶液磷重量 L ：比色杯內(nèi)徑天然DNA的(P）一般為6600 RNA的(P）一般為77007800核酸的(P）值較所含核苷酸單體的(P）要低40%45%；單鏈多核苷酸的(P）值比雙螺旋結(jié)構(gòu)多核苷酸(P）值要高。所以

7、在DNA的變性過程中，摩爾吸光系數(shù)增大約25%，此現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)。在DNA的復(fù)性過程中，摩爾吸光系數(shù)減?。p色效應(yīng)）判斷DNA是否變性四、核酸的變性、復(fù)性與雜交(一) 核酸的變性（denaturation） 1、DNA的變性： 在某些理化因素作用下，DNA雙鏈解開成兩條單鏈的過程。 某些理化因素破壞了氫鍵和堿基堆積力， 使核酸分子高級結(jié)構(gòu)改變、理化性質(zhì)及 生物活性發(fā)生改變。 不涉及磷酸二酯鍵斷裂，一級結(jié)構(gòu)不變2、變性的實質(zhì)降解：核苷酸骨架上3，5 -磷酸二酯鍵的斷裂DNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂 高溫（一般75） 熱變性 強酸、堿 酸堿變性 甲醛（Agarose中RNA ） 尿素（PAG

8、E中DNA ）3、變性因素 OD260增高 粘度下降 比旋度下降 浮力密度升高 酸堿滴定曲線改變生物活性喪失4、變性后理化性質(zhì)變化RNA變性：從螺旋到線團之間的轉(zhuǎn)變RNA的變性引起的性質(zhì)變化沒有DNA明顯完全變性后核酸紫外吸收值增加：天然DNA 2540%、RNA 約1.1%實質(zhì)：堿基暴露由于變性或降解引起紫外吸收增加的現(xiàn)象稱增色效應(yīng)DNA變性5、DNA熱變性的特征變性過程是“躍變式”的，而非漸變解鏈曲線：連續(xù)加熱DNA，以溫度對A260作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。指增色效應(yīng)達(dá)50%時的溫度一般DNA Tm 值在85 - 90 C之間 Tm：DNA變性時，OD260達(dá)到最大值的50%時的溫度

9、稱為DNA的解鏈溫度或融解溫度(Tm)。大小與G+C含量成正比。（1）DNA的均一性：（2）GC含量： 經(jīng)驗公式： XG+C（Tm69.3）2.44（3）介質(zhì)中的離子強度： Tm值大小與下列因素有關(guān)：均一性高，變性的溫度范圍越窄，據(jù)此可分析DNA的均一性 。測定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）2.44P509圖5-19 圖14-5 Tm值與GC含量的關(guān)系不易用稀電解質(zhì)保存DNA(二)核酸的復(fù)性（renaturation）變性DNA在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分開的單鏈重新締合成雙鏈復(fù)性。復(fù)性的程度、速率與復(fù)性條件有關(guān)：熱變性DNA驟然冷卻（淬火）不可能復(fù)性將變性DNA緩慢冷卻（

10、退火）可以復(fù)性熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，這一過程稱為退火(annealing) 。DNA復(fù)性分子量越大復(fù)性越難；濃度越大，復(fù)性越容易；DNA復(fù)性也與它本身組成和結(jié)構(gòu)有關(guān) （具有很多重復(fù)序列DNA，復(fù)性快）。減色效應(yīng)（低色效應(yīng)）復(fù)性時紫外吸收減少的現(xiàn)象用Cot1/2表示復(fù)性的速度Co：代表變性DNA復(fù)性時的初始濃度 t：復(fù)性時間Cot1/2復(fù)性一半所需時間與DNA濃度的乘積單位：mol s/L(三) 核酸的雜交熱變性的DNA單鏈，在復(fù)性時與同源DNA互補鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)；與在某些區(qū)域有互補序列的異源DNA單鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。形成的新分子稱為雜交DNA分子。 DNA單鏈與互補RNA鏈間也

11、可發(fā)生雜交探針（probe）：帶有同位素標(biāo)記或生物標(biāo)記的核酸片段。核酸分子雜交的應(yīng)用：研究DNA分子中某一種基因的位置檢測兩種核酸分子間的序列相似性檢測某些專一序列在待檢樣品中存在與否是基因芯片技術(shù)的基礎(chǔ) Southern雜交 Northern雜交 Western雜交1、 Southern BlottingDNA樣品 酶切 電泳 堿變性 轉(zhuǎn)膜 固定 雜交 洗滌 放射自顯影變性（NaOH 0.5mol/L）轉(zhuǎn)膜（NC膜，尼龍膜）固定（80，4-6h）雜交（高鹽濃度，68，幾小時）Southern Blotting可用于DNA之間同源性分析，確定特異性DNA序列的大小和定位。2、 Northern

12、 Blotting研究對象是RNA，探針一般是DNA?？俁NA或mRNA需在變性條件下電泳（乙二醛、甲醛）3、 Western Blotting抗原與抗體的雜交研究克隆基因表達(dá)產(chǎn)物、鑒定克隆株的常用技術(shù)。測試題1.多核苷酸之間的連接方式是A. 2, 3磷酸二酯鍵 B. 3,5磷酸二酯鍵C. 2 ,5磷酸二酯鍵 D. 糖苷鍵 E. 氫鍵2. DNA合成需要的原料是A. ATP,CTP,GTP,TTP B. ATP,CTP,GTP,UTPC dATP,dCTP,dGTP,dTTP D dATP,dCTP,dGTP,dUTP E dAMP,dCMP,dGMP,dTMP 3. 關(guān)于Watson and

13、 Crick 的DNA雙螺旋模型，那種說法是錯誤的A. 組成雙螺旋的兩條DNA 鏈反向平行B. 堿基對位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)C. 維系雙螺旋結(jié)構(gòu)的作用力主要是堿基堆積力 D. DNA 雙鏈?zhǔn)亲笫致菪?.B; 2,C, 3,D4. DNA和RNA共有的成分是A. D 核糖 B. D 2-脫氧核糖 C. 鳥嘌呤 D. 尿嘧啶 E. 胸腺嘧啶5. DNA和RNA徹底水解后的產(chǎn)物是A. 戊糖相同，部分堿基不同 B. 堿基相同，戊糖不同C. 戊糖相同，堿基不同D. 部分堿基不同，戊糖不同E. 堿基相同，部分戊糖不同6. 核酸具有紫外吸收能力的原因是A. 嘌呤和嘧啶環(huán)中有共軛雙鍵B. 嘌呤和嘧啶中有酮基C. 嘌

14、呤和嘧啶中有氨基 D. 嘌呤和嘧啶連接了核糖 E. 嘌呤和嘧啶連接了磷酸基團4. C; 5. D; 6. A7. 組成核酸的基本單位是A. 嘌呤堿與嘧啶堿 B. 核糖與脫氧核糖 C. 核苷 D. 核苷 酸 E. 寡核苷 酸 8. 在核酸結(jié)構(gòu)中含量較穩(wěn)定的元素是A. C B. H C. O D. N E. P9. tRNA的二級結(jié)構(gòu)為A. 雙螺旋 B. 超螺旋 C. 線形 D. 三葉草形 E. 倒“L”形 10. 堿基互補配對形成的鍵是 維持堿基對之間堆積力的是 核苷酸之間的連接鍵是 核酸分子中紫外吸收較強的鍵是 不利于維持雙螺旋穩(wěn)定的力是 A. 氫鍵 B. 磷酸二酯鍵 C. 范德華力 D. 堿基中的共軛雙鍵 E. 靜電斥力7. D；8.P；9.D；10.A,C,B,D,E11. 假尿嘧啶核苷酸的糖苷鍵是A. C-C 鍵