微生物—病毒PPT課件

1、華東理工大學(xué)繼續(xù)教育學(xué)院課程微生物學(xué)第三章病毒與亞病毒1.前言1.病毒的最早記載記載最早的病毒病天花 中國(guó)：北宋時(shí)期 防止天花：牛痘（英國(guó)鄉(xiāng)村醫(yī)生詹納）18代埃及王朝時(shí)代（公元前1500年），浮雕刻有一條萎縮腿的祭司-脊髓灰質(zhì)炎病毒。2.給人類帶來(lái)嚴(yán)重災(zāi)難的流感病毒流感期間 Camp Funston 的緊急軍事醫(yī)院3.前言2.病毒的發(fā)現(xiàn)19世紀(jì)末，科學(xué)家伊萬(wàn)諾夫斯基在研究煙草花葉病的病因時(shí)，推想是由細(xì)菌引起的。他將患花葉病的煙草榨出汁液，用細(xì)菌過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，將細(xì)菌濾出，再用過(guò)濾后的汁液去感染正常的煙葉，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常的煙葉還能患病。這表明煙草花葉病是由比細(xì)菌還小的生物引起的，他把這種生物叫做“

2、濾過(guò)性病毒”，就是我們所說(shuō)的病毒。1971年后，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了各種亞病毒類病毒、擬病毒和朊病毒。4. 1935年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主美國(guó)生化學(xué)家斯坦利第一次將病毒提純出來(lái)，得到了一些結(jié)晶體。這些結(jié)晶體表現(xiàn)不出任何的生命特征，但是將這些結(jié)晶體移入生物體內(nèi)，病毒就會(huì)大量繁殖，并使生物體致病。 至今美國(guó)加州大學(xué)原斯坦利實(shí)驗(yàn)室里保存的他當(dāng)時(shí)提純的病毒結(jié)晶仍然具有致病力。 由這些資料可知，病毒是一種特殊生物，只有在其他生物的活細(xì)胞內(nèi)才能生活和繁殖，才能表現(xiàn)出生命現(xiàn)象。離開(kāi)活細(xì)胞后，病毒無(wú)法進(jìn)行任何生命活動(dòng)。 這點(diǎn)也可以用在普通培養(yǎng)基上無(wú)法培養(yǎng)病毒來(lái)解釋。病毒晶體5.假設(shè)病毒有一個(gè)籃球那么大，那么細(xì)胞就是一座摩天

3、大廈6.非典（SARS）病毒H5N1禽流感病毒甲型H1N1流感病毒 常見(jiàn)病毒手足口病病毒7.艾滋病病毒：HIV狂犬病病毒花葉病病毒昆蟲(chóng)病毒豌豆萎黃病毒綠膿桿菌病毒 常見(jiàn)病毒8.前言3.病毒的分類非細(xì)胞生物擬病毒:只含不具獨(dú)立侵染性的RNA 組分類病毒:只含具有獨(dú)立侵染性的RNA 組分亞病毒真病毒: 至少含有核酸和蛋白質(zhì)兩種組分朊病毒:只含單一蛋白質(zhì)組分噬菌體（原核生物如細(xì)菌、放線菌，噬藍(lán)綠藻體，支原體噬菌體）真菌病毒植物病毒昆蟲(chóng)病毒動(dòng)物病毒9.前言4.病毒的基本特點(diǎn)個(gè)體極小（以nm計(jì)），能通過(guò)濾菌器，形態(tài)多樣，有球狀、桿狀、復(fù)雜形態(tài)。無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，主要由蛋白質(zhì)、核酸構(gòu)成，一個(gè)病毒體內(nèi)僅含一種核酸

4、，核酸以單鏈或雙鏈形式存在。生活方式為專性活細(xì)胞內(nèi)寄生，病毒酶系不全，離開(kāi)活體后無(wú)生命特征。以毒粒形式存在。病毒以復(fù)制的方式增殖。對(duì)一般抗生素不敏感，對(duì)干擾素敏感。 一般來(lái)說(shuō)，特異性比較強(qiáng)。10.前言5.什么是病毒？病毒：是一類超顯微的非細(xì)胞生物,每一種病毒只含有一種核酸;它們只能在活細(xì)胞內(nèi)營(yíng)專性寄生;在離體條件下,它們以無(wú)生命的化學(xué)大分子狀態(tài)存在.11.第二節(jié) 病毒的繁殖方式第四節(jié) 病毒與實(shí)踐目錄第一節(jié) 病毒的形態(tài)構(gòu)造及化學(xué)成分第三節(jié) 亞病毒第一節(jié) 病毒的形態(tài)構(gòu)造及化學(xué)成分1.病毒的大小絕大多數(shù)的病毒都是能通過(guò)細(xì)菌濾器的微小顆粒, 它們的直徑多數(shù)在100 nm( 20200 nm)上下。觀察

5、病毒的形態(tài)和精確測(cè)定其大小, 必須借助電鏡。13.2.病毒的形態(tài)形態(tài)各異的病毒14.煙草花葉病毒P2噬菌體T2噬菌體脊髓灰質(zhì)炎病毒皰疹病毒流感病毒腺病毒形態(tài)各異的病毒15.形態(tài)各異的病毒16.（1）典型病毒粒的構(gòu)造病毒粒有時(shí)也稱病毒顆?；虿《玖Ｗ? virus particle ) , 專指成熟的、結(jié)構(gòu)完整的和有感染性的單個(gè)病毒。病毒粒的基本成分是核酸和蛋白質(zhì)。核酸位于它的中心, 稱為核心( core) 或基因組(genome ) , 蛋白質(zhì)包圍在核心周圍, 形成了衣殼( capsid)。衣殼是病毒粒的主要支架結(jié)構(gòu)和抗原成分, 有保護(hù)核酸等作用。17.裸病毒包膜病毒18.（2）病毒的群體形態(tài)可

6、以分為兩個(gè)大類：1）光鏡可以觀察到：包含體（動(dòng)植物細(xì)胞）2）肉眼可見(jiàn)：噬菌斑（細(xì)菌） 空斑 （動(dòng)物細(xì)胞） 枯斑 （植物葉片）19. 病毒的群體形態(tài)包含體包含體（inclusion body）包含體的特殊名稱： 顧氏小體-天花 內(nèi)基小體狂犬 X小體TMV 多角體-昆蟲(chóng)包含體的存在位置：多數(shù)為 細(xì)胞質(zhì)中如天花病毒少數(shù)為 細(xì)胞核中如皰疹病毒20.噬菌斑的形態(tài)與病毒、細(xì)菌及培養(yǎng)基的情況有關(guān)噬菌體所形成的噬菌斑病毒的群體形態(tài)噬菌斑21.病毒的群體形態(tài)空斑動(dòng)物病毒感染形成的空斑空斑：動(dòng)物病毒在宿主單層細(xì)胞培養(yǎng)物上形成。22. 病毒的群體形態(tài)枯斑23.（3） 病毒粒的對(duì)稱體制病毒粒的對(duì)稱體制有三種, 以螺旋

7、對(duì)稱和二十面體對(duì)稱( 等軸對(duì)稱)為主。另一些結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的病毒, 實(shí)質(zhì)上是上述兩種對(duì)稱相結(jié)合的結(jié)果, 稱作復(fù)合對(duì)稱。24.螺旋對(duì)稱的代表煙草花葉病毒煙草花葉病毒簡(jiǎn)稱TMV。由95% 衣殼蛋白和5% 單鏈RNA( ssRNA) 組成。衣殼含2 130個(gè)皮鞋狀的蛋白亞基即衣殼粒。每個(gè)亞基含158 個(gè)氨基酸, 相對(duì)分子質(zhì)量為17 500。亞基以逆時(shí)針?lè)较蜃髀菪隣钆帕? 每圈為49 個(gè)核苷酸。25.二十面體對(duì)稱的代表腺病毒腺病毒( Adenovirus) 是一類動(dòng)物病毒, 1953 年首次從手術(shù)切除的小兒扁桃體中分離到。腺病毒的外形呈“球狀”, 實(shí)質(zhì)上卻是一典型的二十面體對(duì)稱。沒(méi)有包膜。它有12個(gè)角、2

8、0 個(gè)面和30 條棱。每個(gè)五鄰體上突出一根末端帶有頂球的蛋白纖維, 稱為刺突。腺病毒的核心是由36 500 bp的線狀雙鏈構(gòu)成。26.復(fù)合對(duì)稱的代表T 偶數(shù)噬菌體E .coli 的T 偶數(shù)( even type ) 噬菌體共有3 種, 即T2、T4 和T6.它們是病毒學(xué)和分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)理論研究中的極好材料。T4 由頭部( head )、頸部( neck) 和尾部( tail ) 3 部分構(gòu)成。由于頭部呈二十面體對(duì)稱而尾部呈螺旋對(duì)稱, 故是一種復(fù)合對(duì)稱結(jié)構(gòu)。27.T-偶數(shù)噬菌體的頭部為一變形的二十面體結(jié)構(gòu)。頭部含有雙鏈DNA。其尾部結(jié)構(gòu)復(fù)雜,由尾管(tail tube)、尾鞘(tail shea

9、th)、頸部(collar)、基片(base plate)、尾釘(tail pin)和尾絲(tail fiber)5個(gè)主要部分組成。28.3.病毒的核酸核酸構(gòu)成了病毒的基因組(genome ) , 它是病毒粒中最重要的成分, 具有遺傳信息的載體和傳遞體的作用。病毒核酸的種類很多, 是病毒系統(tǒng)分類中最可靠的分子基礎(chǔ), 主要有以下幾個(gè)指標(biāo): 是DNA 還是RNA; 是單鏈還是雙鏈; 呈線狀還是環(huán)狀; 是閉環(huán)還是缺口環(huán); 基因組是單分子、雙分子、三分子還是多分子; 核酸的堿基或堿基對(duì)數(shù), 以及核苷酸序列等。29.4、病毒的培養(yǎng)和純化噬菌體細(xì)菌培養(yǎng)物培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板細(xì)菌培養(yǎng)液變清亮細(xì)菌平板成為殘跡平

10、板若是噬菌體標(biāo)本經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋再接種細(xì)菌平板，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間培養(yǎng)，在細(xì)菌菌苔上可形成圓形局部透明區(qū)域，噬菌斑(plague)如同對(duì)細(xì)菌計(jì)數(shù)一樣，形成的噬菌斑也可用于對(duì)噬菌體的數(shù)目進(jìn)行估算。30.動(dòng)物病毒實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雞胚多種細(xì)胞培養(yǎng)31.Egg-Based Vaccine Production Currently commercialized seasonal influenza vaccines rely upon the supply of embryonated chicken eggs as the substrate for virus propagation. 32.蛋白質(zhì)提純方法（鹽析、等

11、電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀、凝膠層析、離子交換等）標(biāo)準(zhǔn)純化的病毒制備物應(yīng)保持其感染性病毒是有感染性的生物體病毒具有化學(xué)大分子的屬性純化的病毒制備物的理化性質(zhì)應(yīng)具有均一性方法主要化學(xué)組成為蛋白質(zhì)具有一定的大小、形狀和密度差速離心梯度離心（超速離心）33.第二節(jié) 四類病毒及其繁殖方式以大腸桿菌的病毒T4噬菌體為例34.噬菌體即原核生物的病毒, 包括噬細(xì)菌體、噬放線菌體噬藍(lán)細(xì)菌體等, 凡有原核生物活動(dòng)之處幾乎都發(fā)現(xiàn)有相應(yīng)噬菌體的存在。噬菌體種類很多, 可歸納成6 種主要形態(tài), 即A 型, dsDNA, 蝌蚪狀, 收縮性尾; B 型, dsDNA, 蝌蚪狀, 非收縮性長(zhǎng)尾; C 型, dsDNA,非收縮性

12、短尾; D 型, ssDNA, 球狀, 無(wú)尾, 大頂衣殼粒; E 型, ssRNA, 球狀, 無(wú)尾, 小頂衣殼粒; F 型, ssDNA, 絲狀, 無(wú)頭尾35.1.噬菌體的繁殖 噬菌體并沒(méi)有個(gè)體的生長(zhǎng)過(guò)程，而只有其基本成分的合成和裝配，即首先將各個(gè)部件合成出來(lái)，然后裝配，所以一般將噬菌體的繁殖稱做復(fù)制。根據(jù)噬菌體與宿主的關(guān)系：1.烈性噬菌體：指感染宿主細(xì)胞后，能夠使宿主細(xì)胞裂解的噬菌體.2.溫和噬菌體（或溶源性噬菌體）：噬菌體感染細(xì)胞后，將其核酸整合（附著）到宿主的核DNA上，并且可以隨宿主DNA的復(fù)制而進(jìn)行同步復(fù)制，在一般情況下，不引起寄主細(xì)胞裂解的噬菌體。36.烈性噬菌體的繁殖過(guò)程一般分為

13、五個(gè)階段：即吸附、侵入、增殖、裝配和釋放烈性噬菌體的繁殖37.（1） 吸附 吸附是特異性的，病毒吸附蛋白，細(xì)胞受體38.（2）侵入 尾管端攜帶的少量溶菌酶水解肽聚糖，使細(xì)胞壁產(chǎn)生一小孔，注入核酸，而蛋白質(zhì)外殼則留在細(xì)胞的外面。 39.（3）增殖包括核酸的復(fù)制和蛋白質(zhì)的合成。 早期基因次早期基因晚期基因40.（4）成熟或裝配主要步驟有： DNA分子的縮合通過(guò)衣殼包裹DNA而形成頭部尾絲及尾部的其它部件獨(dú)立裝配完成頭部與尾部相結(jié)合最后裝上尾絲，一個(gè)個(gè)成熟的形狀、大小相同的噬菌體裝配完成。41.（5）裂解（釋放）兩種釋放形式： A.裂解性釋放： 子代噬菌體成熟后，在脂肪酶和溶菌酶的作用下，細(xì)胞裂解，

14、子代噬菌體釋放（release）。 42.B.出芽性釋放：有包膜的病毒通過(guò)出芽或者分泌的方式從細(xì)胞中釋放。病毒可以從細(xì)胞膜、核膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中獲得包膜。 核衣殼附著于膜的內(nèi)側(cè)，和膜一起擠出。43.烈性噬菌體復(fù)制的過(guò)程44.一步生長(zhǎng) 通常情況下，一個(gè)噬菌體通過(guò)上述五個(gè)過(guò)程能合成100-300個(gè)噬菌體。烈性噬菌體的這種生長(zhǎng)繁殖方式也稱為一步生長(zhǎng)。 在固體培養(yǎng)基表面可見(jiàn)噬菌斑。 在液體培養(yǎng)基中可見(jiàn)培養(yǎng)物被溶解，培養(yǎng)基變清. 45.2.噬菌體效價(jià)的測(cè)定噬菌體效價(jià)：每毫升試樣中所含有的具有侵染性的噬菌體粒子數(shù)。 效價(jià)的測(cè)定方法：雙層平板法（Two layer plating method)電鏡直接觀察46

15、.3.一步生長(zhǎng)曲線定量描述烈性噬菌體（病毒）繁殖規(guī)律的實(shí)驗(yàn)曲線，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),以噬菌體（病毒）效價(jià)為縱坐標(biāo)稱為一步生長(zhǎng)曲線 .可分以下階段：潛伏期，裂解期，穩(wěn)定期 三個(gè)指標(biāo)：潛伏期，裂解期，裂解量平穩(wěn)期的平均效價(jià)數(shù)/潛伏期平均效價(jià)數(shù)裂解量：平均每一宿主細(xì)胞裂解后產(chǎn)生的子代噬菌體數(shù)47.4、溫和噬菌體與溶源性細(xì)菌 （1）溫和噬菌體：噬菌體感染細(xì)胞后，將其核酸整合（附著）到宿主的核基因組上，并且可以隨宿主DNA的復(fù)制而進(jìn)行同步復(fù)制，在一般情況下，不引起寄主細(xì)胞裂解的噬菌體。（2）原噬菌體（或前噬菌體）： 即整合在宿主核基因組上的噬菌體的核酸。 （3）溶原性細(xì)菌：指在核染色體上整合有原噬菌體的

16、細(xì)菌。一般可進(jìn)行正常生長(zhǎng)繁殖,而不被裂解。 48.溶原性細(xì)菌的特點(diǎn)：1.可穩(wěn)定遺傳：子代細(xì)菌都含有原噬菌體，均具有溶原性。2.可自發(fā)裂解：溫和噬菌體的核酸也可從宿主DNA上脫落下來(lái)，恢復(fù)原來(lái)的狀態(tài)，進(jìn)行大量的復(fù)制，變成烈性噬菌體，自發(fā)裂解幾率10-210-5 。 可誘導(dǎo)裂解：用化學(xué)、物理方法誘導(dǎo)3.具有“免疫性”：對(duì)同型噬菌體具免疫性，對(duì)非同源噬菌體沒(méi)有免疫性。4.可復(fù)愈：自然遺失前噬菌體，不發(fā)生自發(fā)裂解和誘導(dǎo)裂解.5.溶源轉(zhuǎn)變：由于溶原菌整合了溫和噬菌體的核酸而使自己產(chǎn)生一些新的生理特征。49.噬菌體裂解性循環(huán)與溶源性循環(huán)的相互關(guān)系自發(fā)或誘導(dǎo)50.溫和噬菌體向烈解性循環(huán)的轉(zhuǎn)變51.5.植物病

17、毒 葉片黃化 枯斑植株矮化植物病毒大多是含單鏈RNA的病毒。按粒子形態(tài)分為3種類型:桿狀、線狀或近球形的多面體。有些植物病毒也具有包膜。植物病毒和其它病毒一樣是嚴(yán)格寄生生物,但它們的?；圆粡?qiáng) 。52. 動(dòng)物病毒入侵的三種方式：裸病毒直接侵入包膜病毒以融合方式進(jìn)入有包膜的病毒以胞吞方式進(jìn)入6.動(dòng)物病毒53.7.昆蟲(chóng)病毒 多角體 昆蟲(chóng)病毒的種類： 核型多角體（NPV) 質(zhì)型多角體(CPV) 顆粒體病毒(GV) 無(wú)包含體病毒 54.第三節(jié) 亞病毒55.1. 類病毒 1.1 類病毒的發(fā)現(xiàn)： 馬鈴薯紡錘型塊莖病（PSTV） 病原 目前已經(jīng)鑒定的類病毒種類有20多個(gè)，均在植物中發(fā)現(xiàn)。 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：為單鏈閉

18、合環(huán)狀的RNA分子，棒狀結(jié)構(gòu)，通常含有246375個(gè)核苷酸。 類病毒RNA不編碼任何蛋白質(zhì) PSTV類病毒是一種不含蛋白，能在感染的寄主細(xì)胞中自我復(fù)制并引起病原的小RNA環(huán)狀分子，由246399個(gè)核苷酸分子組成，目前只在植物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。56.Fig. Symptoms of viroid diseases: A: potato spindle tuber on tomato, B: avocado sun blotch, C: chrysanthemum stunt, D chrysanthemum chlorotic mottle 1.2 類病毒引起的病害57.1.3 PSTV的模式結(jié)構(gòu)圖P

19、STV 呈棒形, 是一裸露的閉合環(huán)狀ssRNA 分子, 其相對(duì)分子質(zhì)量為1.2105 。整個(gè)環(huán)由兩個(gè)互補(bǔ)的半體組成, 其一含179 個(gè)核苷酸, 另一含180 個(gè)核苷酸, 兩者間有70%的堿基以氫鍵方式結(jié)合, 共形成122 個(gè)堿基對(duì), 整個(gè)結(jié)構(gòu)中形成了27 個(gè)內(nèi)環(huán)。58.1.4 類病毒的復(fù)制模式類病毒的滾環(huán)復(fù)制模式59.2. 擬病毒宿主核酸：環(huán)狀RNA1 擬病毒：線狀RNA3 及環(huán)狀RNA2 指一類包裹在真病毒粒中的有缺陷的類病毒，由裸露的DNA或RAN組成又稱 類類病毒、殼內(nèi)類病毒被擬病毒寄生的真病毒為輔助病毒（helper virus）2.1擬病毒的發(fā)現(xiàn)1981年在絨毛煙的斑駁病毒中分離到6

20、0. 單獨(dú)沒(méi)有侵染性，必須依賴輔助病毒才能侵染和復(fù)制 擬病毒可干擾輔助病毒的復(fù)制其RNA不具有編碼能力，需要利用輔助病毒的外殼蛋白，并與輔助病毒基因組一起包裹在同一病毒粒子內(nèi)。 2.2擬病毒的特點(diǎn)61.3. 衛(wèi)星病毒1.概念：基因組缺損，必須依靠輔助病毒才能復(fù)制和表達(dá)的小型伴生病毒。2. 特點(diǎn)：有較完整結(jié)構(gòu) 無(wú)獨(dú)立感染能力 可改變輔助病毒引起的病害，單獨(dú)感染的 話，可使寄主溶源化62.4.衛(wèi)星RNA1.概念：存在于某一病毒粒（輔助病毒）的衣殼內(nèi)，并完全依賴后者才能復(fù)制自己的小分子RNA病原因子。2.特點(diǎn)：對(duì)宿主植物無(wú)獨(dú)立的侵染性；其復(fù)制和侵染完全依賴輔助病毒；不具有mRNA活性；與輔助病毒的R

21、NA無(wú)同源性；能干擾輔助病毒的復(fù)制從而降低其增殖量。63.3類亞病毒因子的比較特點(diǎn)擬病毒衛(wèi)星病毒衛(wèi)星RNA核酸種類小分子環(huán)狀或線狀ssRNA小分子線狀ssRNA或線狀dsRNA小分子線狀或環(huán)狀ssRNA衣殼無(wú)有無(wú)存在狀態(tài)包裝在專一的輔助病毒粒內(nèi)與專一的植物病毒、動(dòng)物病毒或噬菌體伴生包裝在專一的輔助病毒粒內(nèi)核酸復(fù)制對(duì)輔助病毒的依賴依賴不依賴依賴基因組與輔助病毒的整合是否否與輔助病毒基因組的同源性有無(wú)無(wú)對(duì)侵染的必要性必要不必要不必要編碼自身衣殼蛋白不能能不能對(duì)宿主的影響改變輔助病毒引起的癥狀，加重或減弱病害改變輔助病毒引起的癥狀，加重或減弱病害；若單獨(dú)感染宿主，可使其溶源化改變輔助病毒引起的癥狀，

22、加重或減弱病害64.5. 朊病毒 5.1 什么是朊病毒 5.2關(guān)于朊病毒的兩項(xiàng)榮譽(yù) 1.庫(kù)魯病：Gajdusek1976年 2.羊搔癢?。?982年prusiner 發(fā)現(xiàn)，并因此獲得了1997年的諾貝爾生理和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) 一種傳染性的蛋白侵染因子65.5.3 朊病毒所引起的疾病 震顫病或稱庫(kù)魯(Kuru)、 克雅氏病(CJD)或稱為老年癡呆 牛海綿腦病(BSE)即瘋牛病、貓海綿腦病(FSE)、 新型克雅氏?。ㄔ缋闲园V呆） 吉斯特曼斯召斯列綜合癥(GSS)、 致死性家族失眠癥（FFI)、 綿羊搔癢癥、山羊搔癢癥、 大耳鹿慢性消耗病(CWD)、 傳染性雪貂白質(zhì)腦病(TME) 疾病特點(diǎn)：致死性中樞神經(jīng)系統(tǒng)

23、的慢性退化性腦病，潛伏期長(zhǎng)，臨床癥狀，病理切片瘋牛病牛腦切片患病腦組織切片66.朊蛋白（PrPc）42的螺旋和少量的折疊(3) 朊病毒蛋白（PrPsc）30的螺旋和折疊(45) 朊蛋白（PrPc）一種分子量為3335kD的正常細(xì)胞蛋白截短形式朊病毒蛋白（PrP27-30）21的螺旋和折疊(54) 蛋白酶抗性 聚集成淀粉樣顆粒朊蛋白和朊病毒蛋白！朊蛋白是生物體內(nèi)正常存在的一種蛋白質(zhì)5.4 朊病毒病的發(fā)病機(jī)制67.第四節(jié) 病毒與實(shí)踐噬菌體與發(fā)酵工業(yè)2. 昆蟲(chóng)病毒用于生物防治3. 病毒在基因工程中的應(yīng)用4. 病毒與疾病68.1.噬菌體與發(fā)酵工業(yè)查找污染的原因生產(chǎn)菌株本身環(huán)境及發(fā)酵罐本身空氣過(guò)濾器操作

24、人員嚴(yán)格會(huì)客制度噬菌體的防治：防重于治69.防治措施：1.物理因素 (一)溫度 大多數(shù)病毒耐冷不耐熱。反復(fù)凍融可致許多病毒滅活 不同病毒對(duì)熱的耐受性有很大不同，一般包膜病毒比無(wú)包膜病毒更不耐熱，包膜病毒56可迅速滅活。 （二)pH 多數(shù)病毒在pH6-9范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，在pH5.0以下或pH9.0以上迅速滅活。 (三)射線 射線、x射線及紫外線都能滅活病毒。70. (一)脂溶劑： 包膜病毒 (二）酚類及醛類 酚及其衍生物為蛋白質(zhì)變性劑，能破壞病毒衣殼蛋白，故可作為病毒消毒劑。 (三)氧化劑、鹵素及其化合物 70的甲醇及乙醇均可使多數(shù)病毒滅活。過(guò)氧乙酸等對(duì)肝炎病毒有較好的消毒作用。防治措施：2.

25、化學(xué)因素71.噬菌體感染大腸桿菌的電鏡照片 用噬菌體防治動(dòng)物的痢疾桿菌、耐藥性的綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌感染，取得優(yōu)于藥物的治療效果。 72.2.昆蟲(chóng)病毒用于生物防治生物治蟲(chóng)包括動(dòng)物治蟲(chóng)、以蟲(chóng)治蟲(chóng)、細(xì)菌治蟲(chóng)、真菌治蟲(chóng)和病毒治蟲(chóng)等手段。其中利用病毒制劑進(jìn)行生物治蟲(chóng)由于具有資源豐富( 已發(fā)現(xiàn)的病毒近2 000 種)、致病力強(qiáng)和專一性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn), 故發(fā)展勢(shì)頭很旺, 前景誘人?，F(xiàn)階段，由于其殺蟲(chóng)速度慢，不易大規(guī)模生產(chǎn)，保藏期短，在野外易失活和殺蟲(chóng)范圍窄等缺點(diǎn)，有待研究解決。73.3. 病毒在基因工程中的應(yīng)用 噬菌體作為原核生物基因工程的載體 噬菌體： 科斯質(zhì)粒（cosmid）: 噬菌體的粘性末 端和質(zhì)粒

26、構(gòu)建而成。 特點(diǎn)：感染力強(qiáng) cos位點(diǎn)連接形成環(huán)狀，似質(zhì)粒 可克隆大片段74.4、病毒與疾病 艾滋?。ˋids）全稱為人類獲得性免疫缺陷綜合癥(Acquired Immune Dificiency Syndrome)由人體免疫缺損病毒（HIV）引起，1987年定名HIV危害人體75.1.圓形結(jié)構(gòu)2.有包膜3.遺傳物質(zhì)為ssRNA， 自身攜帶反轉(zhuǎn)錄酶4. 傳播途徑：體液HIV病毒的結(jié)構(gòu)76.HIV病毒的感染從感染艾滋病病毒到發(fā)病有一個(gè)完整的自然過(guò)程，臨床上將這個(gè)過(guò)程分為四期：急性感染期潛伏期艾滋病前期典型艾滋病期77.與AIDS有關(guān)的條件病原體A:白假絲酵母，b，新型隱球菌 c，莢膜組織胞漿菌，

27、d，卡氏肺囊蟲(chóng) e，隱孢子蟲(chóng)，f，小腸分支桿菌78.HIV的治療(一)阻斷病毒吸附和感染建立(二)病毒逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶活性的抑制 雞尾酒療法（三)HIV疫苗的研制 79.噬菌體載體系統(tǒng)一、噬菌體載體二、單鏈?zhǔn)删w載體三、噬菌粒載體四、柯斯質(zhì)粒載體80.一、噬菌體 組成特點(diǎn)： 雙鏈線狀DNA分子， 全長(zhǎng)50kb， 含65個(gè)基因， 在其分子兩端各含有12個(gè)堿基的互補(bǔ)單鏈，是天然的粘性末端，被稱為COS位點(diǎn)。81.噬菌體感染細(xì)菌后的溶菌性和溶源性生長(zhǎng)溶菌性生長(zhǎng) 噬菌體感染細(xì)菌后，借助其2個(gè)cos位點(diǎn)互補(bǔ)成環(huán)，在宿主菌體內(nèi)連續(xù)復(fù)制，合成大量基因產(chǎn)物，進(jìn)而裝配成噬菌體顆粒，裂解宿主菌，釋放出來(lái)的噬菌體又

28、可感染其他細(xì)菌。溶源性生長(zhǎng) 噬菌體感染細(xì)菌后，可將自身DNA整合到細(xì)菌的染色體中去，與之一起復(fù)制，并遺傳給子代細(xì)胞，宿主細(xì)胞不被裂解。82.噬菌體 A WB DEF Z J att xis N cl cro O P Q SR 結(jié)構(gòu)區(qū) 重組區(qū)調(diào)控區(qū)裂解區(qū)cos位點(diǎn) cos 位點(diǎn)ARAREcoRI目的基因EcoRIEcoRI插入型置換型83.84.A W B C D E F Z U V G H M L K I J b2 cI cro cII O P Q S R att int xis gam red cIII NCOS COS 頭部基因 尾部基因 功能不明區(qū) 溶源化 重組 早期控制 阻遏 DNA合

29、成 溶菌生長(zhǎng)非必須區(qū)段cI基因：溶源過(guò)程控制基因。噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)85.1、噬菌體載體類型 插入型載體：僅有一個(gè)可供外源基因的插入位點(diǎn)。例如：gt10 11，BV2,NM540, NM590, NM607等。替換型載體：具有成對(duì)的克隆位點(diǎn)，在這兩個(gè)位點(diǎn)之間的DNA區(qū)段可以被外源插入的DNA片斷所取代。 例如：EMB14 和 Charon4，Charon10等。 凱倫噬菌體：既有插入型，又有替換型86.插入型載體 插入失活效應(yīng)：外源的DNA克隆到插入型的載體分子上，會(huì)使噬菌體的某種生物功能喪失。插入失活有兩種類型：(1)免疫功能失活；(2)大腸桿菌半乳糖苷酶失活；87.半乳糖苷酶失活的插入型載

30、體：這種載體感染的大腸桿菌lac+指示菌，涂布在補(bǔ)加有IPTG和Xgal培養(yǎng)基平板上，會(huì)形成藍(lán)色的噬菌斑，若外源DNA插入的編碼半乳糖苷酶的lacZ基因區(qū)，這種重組體感染的lac-指示菌，由于不能合成半乳糖苷酶，只能形成無(wú)色的噬菌斑。88.免疫功能失活的插入型載體：外源DAN片斷插入這種類型載體的基因組中的一段免疫區(qū)，使載體所具有的合成活性阻遏的功能遭受破壞，不能進(jìn)入溶源周期。因此，凡帶有外源DNA插入的重組體都只能形成清晰的噬菌斑，而沒(méi)有外源DNA插入的親本噬菌體會(huì)形成混濁的噬菌斑。89.替換型載體 90. 替換型載體克隆外源DNA包括三個(gè)步驟：應(yīng)用適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶消化載體，除去基因組中可取

31、代的DNA區(qū)段；將上述所得的DNA臂同外源DNA片斷連接；對(duì)重組體的DNA分子進(jìn)行包裝和增殖，以得到有感染性的重組噬菌體。91.Charon（凱倫）噬菌體 92.3、DNA的體外包裝 噬菌體體外包裝的基本原理 噬菌體的頭部和尾部的裝配是分開(kāi)進(jìn)行的。頭部基因發(fā)生了突變的噬菌體只能形成尾部，而尾部基因發(fā)生了突變的噬菌體則只能形成頭部。將這兩種不同突變型的噬菌體的提取物混合起來(lái)，便能夠在體外裝配成有生物活性的噬菌體顆粒。93.重組噬菌體的分子量必須在野生型噬菌體的分子量大小的75%至105%之間。否則，噬菌體的活性急劇下降。要求DNA和外源DNA長(zhǎng)度之和在3953kb之間。插入式載體可攜帶的外源DN

32、A片段較替換式小。94.-DNA的抽提大腸桿菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期加入-噬菌體或重組-噬菌體懸浮液，37培養(yǎng)1h。用新鮮培養(yǎng)液稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4-12h高速離心，沉淀噬菌體苯酚抽提，釋放-DNA。乙醇或異丙醇沉淀DNA。95.-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)體外包裝病毒顆粒，高效感染E.coli裝載外源能力為25kb，大于質(zhì)粒篩選方便重組-DNA容易提取96.二、單鏈?zhǔn)删w載體單鏈環(huán)狀DNA的絲狀大腸桿菌噬菌體：M13、f1、fd噬菌體M13 噬菌體97.單鏈DNA噬菌體載體M13、f1、fd。優(yōu)越性：1.單鏈DNA噬菌體的復(fù)制，是以雙鏈環(huán)形的DNA為媒介的，這種復(fù)制形式的DNA簡(jiǎn)稱RFDNA；2.不論是RF

33、DNA還是ssDNA都能感染大腸桿菌；3.單鏈DNA噬菌體顆粒的大小，是受其DNA的制約的，不存在包裝限制問(wèn)題；4.容易測(cè)定外源DNA片斷的插入取向；5.可產(chǎn)生含外源片斷的單鏈DNA分子。 98.3. M13噬菌體 噬菌體正鏈復(fù)制復(fù)制型DNA經(jīng)pII蛋白造缺口35經(jīng)pII蛋白剪切釋出單鏈DNA(正鏈)進(jìn)入下一循環(huán)5335滾環(huán)復(fù)制在細(xì)菌內(nèi)的復(fù)制模式圖99.100.M13噬菌體的特點(diǎn)感染Ecoli后，在宿主細(xì)胞內(nèi)會(huì)形成雙鏈的復(fù)制型DNA（ replication form DNA, RF DNA）?？梢韵筚|(zhì)粒DNA那樣在體外進(jìn)行純化和操作。 成熟的噬菌體顆粒僅能感染E.coli的F+細(xì)胞，這是因?yàn)?/p>

34、這種噬菌體的感染位點(diǎn)在性散毛上。但是無(wú)論是RF DNA或ss DNA都能轉(zhuǎn)染E.coli的F+或F-細(xì)胞。 噬菌體顆粒的大小是受其DNA的大小制約的，這一點(diǎn)正好與噬菌體相反。所以M13噬菌體并不存在包裝限制的問(wèn)題。 101. M13載體的構(gòu)建（1）克隆區(qū)域的選定基因間隔區(qū)（intergenic region, IG區(qū)）J. Messing證明，IG區(qū)存在M13的復(fù)制起點(diǎn)，但可以插入外源DNA而不影響M13噬菌體的活力。102.在IG區(qū)內(nèi)插入一個(gè)大腸桿菌的LacZ（-肽序列)。 利用-肽序列中的三個(gè)單一酶切位點(diǎn)（Bgl II、Ava II 和 Pvu I）。(2)加入酶切位點(diǎn) 在IG區(qū)內(nèi)加入單一

35、內(nèi)切酶位點(diǎn)第一個(gè)M13載體：M13mp1：103.M13 RFBsuI不完全消化各種長(zhǎng)度的線性片斷（其中應(yīng)有只在IG上切開(kāi)的線性全長(zhǎng)M13）E.coli lac基因的HindII片斷(lacI、lacP、lacO、lacZ）連接M13mp1JM101宿主只有在IG區(qū)插入lacZ才能存活并在Xgal上出現(xiàn)互補(bǔ)的藍(lán)噬菌斑104.（三） M13系列載體的優(yōu)點(diǎn)1）便于克隆不同的酶切片段2）Xgal顯色反應(yīng)，可供直接選擇3）無(wú)包裝限制，克隆能力大4）可以克隆雙鏈DNA分子中的每一條鏈子代M13噬菌體中包含的是單鏈+DNA。105.三、噬菌粒載體 由質(zhì)粒載體和單鏈?zhǔn)删w載體結(jié)合而成的新型的載體系列。 它具

36、有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)、選擇性標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)等，方便DNA的操作，可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在；又具有單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制起點(diǎn)，在輔助噬菌體的存在下，可進(jìn)行噬菌體的繁殖，產(chǎn)生單鏈的子代噬菌體。106.噬菌粒載體（phagemid vectors）由質(zhì)粒載體與單鏈?zhǔn)删w載體的復(fù)制起點(diǎn)結(jié)合而成的新型載體系列。MCS噬菌體ori質(zhì)粒oriAmprlacZ lacI107.約3000bp（比M13小）克隆能力大能插入10kb的外源DNA。兩種復(fù)制形式分子量小1、噬菌粒載體的特點(diǎn)既具有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，又具有噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)。既能在大腸桿菌中以質(zhì)粒的形式雙鏈復(fù)制，又能在噬菌體內(nèi)進(jìn)行單鏈復(fù)制。108.常用的噬菌粒載體pUC118用于體外轉(zhuǎn)錄109.3 PCR產(chǎn)物克隆載體 T 載體pCR系列載體Invitrogen公司開(kāi)發(fā)的線性噬菌粒載體。 結(jié)構(gòu)pUC的質(zhì)粒部分、fi噬菌體ori、Kanr和Ampr抗性。MCS的中部已經(jīng)切開(kāi)，各有一個(gè)3端突出的T。 特點(diǎn)PCR產(chǎn)物往往在3端突出一個(gè)A，所以能與這個(gè)載體直接連接。110.T vector的克隆過(guò)程簡(jiǎn)便！AATTT vectorPCR productT4 DNA ligaseAA111.四、柯斯質(zhì)粒(cosmid) 一種人工構(gòu)建的克隆載體，包含了噬菌體的cos基因。柯斯質(zhì)粒能被包裝到噬