VEGF在妊娠肝內(nèi)膽汁淤積癥中的作用以及丹參治療機(jī)制的研究

1、VEGF在妊娠肝內(nèi)膽汁淤積癥中的作用以及丹參治療機(jī)制的研究【摘要】目的討論VEGF在妊娠肝內(nèi)膽汁淤積癥中的作用以及丹參活血化瘀改善胎兒血供的可能機(jī)制。方法采集妊娠肝內(nèi)膽汁淤積癥患者血清，Jaffe法別離培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，用IP患者血清刺激培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞，模擬IP的體內(nèi)環(huán)境，行丹參干預(yù)，與正常妊娠血清組比擬，不同含量作用不同的時(shí)間，TT法檢測(cè)細(xì)胞活力，ELISA法檢測(cè)分泌型VEGF蛋白表達(dá)。結(jié)果IP患者血清與HUVEs共培養(yǎng)：1TT法發(fā)現(xiàn)隨著血清含量的增加A值逐漸降低020%，且低于相應(yīng)濃度的正常妊娠血清組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；2ELISA法發(fā)現(xiàn)：同正常孕婦血清組相比，IP患者血清組HUVEs表達(dá)分

2、泌型VEGF蛋白降低，且隨著血清含量的增加和培養(yǎng)時(shí)間的延長，VEGF表達(dá)逐漸降低。不同濃度的丹參干預(yù)后隨著含量的增加18g/l，細(xì)胞活力和VEGF蛋白表達(dá)逐漸升高，以8g/l組作用最正確。結(jié)論IP患者血清對(duì)HUVEs具有損傷作用，使細(xì)胞活力降低。其損傷作用可能與VEGF的分泌減少有關(guān)。丹參對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用并能增加VEGF蛋白的表達(dá)。丹參可能通過增加VEGF蛋白的表達(dá)具有活血化瘀作用，改善胎盤和胎兒的血供而改善圍生兒預(yù)后。【關(guān)鍵詞】妊娠肝內(nèi)膽汁淤積癥；臍靜脈；血管內(nèi)皮細(xì)胞；血管內(nèi)皮生長因子；丹參Studyftheeffetsfvasularendthelialgrthfatrandthet

3、herapeutiehanissfSalviailtirrhizaBgeinintrahepatihlestasisfpregnany【Abstrat】bjetiveTsudytheeffetsfvasularendthelialgrthfatrandthetherapeutiehanissfSalviailtirrhizaBgeinintrahepatihlestasisfpregnany(IP).ethdsTelvepatientsithIPandtelvenralpregnanyentakepartinthisstudy,thEirseruislletedbefretherapyheni

4、nhspital.Endthelialellsareislatedfrhuanubilialveinshsedangthe10nralpregnanyardingtJaffesethd,serufdifferentnentratinfIPgrupsandnralpregnanygrupsisulturedithHUVEsfrdifferenttiepintrespetively.TTethdisappliedteasuringthevitalityfHUVEs.Theexpressinvaluefvasularendthelialgrthfatr(VEGF)isdetetedbyenzye-l

5、inkediunsrbentassay(ELISA).Resultsparedithnralpregnany,thevaluefTTinIPserugrups,theAvalueissignifiantlyler,P0.05.ThevaluefslubleVEGFinIPserugrupislerthanthatinthenalpregnanyserugrup.iththeserunetratininreases,thevaluefsVEGFdereasesintheIPgrups.paredithIPgrup,thevaluefTTandsVEGFintheSalviailtirrhizaB

6、getherapeutigrupinreasesiththenentratininrease,8g/lfSalviailtirrhizaBgeistheptialnentratin.nlusinSerufIPpatientsipairsHUVEsinvitranddereasestheexpressinfVEGF.TheehanisfserufIPpatientsipairsHUVEsaybebydereasingtheexpressinfVEGF.SalviailtirrhizaBgeuldprtetHUVEsagainsttheinjuryfIPseruandprtestheexpress

7、infVEGF.SalviailtirrhizaBgeiprvesHUVEsbyinreasingthevaluefVEGF.【Keyrds】intrahepatihlestasisfpregnany;ubilialvein;vasularendthelialell(VE);vasularendthelialgrthfatr;SalviailtirrhizaBge妊娠肝內(nèi)膽汁淤積癥intrahepatihlestasisfpregnany，IP是一種妊娠特異性的疾病1，以孕婦出現(xiàn)全身或部分皮膚瘙癢、黃疸及膽酸增高為特征。IP可引起嚴(yán)重的圍生兒并發(fā)癥，圍生兒發(fā)病率和死亡率明顯增加。關(guān)于IP胎兒宮

8、內(nèi)缺氧的機(jī)制尚不清楚。胎盤-胎兒血供受到一系列生長因子的調(diào)節(jié)，血管內(nèi)皮生長因子vasularendthelialgrthfatr，VEGF是一種直接而特異作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的高效促有絲分裂因子，在刺激新血管發(fā)生與生長及維持血管壁的完好性和通透性方面均有重要意義。VEGF對(duì)于受精、著床、胎盤血管形成及胎兒生長發(fā)育起著重要的作用。表達(dá)異常那么可能導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)氧供不良，對(duì)圍生兒產(chǎn)生不良影響。具有行氣活血作用的中藥丹參，臨床上被用于治療IP以改善圍生兒預(yù)后。本文以IP患者血清與正常臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)并用不同含量的丹參注射液進(jìn)展干預(yù)，討論VEGF在妊娠肝內(nèi)膽汁淤積癥中的作用，以及丹參活血化瘀改善胎兒血

9、供的可能機(jī)制。1資料與方法1.1研究對(duì)象搜集2022年812月在東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院和南京市婦幼保健院婦產(chǎn)科住院的正常妊娠和IP患者各12例，無菌抽取孕婦肘前靜脈血。選取擇期剖宮產(chǎn)的足月妊娠臍帶10例。納入標(biāo)準(zhǔn)：正常妊娠組：整個(gè)孕期無合并癥或并發(fā)癥；IP組：IP診斷標(biāo)準(zhǔn)遵照?中華婦產(chǎn)科學(xué)?2，并排除合并妊高征，糖尿并腎并原發(fā)性高血壓、貧血及其他內(nèi)科合并癥。孕齡診斷正確，否認(rèn)有吸煙、激素治療史。剖宮產(chǎn)指征：均未臨產(chǎn)，系因骨盆、胎位、珍貴兒及社會(huì)因素等而行擇期剖宮產(chǎn)者。1.2方法參照J(rèn)affe法行臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)，經(jīng)倒置相差顯微鏡、Giesa染色和人第因子抗原鑒定為血管內(nèi)皮細(xì)胞。以正常妊娠孕

10、婦血清作為對(duì)照,當(dāng)細(xì)胞交融60%-80%時(shí)，參加不同濃度的IP患者血清刺激24h，TT法檢測(cè)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的活力；不同含量的IP患者血清分別刺激12h、24h、36h，按照ELISA試劑盒操作步驟檢測(cè)培養(yǎng)上清液中分泌型可溶性VEGF的變化。不同含量的丹參注射液進(jìn)展干預(yù)，分別檢測(cè)細(xì)胞活力和VEGF蛋白的變化。1.3試劑和儀器RPIediu1640培養(yǎng)基：GIBBRL公司產(chǎn)品；胎牛血清(100l/瓶)：杭州四季青消費(fèi)；型膠原酶：HYbiheialrpratin公司產(chǎn)品；TT粉劑，購自SIGA公司；ELISA試劑盒購自晶美生物工程北京。GBB16型2培養(yǎng)箱，LYPUSK2型倒置顯微鏡，SPETRAA

11、X250型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，96孔培養(yǎng)板。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)均以xs表示，組間多個(gè)樣本均數(shù)間比擬采用方差分析，兩兩之間用q檢驗(yàn)，兩樣本均數(shù)比擬用成組t檢驗(yàn)。采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件2結(jié)果2.1IP患者血清對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響IP患者血清刺激內(nèi)皮細(xì)胞24h后，細(xì)胞吸光度A值隨著濃度的增加逐漸降低；并低于相應(yīng)濃度的正常血清組P0.05。詳細(xì)數(shù)據(jù)如表1所示。表1不同濃度的正常孕婦和IP患者血清干預(yù)后HUVEs的A值略2.2IP患者血清對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌VEGF蛋白的影響不同濃度的IP患者血清刺激不同的時(shí)間，HUVEs分泌VEGF蛋白量詳細(xì)數(shù)據(jù)見表2。IP患者血清各濃度組均低于相應(yīng)濃度正常

12、組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。隨著血清含量的增加，VEGF蛋白量降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外隨著IP患者血清與HUVEs作用時(shí)間的延長，VEGF蛋白的分泌量逐漸降低。表2不同濃度的IP患者血清干預(yù)后HUVEs分泌VEGF蛋白量略注：10%IP患者血清組，24h、36h和12h相比P0.05；20%IP患者血清組，24h、36h和12h相比P0.052.3丹參注射液對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響在20%IP患者血清干預(yù)的同時(shí)，分別參加不同含量丹參注射液共同培養(yǎng)24h后，相應(yīng)組別的細(xì)胞吸光度A值見表3。與IP患者血清組相比，隨著丹參含量的增加，其A值逐漸增加。表3不同濃度的丹參注射液干預(yù)后HUVEs的A值略注：與IP

13、組比1)P0.052.4丹參注射液對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌型VEGF蛋白的影響20%IP患者血清和不同含量的丹參注射液共刺激HUVEs24h后，ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白量的變化，詳細(xì)數(shù)據(jù)見表4。表4不同濃度的丹參注射液干預(yù)24h后HUVEs分泌的VEGF量略注：與IP組比1)P0.053討論妊娠肝內(nèi)膽汁淤積癥是一種妊娠特有的疾病，其對(duì)孕婦的損傷相對(duì)較輕，妊娠終止后12天患者的瘙癢病癥消失，膽汁酸、轉(zhuǎn)氨酶等也迅速恢復(fù)正常。但其對(duì)圍生兒的影響嚴(yán)重，圍生兒的發(fā)病率和死亡率明顯升高，如導(dǎo)致早產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)窘迫、死胎、死產(chǎn)等，成為高危妊娠極為棘手的疾病13。IP胎兒宮內(nèi)缺氧、圍生兒預(yù)后不良確實(shí)

14、切機(jī)制尚不明了。胎兒在母體內(nèi)血、氧的供給來自于胎盤，胎盤血管的發(fā)育受到血管內(nèi)皮生長因子等一系列生長因子的調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)4妊娠全過程中胎盤、胎兒均有較高的VEGF及其受體的表達(dá)，并具有時(shí)間和空間的特異性。inther5提出VEGF對(duì)胎盤的形成和發(fā)育起重要作用，其在胎盤中表達(dá)量的變化與胎盤血管的發(fā)育相一致。妊娠早期VEGF促進(jìn)胎盤血管網(wǎng)絡(luò)的發(fā)育，妊娠晚期又發(fā)揮調(diào)節(jié)血管完好性和通透性的作用，維持母胎之間的營養(yǎng)交換。Stephen6等發(fā)現(xiàn)羊的胎兒胎盤動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中通過自分泌機(jī)制調(diào)節(jié)胎盤的血管發(fā)生和其他功能。IP的母體循環(huán)、胎兒循環(huán)、羊水及胎糞均表現(xiàn)為高膽汁酸程度，研究發(fā)現(xiàn)膽汁酸對(duì)細(xì)胞具有毒性作用，并與

15、濃度和時(shí)間呈正相關(guān)。有學(xué)者在體外應(yīng)用膽汁酸刺激培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜的通透性增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡。在膽汁酸等病理因素的刺激下，胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞及胎盤血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，導(dǎo)致VEGF的分泌量降低，因此血管發(fā)生、增加血管通透性、調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的完好性等功能降低，這一結(jié)果更加重了滋養(yǎng)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的受損，導(dǎo)致胎兒缺氧等嚴(yán)重的并發(fā)癥。本實(shí)驗(yàn)以IP患者血清與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，與正常妊娠組相比，IP患者血清刺激后的內(nèi)皮細(xì)胞活力降低，細(xì)胞增殖緩慢，隨著血清濃度的增加細(xì)胞的活力逐漸降低，表現(xiàn)為TT實(shí)驗(yàn)的A值降低。說明IP患者血清對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有損傷作用。通過ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清液中的VEGF蛋白含量

16、發(fā)現(xiàn)，隨著血清濃度的增加VEGF蛋白量降低，一樣濃度下，VEGF分泌量隨血清培養(yǎng)時(shí)間的增加而降低。在IP患者血清的干預(yù)下，可使內(nèi)皮細(xì)胞自分泌血管內(nèi)皮生長因子降低，VEGF具有促內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂作用，因此細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞活力降低。由此推論，IP時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞分泌VEGF的降低，導(dǎo)致了胎盤、胎兒血管生發(fā)和血管通透性的降低，導(dǎo)致了胎兒供血、供氧的缺乏，進(jìn)而出現(xiàn)一系列的并發(fā)癥。中醫(yī)理論認(rèn)為IP濕熱內(nèi)蘊(yùn)，營衛(wèi)不和，氣滯血行不暢7。丹參已被臨床用于治療IP減輕患者的瘙癢病癥。大量研究說明丹參對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用8，9，可以減少細(xì)胞的氧化損傷、抑制細(xì)胞的凋亡。本實(shí)驗(yàn)以IP患者血清和HUVEs共培養(yǎng)，并

17、用不同含量的丹參注射液進(jìn)展干預(yù)。TT結(jié)果說明：丹參干預(yù)后細(xì)胞的A值增加，隨著藥物濃度的增加18g/lA值逐漸升高，具有一定的濃度依賴性。這說明丹參能促進(jìn)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的生長、增殖，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，能抑制或減輕IP患者血清對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。在一定濃度的范圍內(nèi)，此種保護(hù)作用隨著濃度的增加而增加。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“氣血相關(guān)、“補(bǔ)氣活血，因此具有行氣活血作用的丹參藥可能具有促血管生成作用。丹參活血化瘀、對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用是否與VEGF有關(guān)？僅徐杰等10研究發(fā)現(xiàn)丹參多酚酸鹽能使單核細(xì)胞VEGFRNA分泌升高，并能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了丹參注射液能使受損傷HUVEs的分泌VEGF

18、蛋白增加ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液中的VEGF，隨著濃度的增加，VEGF分泌量具有一定的濃度依賴性。丹參促使VEGF蛋白分泌增加與對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞地保護(hù)作用相一致。由此推論丹參可能通過促使臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞自分泌VEGF這一內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂原，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的分裂、增殖，加速細(xì)胞的生長，進(jìn)而間接的保護(hù)了內(nèi)皮細(xì)胞；內(nèi)皮細(xì)胞增殖的加速以及功能的維持又促進(jìn)了VEGF的表達(dá)和分泌。因此，丹參可能通過增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的VEGF表達(dá)，促使血管生發(fā)和增強(qiáng)血管的通透性，胎盤部位血流灌注增加，促進(jìn)了母胎之間血、氧交換，改善了圍生兒因血供缺乏而引起的缺氧窘迫、發(fā)育緩慢，從而改善了圍生兒預(yù)后?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1GerainA,arvajalJA,GlasinviJ,etal.Intrahepatihlestasisfpregnany:anintriguingpregnany-speifidisrder.JSGynelInvestig,2002,9:10-14.2曹澤毅.中華婦產(chǎn)科學(xué).北京：人民衛(wèi)生出版社,1999,500-507.3ReyesH.Revie:intrahepatihlestasis.Apuzzlingdisrderfpre