ERP-9131總大腸桿菌多管發(fā)酵技術(shù)培訓(xùn)講學(xué)

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。ERP-9131總大腸桿菌多管發(fā)酵技術(shù)-方法9131總大腸桿菌(多管發(fā)酵技術(shù))1.0適用范圍l1.1本方法用于測(cè)定地下水和地表水中存在的大腸桿菌類(lèi)細(xì)菌。|1.2按本方法分析的大腸桿菌類(lèi)細(xì)菌，其定義為：所有能于35在48h之內(nèi)使乳糖發(fā)酵，并產(chǎn)生氣體的需氧的和兼性厭氧的、革蘭氏染色陰性的、不形成孢子的桿狀細(xì)菌。2.0方法摘要2.1多管發(fā)酵技術(shù)是一種分三步進(jìn)行的試驗(yàn)方法。結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)處理以最可能數(shù)(MPN)表示。下面摘要介紹這三個(gè)步驟：假定試驗(yàn)、確信試驗(yàn)和完成試驗(yàn)(為了使分析結(jié)果準(zhǔn)確，需要進(jìn)行五管試驗(yàn))。2.1

2、.1假定試驗(yàn)：用累進(jìn)量的待測(cè)水樣接種到一系列月桂酰胰蛋白液態(tài)培養(yǎng)基初步發(fā)酵試管。將接種后的試管于350.5培養(yǎng)242h，檢查試管內(nèi)有無(wú)氣體生成。繼續(xù)培養(yǎng)無(wú)氣體生成的試管。并在483h結(jié)束時(shí)再行檢查。在483h內(nèi)只要有氣體生成，不論其量多少均為陽(yáng)性假定試驗(yàn)。I2.1.2確信試驗(yàn)：在24和48h內(nèi)顯示有氣體生成的所有初步發(fā)酵試管均應(yīng)進(jìn)行確信試驗(yàn)。用在假定試驗(yàn)中顯示陽(yáng)性結(jié)果的試管中的培養(yǎng)基，接種到含有亮綠乳糖膽汁液態(tài)培養(yǎng)基的發(fā)酵試管，氣體生成后應(yīng)盡快進(jìn)行接種。將接種后的試管于350.5培養(yǎng)483h。在這段時(shí)間內(nèi)的任何時(shí)刻有氣體生成即表明為陽(yáng)性確信試驗(yàn)。2.1.3完成試驗(yàn)：在確信試驗(yàn)中顯示陽(yáng)性結(jié)果的所

3、有水樣均應(yīng)進(jìn)行完成試驗(yàn)。對(duì)分析過(guò)的全部樣品的20進(jìn)行完成試驗(yàn)，還可作為一種質(zhì)量控制手段。在一個(gè)或數(shù)個(gè)伊紅亞甲藍(lán)平皿瓊脂上用待分析的樣品畫(huà)線。將畫(huà)線后的平皿于350.5培養(yǎng)242h。培養(yǎng)以后，將一個(gè)或數(shù)個(gè)典型菌落(即有菌落核心、具有或沒(méi)有金屬光澤)轉(zhuǎn)移到月桂酰胰蛋白液態(tài)培養(yǎng)基發(fā)酵試管和營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上。將發(fā)酵試管和瓊脂斜面放于350.5培養(yǎng)24土2h；如無(wú)氣體產(chǎn)生則繼續(xù)培養(yǎng)至483h。對(duì)于有氣體生成的發(fā)酵試管，取其相應(yīng)的瓊脂斜面做革蘭氏染色，并用顯微鏡進(jìn)行觀察。如果在發(fā)酵試管內(nèi)生成氣體，并且在瓊脂培養(yǎng)基上出現(xiàn)革蘭氏陰性、不形成孢子的桿狀細(xì)菌，則可認(rèn)為完成試驗(yàn)令人滿意，同時(shí)確認(rèn)被分析的樣品中存在大腸

4、桿菌類(lèi)細(xì)菌。2.2關(guān)于本方法的詳細(xì)內(nèi)容，請(qǐng)見(jiàn)“水和廢水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)法”和“環(huán)境監(jiān)測(cè)的微生物學(xué)方法”。3.O干擾3.1細(xì)菌在水中的分布是無(wú)規(guī)律的。因此，為了獲得足夠的統(tǒng)計(jì)準(zhǔn)確度，本方法要求進(jìn)行五管試驗(yàn)。3.2存在余氯或其它鹵索可妨礙細(xì)菌作用的持續(xù)。為防止出現(xiàn)這種問(wèn)題，應(yīng)在無(wú)菌樣品容器中入硫代硫酸鈉。3.3水樣中含有高濃度銅、鋅或其它重金屬可使細(xì)菌中毒。只有在懷疑水樣中存在重金屬時(shí)才應(yīng)加入螯合劑，例如乙二胺四醋酸(EDTA)。3.4必須牢記，最可能數(shù)表為概率計(jì)算結(jié)果，因而其精密度必然較差。最可能數(shù)表包含23的正系統(tǒng)誤差，通常會(huì)導(dǎo)致數(shù)值偏高。增加所分析的同一采樣點(diǎn)的樣品數(shù)日，增加所檢驗(yàn)的分取樣品的數(shù)目，

5、都能提高最可能數(shù)的精密度。4.O儀器和設(shè)備4.1培養(yǎng)箱。4.1.1培養(yǎng)箱內(nèi)所有位置的溫度在任何時(shí)間都必須保持均勻和穩(wěn)定，即使用區(qū)域內(nèi)的溫差不得大于0.5。為了達(dá)到這種恒溫準(zhǔn)確度，應(yīng)使用帶恒溫水套的或無(wú)水型培養(yǎng)箱，培養(yǎng)箱配備絕緣良好的恒溫控制低溫電熱裝置，電熱裝置安裝在恒溫室四壁后面夾層中或底板下面，也可安裝在其附近；最好配備機(jī)械裝置用以循環(huán)空氣。如果使用干熱式培養(yǎng)箱，濕度必須保持在7580。4.1.2另外，也可使用保溫良好，加熱裝置分布適當(dāng)并配備強(qiáng)制空氣循環(huán)裝置的專(zhuān)用培養(yǎng)室，但其溫差和相對(duì)濕度必須符合要求。使用這種培養(yǎng)室時(shí)，每天應(yīng)記錄培養(yǎng)平皿或試管處的溫度范圍。培養(yǎng)箱配備敞開(kāi)露式金屬絲架或板架

6、，其問(wèn)隔應(yīng)能保證整個(gè)室內(nèi)溫度勻一。平皿架或試管筐與四壁應(yīng)保持2.5cm問(wèn)距。4.1.3培養(yǎng)箱內(nèi)每一個(gè)正在使用的架子上，應(yīng)放置一支準(zhǔn)確的溫度計(jì)，其球部浸入液體(甘油、水或礦物油)；記錄每天的溫度數(shù)(最好是在早晨和下午讀數(shù))。另外，在培養(yǎng)箱內(nèi)位于中間的一個(gè)架子上，最好放置一支帶最高和最低溫度記錄的溫度計(jì)，以便記錄24h內(nèi)的溫度總范圍。培養(yǎng)箱滿載時(shí)，應(yīng)定時(shí)測(cè)定箱內(nèi)的溫度變化。只要有可能，就應(yīng)安裝一支自記溫度計(jì)，以便保留一份連續(xù)的、永久的溫度記錄。水銀溫度計(jì)的刻度應(yīng)為0.5，每年應(yīng)對(duì)照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)局(NBS)檢定合格的溫度計(jì)校準(zhǔn)一次?？潭缺P(pán)溫度計(jì)應(yīng)每季度校準(zhǔn)一次。4.1.4水浴中的水應(yīng)保持足夠深，能沒(méi)過(guò)試

7、管內(nèi)的培養(yǎng)基液面。4.2干熱滅菌箱。應(yīng)使用尺寸足夠大的干熱滅菌箱，以防內(nèi)部擁擠。滅菌箱的構(gòu)造應(yīng)能保證滅菌溫度均勻并足夠高(17010)，應(yīng)配備適用的溫度計(jì)或溫度記錄儀表。4.3高壓滅菌器。4.3.1應(yīng)使用尺寸足夠大的高壓滅菌器，以防內(nèi)部擁擠。滅菌器的構(gòu)造應(yīng)能保證滅菌室內(nèi)溫度均勻(直至并包括滅菌溫度121)；應(yīng)配備準(zhǔn)確的溫度計(jì)，其球部應(yīng)正確地放置在排氣管上，以便記錄滅菌室內(nèi)的最低溫度(也可使用溫度記錄儀表)；應(yīng)配備壓力表和恰當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)好的安全閥，直接與飽和蒸汽動(dòng)力管線或與適用的特制蒸汽發(fā)生器相接(不要使用用胺處理過(guò)的鍋爐供給的蒸汽，以防腐蝕)；滅菌器應(yīng)能在30min內(nèi)達(dá)到所需溫度。I4.3.2由于

8、調(diào)節(jié)和保持滅菌溫度的困難和潛在的危險(xiǎn)，建議不使用立式高壓滅菌器或高壓鍋。如果由于情況緊急或特殊而使用高壓鍋，則必須配備適用的壓力表和溫度計(jì)，其球部應(yīng)位于水面上2.5cm。4.4茵落計(jì)數(shù)器。使用魁北克(Quebec)式菌落計(jì)數(shù)器，最好為暗視野型；也可使用其它計(jì)數(shù)器，但要能提供相等的放大倍數(shù)(1.5倍)和令人滿意的可見(jiàn)度。4.5pH計(jì)準(zhǔn)確度不低于0.1pH單位。4.6天平。使用負(fù)載為150g時(shí)感量不低于0.1g的天平。稱取少量(少于2g)時(shí)，使用負(fù)載為10g時(shí)感量為lmg的分析天平。最好使用單盤(pán)快稱天平。4.7培養(yǎng)基制備器皿。使用硼硅玻璃或其它抗腐蝕材料如不銹鋼器皿。使用的玻璃器皿應(yīng)清潔，無(wú)殘?jiān)?/p>

9、干瓊脂或其它會(huì)污染培養(yǎng)基的外來(lái)物質(zhì)。4.8吸管和刻度量筒。使用尺寸合適，能夠準(zhǔn)確、快速移取所需液量的吸管。同一批產(chǎn)品的核準(zhǔn)誤差不得大于2.5。使用符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的刻度量筒。4.9吸管容器。使用端面尺寸57.5cm的圓筒形或長(zhǎng)約40cm的矩形鋁盒或不銹鋼盒，或用優(yōu)質(zhì)硫酸鹽紙漿紙(牛皮紙)。不得用銅或銅合金罐或盒盛放吸管。4.10稀釋瓶或試管。4.10.1使用耐熱玻璃，最好是硼硅酸鹽玻璃瓶或試管，其密封玻璃塞或螺帽應(yīng)配備在滅菌當(dāng)中不會(huì)產(chǎn)生有毒或抑菌化合物的襯墊。4.10.2不要用棉塞作塞子。在稀釋瓶或管壁上畫(huà)上擦不掉的記號(hào)。可以用尺寸適當(dāng)?shù)臒o(wú)毒塑料瓶代替玻璃瓶，但要保證這種瓶在滅菌時(shí)不會(huì)發(fā)生問(wèn)題。4

10、.11培替氏(Petri)培養(yǎng)皿。使用尺寸約為10015mm的玻璃或塑料培氏培養(yǎng)皿。培養(yǎng)皿底部應(yīng)平坦，無(wú)氣泡，無(wú)劃痕，以便保證整個(gè)皿內(nèi)培養(yǎng)基的厚度一致。采用濾膜技術(shù)時(shí)，使用松蓋玻璃或塑料平皿(6015mm)或緊蓋平皿(5012mm)。滅菌培替氏平皿并貯存在金屬罐(鋁或不銹鋼罐，不能用銅罐)中，也可在滅菌以前先用紙，最好是優(yōu)質(zhì)硫酸鹽紙(牛皮紙)包封。4.12發(fā)酸管和小管瓶。只能使用1075mm的發(fā)酵管。測(cè)試產(chǎn)生的氣體時(shí)，發(fā)酵管內(nèi)應(yīng)倒置放人一支小管瓶，其尺寸應(yīng)合適，確保能充滿培養(yǎng)基，并至少能部分地浸入發(fā)酵管。4.13接種裝。使用由22號(hào)或24號(hào)鎳合金(鉻鎳、鎳鉻或與之相當(dāng)?shù)暮辖?或鉑銥合金制作金屬

11、絲接種環(huán)，便于火焰滅菌。也可以使用一次性鋁制或不銹鋼制移菌環(huán)。接種環(huán)的直徑至少應(yīng)為3mm。用干熱法或蒸汽滅菌。也可以使用一次性硬木制點(diǎn)樣器，其直徑應(yīng)為0.20.3cm，至少比發(fā)酵管長(zhǎng)2.5cm，經(jīng)干熱滅茵后貯存在玻璃或其它無(wú)毒容器內(nèi)。5.0試劑I5.1ASTM型水（ASTMD1193）。應(yīng)測(cè)定水中的雜志。l5.2緩沖水。5.2.1貯備磷酸鹽緩沖液的制備：溶解34.0g磷酸二氫鉀(KH2P04)于500ml型水中,用1N氫氧化鈉溶液(NaOH)調(diào)至pH7.20.5,再用型水稀釋至lL。5.2.2將1.25ml貯備磷酸鹽緩沖液和5.0ml氯化鎂溶液(38gMgCl2L型水或81.1gMgCl26H

12、20LII型水)加入1LII型水。分成數(shù)份，使每份的體積在高壓滅菌15min后為992.0或90.2m1。5.2.3胨水：制備10胨在型水中的溶液。稀釋一定體積的胨水溶液，使最終的溶液為0.1。最終的pH應(yīng)為6.8。5.2.4將胨水分成數(shù)份，使每份的體積在高壓滅菌15min后為992.0或90.2m1。5.2.5不要讓細(xì)菌于室溫下在任何一種稀釋水中懸浮30min以上，否則有些菌種會(huì)死亡，有些菌種會(huì)增殖。5.3月桂酰胰蛋白液態(tài)培養(yǎng)基。5.3.1液態(tài)培養(yǎng)基的成分為：胰蛋白：20.Og；乳糖：5.Og；磷酸氫二鉀(K2HP04)：2.75g；磷酸二氫鉀(KH2P04)：2.75g；氯化鈉：5.0g；

13、月桂酰硫酸鈉：O.1g；型水1L。也可買(mǎi)到包裝好的干粉狀月桂酰胰蛋白液態(tài)培養(yǎng)基。5.3.2要使月桂酰胰蛋白液態(tài)培養(yǎng)基的濃度在加入lOOml或lOml份量的水樣到培養(yǎng)基內(nèi)時(shí)。各營(yíng)養(yǎng)成分的濃度不至降低到低于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的濃度。按表5-8配制這種培養(yǎng)萊。表5-8月桂酰胰蛋白液態(tài)培養(yǎng)基的配制接種水樣（ml）試管內(nèi)培養(yǎng)基的量（ml）培養(yǎng)基+接種的總體積（ml）所需脫水的月桂酰胰蛋白液態(tài)培養(yǎng)基的濃度（g/L）110或稍多11或稍多35.610102071.210203053.410050150106.810035135137.110020120213.65.3.3將液態(tài)培養(yǎng)基分裝到放置有倒置小管瓶的發(fā)酵試管

14、中，培養(yǎng)基的量要足夠多，使得滅菌后能至少部分淹沒(méi)倒置的小管瓶。于121滅菌1215min。滅菌后pH應(yīng)6.80.2。5.4亮綠乳糖膽汁液態(tài)培養(yǎng)基。5.4.1液態(tài)培養(yǎng)基的成分為：胨10.Og；乳糖：l0.Og；牛膽：20.Og；亮綠：0.0133g；型水：1L。也可買(mǎi)到包裝好的干粉狀液態(tài)培養(yǎng)基。5.4.2將液態(tài)培養(yǎng)基分裝到放置有倒置小管瓶的發(fā)酵試管中。培養(yǎng)基的量要足夠多，使得滅菌后能至少部分淹沒(méi)倒置的小管瓶。于121滅菌1215min。滅菌后pH應(yīng)為7.20.2。5.5草酸銨-結(jié)晶紫（赫克氏所用的）。溶解2g結(jié)晶紫（燃料含量90%）于20ml95%的乙醇中；溶解0.8g（NH4）2C2O4H2O

15、于80ml型水中；將兩種溶液混合，使用前放置24h，然后通過(guò)濾紙濾入染色劑瓶中。5.6魯格氏（Lugol)溶液。經(jīng)革蘭氏改性。將1g結(jié)晶碘和2gKI置于缽中研磨。每次加幾毫升型水，每次加水后徹底研磨，直到完全成為溶液為止。用剩余的水（前后總共用300ml）將溶液洗入棕色玻璃瓶?jī)?nèi)。5.7復(fù)染劑。溶解2.5克藏紅染料于100ml95%的乙醇與丙酮混合。5.8丙酮酒精。將等體積的95%乙醇與丙酮混合。5.9革蘭染色劑包。可以使用市售革蘭染色劑包代替第5.5、5.6、5.7和5.8節(jié)中的試劑。6.0樣品的采集、保存和處理6.1所有水樣都必須按照采樣計(jì)劃（其中包括美國(guó)環(huán)境保護(hù)局1978年議定的注意事項(xiàng)）

16、采集。6.2用合適的洗滌劑和熱水徹底清洗所有玻璃器皿，然后用熱水沖洗以除去殘留的痕量洗滌劑，最后用型水沖洗。如果使用機(jī)械式玻璃器皿洗滌機(jī)，其進(jìn)水管件應(yīng)為不銹銅或其它無(wú)毒材料的。不得使用銅管分配型水。沖洗水系統(tǒng)要采用不銹銅或其它無(wú)毒材料。6.2.1將玻璃器皿（不包括盛放在金屬容器內(nèi)的器皿）于170滅菌至少60min；如果根據(jù)自記溫度計(jì)已知滅菌室內(nèi)溫度是均勻的，可以于160滅菌。盛放在金屬容器內(nèi)的玻璃器皿應(yīng)于170滅菌至少2h。6.2.2按上述方法對(duì)非塑料制水瓶滅菌，也可于121蒸壓滅菌15min。每批取一瓶做無(wú)菌性檢驗(yàn)。6.2.3如果準(zhǔn)備采集含有余氯和其它鹵素的水樣，清潔的樣品瓶在滅菌前應(yīng)加入足

17、量的Na2S203，使樣品中的濃度約為100mgL。一個(gè)120ml的瓶子，要加0.1ml10的Na2S203溶液(這樣就能中和余氯濃度約為15mgL的樣品)。塞上瓶塞，加蓋，按前述方法用干熱或濕熱滅菌。6.2.4采集含有高濃度銅或鋅的水樣，或含有高濃度重金屬的廢水時(shí)，水樣瓶?jī)?nèi)內(nèi)應(yīng)先放人能減少金屬毒性的螯合劑。當(dāng)這類(lèi)樣品要轉(zhuǎn)運(yùn)4h以上時(shí)。這一點(diǎn)尤其重要。用372mgL的乙二胺四醋酸四鈉鹽(EDTA)作螯合劑，使用前將EDTA溶液調(diào)至pH6.5?？蓪DTA分別加入水樣瓶?jī)?nèi)(向120ml的瓶口加入0.3ml15的溶液)，然后滅菌；也可先與Na2S203溶液混合，然后加入瓶中。16.3采集水樣時(shí)，要

18、在瓶?jī)?nèi)留有足夠的空間（至少2.5cm高），以備檢驗(yàn)前振蕩混合。小心采集水樣，使之能夠代表準(zhǔn)備檢驗(yàn)脈墻要防止的水，還要防止采樣時(shí)或檢驗(yàn)前的一段時(shí)間內(nèi)水樣受到污染。6.4水樣瓶在采樣前一直要密封。瓶塞和罩蓋或螺帽要做為一體取下，小心避免弄臟。采水時(shí)不要握著瓶塞、蓋帽和瓶頸，要保護(hù)這些部分不受污染。握住瓶子靠底部的部位，讓水灌入。，不要用水沖洗。立即塞好瓶塞或蓋好瓶蓋，沿瓶頸將罩蓋栓緊。7.0步驟7.1假定試驗(yàn)。7.1.1用適當(dāng)?shù)睦圻M(jìn)量(1ml的倍數(shù)或約數(shù))水樣接種到一系列發(fā)酵試管(“初步”發(fā)酵試管)。注意確保培養(yǎng)基和加入的樣品混合物中營(yíng)養(yǎng)成分的濃度合乎第5.3節(jié)提出的要求。用無(wú)菌吸管從開(kāi)始的水樣瓶

19、以及其次連續(xù)的各稀釋瓶依次做轉(zhuǎn)移。如果吸管在完成轉(zhuǎn)移之前受到污染，則應(yīng)換用另一支無(wú)菌吸管。從每一個(gè)不同的稀釋水樣做轉(zhuǎn)移時(shí)，要使用一支不同的無(wú)菌吸管。不要在陽(yáng)光直射下做稀釋。從吸管筒中取出無(wú)菌吸管時(shí)要小心操作；為了避免污染，勿使吸管尖在被拉出來(lái)時(shí)碰到露在筒外的其它吸管的頭，也勿使吸管尖觸碰稀釋瓶的瓶嘴和瓶頸。吸取水樣時(shí)，吸管尖插入水樣或稀釋樣液面下不要超過(guò)2.5cm。當(dāng)放出一定量的水樣時(shí)，握住吸管使管尖成45角接觸試管頸內(nèi)側(cè)。接種于月桂酰胰蛋白液態(tài)培養(yǎng)基發(fā)酵試管的水樣，其份量和接種數(shù)目因被檢驗(yàn)水體的特性而有所不同，不過(guò)一般是使用Iml的十進(jìn)倍數(shù)或約數(shù)來(lái)稀釋水樣。加入水樣后，振動(dòng)試管架充分混合。不

20、要讓試管翻倒。7.1.2發(fā)酵試管經(jīng)接種后于350.5培養(yǎng)。242h后，輕輕搖蕩每支試管.，并做檢查，如果沒(méi)有氣體生成并被截留在倒置的小管瓶?jī)?nèi)，則應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)，在第483h再行檢查。記錄每支試管內(nèi)有無(wú)氣體生成，氣體量則可不論。7.1.3如果在483h之內(nèi)，在內(nèi)部的發(fā)酵試管或小管瓶?jī)?nèi)生成了任何量的氣體，便可斷定為陽(yáng)性假定試驗(yàn)。試管清晰而里面有空氣泡時(shí)，不可與真正生成的氣體混同。氣體若是由發(fā)酵產(chǎn)生的，液態(tài)培養(yǎng)基會(huì)變混濁。如果輕輕振蕩發(fā)酵試管，有小氣泡不斷出現(xiàn)在小管瓶外部的整個(gè)培養(yǎng)基中，這就表示發(fā)酵活躍。7.1.4在483h的培養(yǎng)結(jié)束時(shí)仍無(wú)氣泡生成，則說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果為陰性。觀察48h的人為限制，自然沒(méi)有考

21、慮到那些產(chǎn)生氣體非常緩慢，一般對(duì)環(huán)境衛(wèi)生影響有限而又不常見(jiàn)的大腸桿菌類(lèi)細(xì)菌。7.2確信試驗(yàn)。7.2.1凡是在24h培養(yǎng)期內(nèi)顯示有任何量氣體產(chǎn)生的初步發(fā)酵度管，均應(yīng)做確信試驗(yàn)。如果不到24h初步發(fā)酵度管內(nèi)就已顯示出活躍的發(fā)酵，則應(yīng)及時(shí)轉(zhuǎn)移到確信試驗(yàn)的培養(yǎng)基中，不必等到24h結(jié)束時(shí)再轉(zhuǎn)移。如果在48h培養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，又有初步發(fā)酵試管顯示有氣體產(chǎn)生，這些試管亦應(yīng)做確信試驗(yàn)。7.2.2把顯示有氣體產(chǎn)生的初步發(fā)酵試管輕輕振蕩或轉(zhuǎn)動(dòng)，然后：(a)取一支環(huán)徑為3mm的無(wú)菌金屬接種環(huán)，轉(zhuǎn)移一個(gè)全環(huán)的培養(yǎng)到含有亮綠乳糖膽汁液態(tài)培養(yǎng)基的發(fā)酵試管中；或者(b)，將一支無(wú)菌木涂棒插入初步培養(yǎng)中至少2.5cm深，立即取出

22、，再將其插入盛有亮綠乳糖膽汁液態(tài)培養(yǎng)基的發(fā)酵試管底部，取出后棄去。7.2.3將接種后的亮綠乳糖膽汁液態(tài)培養(yǎng)基試管于350.5培養(yǎng)483h。在這段時(shí)間內(nèi)任何時(shí)刻，如果在亮綠乳糖膽汁液態(tài)培養(yǎng)基發(fā)酵試管的倒置小管瓶?jī)?nèi)有氣體產(chǎn)生，不論氣體量多寡，均可斷定為陽(yáng)性確信試驗(yàn)。7.3完成試驗(yàn).7.3.1取確信試驗(yàn)呈陽(yáng)性的試管，做完成試驗(yàn)，以明確證實(shí)大腸桿菌類(lèi)細(xì)菌的存在，并對(duì)全部被分析樣品的20提供質(zhì)量控制數(shù)據(jù)。7.3.2每一支產(chǎn)生了氣體的亮綠乳糖膽汁液態(tài)培養(yǎng)基試管，在出現(xiàn)氣體后要盡快轉(zhuǎn)移畫(huà)線到一個(gè)或數(shù)個(gè)依紅亞甲藍(lán)平皿內(nèi)。在平皿瓊脂上畫(huà)線時(shí)要確保分離長(zhǎng)出的一些菌落，至少褶隔0.5cm。畫(huà)線時(shí)要遵循下述注意事項(xiàng)，

23、以求在確實(shí)存在大腸桿菌時(shí)能獲得高數(shù)量成功的分離菌落：(a)使用尖端稍彎曲的接種針；(b)先輕擊發(fā)酵試管并使之傾斜，以避免接種針上取到任何膜狀物或浮渣；(c)針尖要插入試管液體內(nèi)大約5.0mm深；(d)在平皿上畫(huà)線時(shí)，要用針尖的彎曲部分接觸瓊脂，避免刮傷或戳破培養(yǎng)基表面。7.3.3倒置培養(yǎng)皿，于350.512培養(yǎng)242h。7.3.4在依紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出來(lái)的菌落，分別有典型的(即有菌落核心，具有或沒(méi)有金屬光澤)、非典型的(即不透明，無(wú)菌落核心、粘狀、培養(yǎng)24h后呈粉紅色)和陰性的(所有其它的)。從每個(gè)平皿上挑取1個(gè)或數(shù)個(gè)典型的、分離完全的大腸桿菌菌落；如果不存在典型菌落，就挑取2個(gè)或多個(gè)

24、被認(rèn)為最可能含有大腸桿菌類(lèi)細(xì)菌的其它菌落，分別轉(zhuǎn)移到月桂酰胰蛋白液態(tài)培養(yǎng)基發(fā)酵試管和營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上。注：在轉(zhuǎn)移茵落時(shí)，應(yīng)盡可能選取分離完全的菌落。并用經(jīng)過(guò)火焰滅菌和空氣冷卻過(guò)的轉(zhuǎn)移針稍微觸碰菌落表面。這樣可以盡量減少轉(zhuǎn)移混合細(xì)菌的可能性.。7.3.5將第二次使用的液態(tài)培養(yǎng)基(即月桂酰胰蛋白液態(tài)培養(yǎng)基一譯注)試管于350.512培養(yǎng)242h；如果在這段時(shí)問(wèn)內(nèi)沒(méi)有產(chǎn)生氣體，則繼續(xù)培養(yǎng)，在第483h再次檢查。對(duì)于顯示有氣體產(chǎn)生的液態(tài)培養(yǎng)基試管，取其相應(yīng)的24h瓊脂斜面培養(yǎng)，做革蘭氏染色(見(jiàn)第7.4節(jié))，在顯微鏡底下觀察。7.3.6在第二次的月桂酰胰蛋白液態(tài)培養(yǎng)基試管中在483h內(nèi)產(chǎn)生氣體，并且在瓊脂

25、培養(yǎng)基上被證實(shí)為革蘭氏陰性、不形成孢子的桿狀細(xì)菌，則可以認(rèn)為完成試驗(yàn)令人滿意，并確認(rèn)了存在著大腸桿菌類(lèi)細(xì)菌。7.4革蘭氏染色步驟。7.4.1在玻璃載片上滴1滴型水，從瓊脂斜面上取1點(diǎn)細(xì)菌培養(yǎng)，在水滴上調(diào)成淡的乳液。在空氣中晾干或者將載玻片穿過(guò)火焰使之固定，然后用草酸銨一結(jié)晶紫溶液染色1min。再用自來(lái)水沖洗載玻片；繼而用魯哥溶液處理1min。(有關(guān)試劑見(jiàn)第5.55.8節(jié))。7.4.2把染色后的載玻片放在自來(lái)水下沖洗，然后將載玻片夾在手指中問(wèn)，讓丙酮酒精順著載玻片流下，直到不再有染色被洗掉為止。這樣脫色處理約1530s，不要脫色過(guò)度。接著用藏紅復(fù)染15s，然后用自來(lái)水沖洗，用吸水紙吸干，最后在顯

26、微鏡底下觀察。7.4.3被脫了色的，而且能接受藏紅染色的細(xì)胞呈粉紅色，被規(guī)定為具有革蘭氏陰性反應(yīng)。沒(méi)被脫色、仍保持結(jié)晶紫染色的細(xì)胞呈深藍(lán)色，被規(guī)定為革蘭氏陽(yáng)性。7.5MPN的計(jì)算和記錄。7.5.1根據(jù)每一種稀釋度的確信試驗(yàn)或完成試驗(yàn)中的陽(yáng)性試管數(shù)目，可以由MPN表獲得樣品中大腸桿菌類(lèi)細(xì)菌的計(jì)算密度。表5-9示出了飲用水檢驗(yàn)的MPN指數(shù)和95的置信限，表5-10示出了一般應(yīng)用時(shí)的MPN指數(shù)和95的置信限。7.5.2為了確定MPN指數(shù)，需要稀釋3個(gè)。例如(參見(jiàn)表510)，假如用5個(gè)10ml；5個(gè)1.0ml和5個(gè)0.1ml份量的水樣作接種物，其中有4個(gè)10ml；2個(gè)Iml和0個(gè)0.Iml份量的接種水

27、樣給出陽(yáng)性結(jié)果，則編碼結(jié)果為4-2-0，MPN指數(shù)為22100m1。表5-9使用5個(gè)lOml的份量做檢驗(yàn)時(shí).各種陽(yáng)性和陰性結(jié)果的組合所應(yīng)有的MPN指數(shù)和95的置信限每支試管加入10ml水樣，從5支試管所得的陽(yáng)性反應(yīng)試管數(shù)MPN指數(shù)/100ml95%置信限下限上限0168.0無(wú)限7.5.3如果一系列10進(jìn)制稀釋不是1O、1和0.1ml，或者如果此系列中采用的樣品體積超過(guò)3個(gè)。則應(yīng)遵循本章參考文獻(xiàn)中規(guī)定的細(xì)菌密度測(cè)定步驟。7.5.4報(bào)告水樣的MPN數(shù)值時(shí)，一律以100ml水樣為基礎(chǔ)。8.0質(zhì)量控制8.1在環(huán)境監(jiān)測(cè)的微生物學(xué)方法一書(shū)(美國(guó)環(huán)境保護(hù)局，1978，)中的第部分，對(duì)質(zhì)量控制程序做了詳細(xì)敘述，試驗(yàn)中應(yīng)隨時(shí)嚴(yán)格遵守這些程序。8.2處理和貯存樣品時(shí)應(yīng)小心從事，盡可能使其保持原來(lái)的狀態(tài)。應(yīng)認(rèn)真選擇采樣點(diǎn)和采樣頻率，以便能夠獲得代表該點(diǎn)水質(zhì)特性和變化性的數(shù)據(jù)。水樣應(yīng)及時(shí)分析。不能及時(shí)分析時(shí)，水樣應(yīng)于l4冷藏并在6h之內(nèi)予以分析。8.3培養(yǎng)基的質(zhì)量控制對(duì)于微生物學(xué)分析的有效性至關(guān)重要。下面簡(jiǎn)單介紹一些需要考慮的重要因素。8.3.1訂購(gòu)僅夠1年使用的培養(yǎng)基，首先使用貯備時(shí)問(wèn)最長(zhǎng)的培養(yǎng)基。保存一份所有訂購(gòu)的培養(yǎng)基檔案，包括一份目視檢驗(yàn)記錄。8.3.2未啟