第十五章-精斑檢驗課件

1、第十五章 精液斑檢驗NSMC XDD1 精液（斑）檢驗是法醫(yī)學(xué)鑒定實踐中的一項重要內(nèi)容，與血痕檢驗占有同等重要地位，特別是對有關(guān)性犯罪或有性犯罪嫌疑的案件，以及對死亡性質(zhì)不明的女尸檢查，精液（斑）的檢驗尤為重要。 精液（斑）的法醫(yī)學(xué)鑒定，可為判斷案件性質(zhì)、劃定偵查范圍、認(rèn)定或排除犯罪嫌疑人提供重要線索。在親子鑒定或其它有關(guān)性功能鑒定中，有時需對新鮮精液進(jìn)行檢驗。2精液: 男性各附屬性腺分泌物所形成的復(fù)雜混合物，精囊液約占5080，前列腺液占1530，尿道球腺液，尿道旁腺液約占5。精液斑： 精液浸潤或附著于基質(zhì)上，干燥后形成的斑痕。第一節(jié) 概述34男性附屬性腺分泌物的混合液，輸送精子，為精子提供

2、營養(yǎng)，激發(fā)精子活力等。 精子 精液 精漿 男性生殖細(xì)胞，含親代遺傳物質(zhì)，由睪丸產(chǎn)生，每次射精大概有0.6-2億個精子。5精液理化分析細(xì)胞成分：精子、睪丸細(xì)胞、白細(xì)胞、脫落柱狀上皮細(xì)胞等非細(xì)胞成分（90%是水）： 無機(jī)物：水、鹽類、金屬離子（鋅） 有機(jī)物 糖類（果糖）、脂類、黃素、精胺、卵磷脂共有蛋白:白蛋白、酸性磷酸酶(ACP)等特有蛋白:PSA、DIA3等精液功能蛋白：凝固酶、中性蛋白酶和纖溶酶等6精子的形態(tài)特點 正常精子分頭、體、尾三部分，長約60m，外形似蝌蚪,頭部長35m，寬23m,厚l2m,正面觀呈卵圓形，側(cè)面觀呈梨形，主要由頂體和致密的精子細(xì)胞核組成。細(xì)胞核，致密，重要成分是DNA

3、空泡狀，含多種水解酶和糖蛋白線粒體鞘7精子產(chǎn)生過程凝固酶（精囊腺）5min內(nèi)凝固成較凍狀 中性蛋白酶及纖溶酶（前列腺）20-30min內(nèi)液化成稀薄半流動體8精斑檢驗的目的：為案件偵查和審理提供線索和證據(jù)。需解決的問題：斑痕是否為精斑？若是精斑，確定精斑的個體來源。精斑檢驗程序：肉眼檢驗預(yù)試驗確證試驗個人識別9第二節(jié) 精液斑的肉眼檢查精斑的形態(tài)： 無固定形態(tài)，外觀常因附著物不同而有差異，在軟質(zhì)載體，如衣褲、紙張、床單上等，手觸之有硬感，新鮮精斑有特殊腥氣味。 典型的精斑呈不規(guī)則地圖狀，在深色紡織品上呈灰白色漿糊狀斑跡；在淺色紡織品上，多呈黃白色地圖狀，邊緣色深。10床單上精液斑11精斑的分布：

4、多附著于犯罪嫌疑人或被害人的衣褲、女性外陰部、大腿內(nèi)側(cè)、腹壁，偶見口腔內(nèi)、肛門。現(xiàn)場的被褥、草席、床板、毛巾、紙張、沙土、丟棄的避孕套等。此外，陰道擦拭物也是常見的精斑檢材。12尸體上的精斑13強(qiáng)奸殺人現(xiàn)場遺留紙團(tuán)14紫外輔助檢查：原理：精斑中的黃素在紫外線下呈銀白色熒光，斑痕邊緣呈淺紫藍(lán)色特點：對檢材無污損、無破壞，不影響進(jìn)一步檢驗特異性差（干擾物：陰道液、尿液、唾液、某些色素染料）作用：僅能為進(jìn)一步檢驗提供可疑部位結(jié)果分析：陽性僅表明可能是精斑，陰性不能輕易否定精斑151617床上的精斑在紫外燈下18 肉眼檢驗的意義：發(fā)現(xiàn)可疑精斑，確定部位和分布情況，以便準(zhǔn)確取材。19第三節(jié) 精液斑的預(yù)試

5、驗性質(zhì)：篩選試驗 磷酸苯二鈉試驗 酸性磷酸酶試驗 -磷酸萘酚-固藍(lán)B試驗方法： 其它：碘化碘鉀結(jié)晶試驗、苦味酸結(jié)晶試 驗、鋅檢出法等特點：方法簡便易行，靈敏度高，但特異性差20實驗依據(jù)：精斑中的酸性磷酸酶含量高：約是其他臟器的100倍；也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于動物精液及其他動、植物組織中的含量，但猴與人相似。來源于前列腺精斑中酸性磷酸酶穩(wěn)定性好： 抗腐敗-常溫保存10年、夏季室溫8周腐敗； 耐高熱-125加熱30min仍可檢出活性。 一、酸性磷酸酶檢驗(acid phosphatase, ACP)21磷酸苯二鈉試驗(Kind-King法)原理： 精液中的酸性磷酸酶可分解磷酸苯二鈉，產(chǎn)生萘酚，后者經(jīng)鐵氰化鉀作

6、用并與氨基安替比林結(jié)合，生成紅色醌類化合物。2223方法： 取可疑斑痕0.10.1cm（最好取斑痕邊緣部位）置試管內(nèi)，加緩沖液3-4滴，37溫箱內(nèi)5-10分鐘后，加等量顯色液。結(jié)果判定： 陽性：立即出現(xiàn)紅色，表明檢材可能是精斑。 陰性：呈橙黃色，表明檢材不是精斑或ACP被破壞。24由左至右：強(qiáng)陽性、陽性、弱陽性、陰性25注意事項：應(yīng)同時剪取無斑痕處檢材及已知精斑作陰性和陽性對照。被水洗過淡質(zhì)精斑，應(yīng)適當(dāng)延長緩沖液浸泡時間。懷疑為假陽性，可適當(dāng)加溫或延長放置時間。試驗靈敏度高（剪取檢材順序：先空白、次可疑精斑、最后已知精斑）特異性較差。26-磷酸萘酚-固藍(lán)B試驗原理：-磷酸萘酚 -萘酚 偶氮化合

7、物（紫紅色）特點：靈敏度好，特異性差陰道液等可能呈陽性反應(yīng)。ACP固藍(lán)B27 人精液中含有一些成分，與不同試劑結(jié)合，能形成一定形態(tài)的結(jié)晶體，據(jù)此可推測精斑的存在。 但形成結(jié)晶體非精液斑所特有，人體其它器官（肝腎）等浸出液以及其它分泌液（陰道液、尿液）等也可形成類似結(jié)晶。同時，精液斑受到尿液、血液等污染時，則不出現(xiàn)陽性反應(yīng)。結(jié)晶試驗靈敏度低、特異性差，僅作為指向?qū)嶒灐?二、結(jié)晶試驗28過碘膽堿2930苦味酸結(jié)晶試驗原理：精素分解產(chǎn)物與苦味酸生成精素苦味酸結(jié)晶（青黃色有折光的十字、柱、星形結(jié)晶） 特點：動物精液一般不出現(xiàn)陽性。3132三、鋅檢出法 原理： 人體組織和體液中精液含鋅量最高，精液中的鋅

8、主要來自前列腺，此法適用于無精子精斑。 特點： 特異性很高，除乳汁（稀釋后陰性），其它分泌物、體液、排泄物均呈陰性?；烊胙E不影響結(jié)果。33 預(yù)試驗注意：除酸性磷酸酶檢驗外，其他各項試驗靈敏度均不高，預(yù)試驗陰性的檢材有時仍需進(jìn)行確證試驗。精斑不一定要經(jīng)過預(yù)試驗后才進(jìn)行確證試驗，可剪取肉眼可見的斑痕直接進(jìn)行確證試驗。34第四節(jié) 精斑的確證試驗 精斑的確證試驗是檢驗精斑中的特有成份，其陽性結(jié)果可以確證精斑。主要有三類方法：精子檢出、免疫學(xué)檢驗和生物化學(xué)檢驗。35一、精子檢出法顯微鏡下觀察到典型精子，即能確證人精斑。檢出精子是認(rèn)定精斑最簡便、最可靠的方法，可被法醫(yī)實驗室廣泛采用。精子具有典型而穩(wěn)定的

9、形態(tài)，不易受其他因素影響而改變。在精斑中的精子形態(tài)相當(dāng)穩(wěn)定，十余年的陳舊精斑也可能查見精子。鏡下觀察精子是無色的，一般情況下精子頭部有折光，尾部很細(xì)。36正常未經(jīng)染色精子形態(tài)373839上清：抗人精沉淀試驗；中和試驗精斑檢材的處理：沉渣：涂片，染色，檢驗精子40藻紅染色法： 精子頭部和尾部均染成紅色。亞甲藍(lán)染色法： 精子頭后部染成深藍(lán)色，頭前部、尾部不著色或淺染。41亞甲藍(lán)染色精子42HE染色法： 蘇木素染液 0.5伊紅染液 1鹽酸酒精溶液鏡檢：精子頭前半部不著色或淺染，后半部呈藍(lán)色，尾部紅色43酸性品紅亞甲基藍(lán)染色法鏡檢：精子頭部呈紅色，尾部呈藍(lán)色44性交后精子存活時間：陰道 3-8h宮頸

10、2-5天子宮、輸卵管 1-10天在性犯罪案件中，取陰道試子的時間越早越好，提取部位為陰道后穹窿。45精斑陳舊、取材部位不準(zhǔn)或遇到少精子癥者，只要找到一個完整的典型精子，即能確證人精斑。精子尾部斷落，常只檢見精子頭部，應(yīng)與陰道滴蟲、酵母菌等鑒別。典型的精子頭部呈橢圓形，著色特殊。若發(fā)現(xiàn)幾個典型的精子頭部也可確證為精斑。464748二、免疫學(xué)試驗優(yōu)點:靈敏度高適用于輸精管結(jié)扎術(shù)者和精子缺乏癥患者的精斑方法：抗人精血清沉淀反應(yīng) 膠體金法 前列腺特異性抗原的檢測 ELISA法49抗人精血清沉淀反應(yīng)原理： 用特異性抗人精液血清與可疑精斑檢材浸液作沉淀反應(yīng)，出現(xiàn)肉眼所見白色沉淀為陽性反應(yīng)，證明檢材含有人精

11、液方法：環(huán)狀沉淀反應(yīng)，瓊脂雙向擴(kuò)散試驗，對流免疫電泳注意：用已知人精斑作陽性對照，檢材無精斑部位作陰性對照5051前列腺特異性抗原p30的檢測 前列腺特異性抗原（prostate specific antigen, PSA）又稱-精漿蛋白，由人類前列腺上皮細(xì)胞所分泌，是成年男子精漿中特有的一類糖蛋白，分子量30 000，故名p30，性質(zhì)穩(wěn)定，是確證精液斑的理想標(biāo)記。常用檢測方法有免疫膠體金法和ELISA。 抗-p30血清具有高度的種屬特異性和前列腺器官特異性，靈敏度和準(zhǔn)確性均高于精子檢出法，不受精液中無精子的影響。52（一）膠體金法 原理及方法與膠體金法確證血痕一樣，不同的是精斑確證試驗?zāi)z體金

12、標(biāo)記的是鼠抗人p30單克隆抗體，檢測線包被另一種鼠抗人p30單克隆抗體；質(zhì)控線包被羊抗鼠IgG抗體。53（二）ELISA法54三、其它確證精斑方法乳酸脫氫酶-X：僅出現(xiàn)于人精子微量元素檢測法抗人精子單克隆抗體免疫組化法55第五節(jié)精斑的個人識別血型：ABO系統(tǒng)等血清型：維生素結(jié)合蛋白（DPB）、Km、Gm等酶型：PGM1, 巖藻糖苷酶、黃遞酶等DNA分析：VNTR, STR, Y-STR等選擇原則： 良好的遺傳多態(tài)性；較穩(wěn)定；檢測方法標(biāo)準(zhǔn)化、簡單、結(jié)果重復(fù)性好。測定精液斑中的遺傳標(biāo)記：56（一）精斑的ABO血型測定 分泌型：分泌液與體液中檢出ABH抗原 人體液、分泌液中的ABH血型物質(zhì)是糖蛋白，

13、以水溶性形式存在，而分泌型精液中的ABH血型物質(zhì)的含量比紅細(xì)胞中多且耐熱，非分泌型精液中ABH血型物質(zhì)含量少，常規(guī)方法不易檢出。571.吸收試驗2.解離試驗3.中和試驗 精斑中的水溶性ABH物質(zhì)能與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合，使抗體與指示紅細(xì)胞的凝集反應(yīng)能力降低或完全消失，紅細(xì)胞不凝為陽性反應(yīng)，證明精斑中含有與抗體相對應(yīng)的抗原。58方法：精斑浸出液凹玻板倍比稀釋至1：2048，加入效價為4的抗血清（A、B、H）各1滴室溫30min 加2的指示紅細(xì)胞，搖勻靜置30min 觀察結(jié)果結(jié)果判定：精液檢材與基質(zhì)的抑制凝集相差3級以上陽性5960特點：準(zhǔn)確性較吸收法高可與精斑確證試驗同時進(jìn)行能判斷分泌能力強(qiáng)弱，并

14、能區(qū)分是否是分泌型檢材浸出液混濁時，可水浴煮沸10min，離心，以除去蛋白、細(xì)菌、酶類等干擾注意：抗血清效價一定要標(biāo)化，一般以4為好。614.酶標(biāo)抗體免疫測定法 精斑的ABO血型測定常用直接斑點ELISA法、間接斑點ELISA法及斑點ELISA雙抗夾心法，尤以直接斑點ELISA法操作簡單，常作為首選方法。625.DNA分型PCR-直接測序法PCR-RFLP法63（二）精斑的血清型測定精液中的多態(tài)性蛋白：Gm、Km、GC、血清類粘蛋白（三）精斑的酶型測定PGMl型測定巖藻糖苷酶型黃遞酶型-GGT型測定64PGM1型測定磷酸葡萄糖變位酶：普通凝膠電泳可檢出7條譜帶。65DIA型 黃遞酶型（diaphorase, DIA），DIA3僅存在于人類精子和睪丸中，是男性生殖細(xì)胞特有的一種遺傳標(biāo)記，且分型不受陰道液和其它體液的影響。66（四）精斑的DNA分析精液中的DNA：精子、睪丸細(xì)胞、上皮細(xì)胞精液DNA數(shù)據(jù)：每個精子含DNA約2.5 pgPCR分析所需精液量低于5 ul，僅需10個精子正常成人每次射精約35 ml，約0.62億個精子67精子細(xì)胞核特點： 大量二硫鍵，能抵抗去污劑和外源性蛋白酶提取DNA需加入還原劑（如DTT） 二步消化法提取精陰混合斑精子DNA。DNA提取方法：有機(jī)溶劑法：純度高，損耗大Chlelex-100法：純度低，僅適用于PCR其它6