畢業(yè)論文定稿(共12頁)

1、編號(bin ho):2010041152畢業(yè)論文(b y ln wn)（2014屆本科(bnk)）論文題目：大腸桿菌噬菌體分離純化研究學(xué) 院: 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 專 業(yè): 生物科學(xué) 班 級： 10級生科（1）班 作者姓名： 鄭小云 指導(dǎo)教師： 毛寧 職稱： 助教 完成日期： 2014 年 6 月 3 日目 錄 TOC o 1-3 h z u HYPERLINK l _Toc390034229 隴東學(xué)院(xuyun)本科生畢業(yè)論文誠信聲明 隴東學(xué)院本科生畢業(yè)論文誠信(chn xn)聲明本人鄭重聲明：所呈交的本科畢業(yè)論文，是本人在指導(dǎo)老師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果，成果不存在知識產(chǎn)

2、權(quán)爭議，除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果。對本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個人和集體均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意識(y sh)到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。作者(zuzh)簽名：二O一年月日大腸桿菌噬菌體分離(fnl)純化研究鄭小云（隴東學(xué)院(xuyun)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 甘肅 慶陽 745000）摘要(zhiyo)：以本實(shí)驗室保藏的大腸桿菌E.coli NO1和E.coli NO2為宿主菌，采用雙層瓊脂平板法從環(huán)境污水中分離純化得到一株烈性大腸桿菌噬菌體Pha1，研究其對大腸桿菌的裂解曲線及Ca2+、Mg2+對噬菌體裂解率的影響。結(jié)果表明

3、，噬菌體pha1對E.coli NO1有較強(qiáng)的裂解作用，對E.coli NO2沒有裂解作用；在培養(yǎng)基中添加Ca2+和Mg2+時，噬菌體出斑率明顯高于對照，說明Ca2+和Mg2+均可促進(jìn)噬菌體生長；當(dāng)加入200mg/ L 的Ca2+或250mg/L Mg2+時，相對出斑率最高，分別達(dá)到187%和178%。關(guān)鍵詞：大腸桿菌；噬菌體；分離純化 Research on separation and purification of E.coli phageZHENG Xiao-yun(College of life science and technology, Long dong University

4、, Qing yang Gansu 745000 )Abstract: A strain of bacteriophage Pha1 was isolated from wastewater using double layer agar plate method, With the E.coli NO1 and E.coli NO2 preserved in our laboratory as the host cell. The curves of E.coli lysed by Pha1 and the effects of Ca2+, Mg2+ on phage cracking ra

5、te was studied. The results showed that, pha1 had strong schizolysis effect on E-coli NO1, but no effect on E-coli NO2; the number of plagues was significantly higher in the medium supplemented with Ca2+ and Mg2+ than in the control, which indicated that Ca2+ and Mg2+ could promote the growth of pha

6、1; when adding 200mg/ L Ca2+ or 250mg/L Mg2+, the plagues ratio was the highest, reaching 187% and 178% respectively.Key words: E.coli; phages; isolating and purifing1引言 噬菌體是一類感染細(xì)菌、放線菌等微生物的病毒，體積微小、結(jié)構(gòu)簡單、具有嚴(yán)格的寄生性，廣泛分布于自然界中1。噬菌體作為指示微生物，在監(jiān)測水質(zhì)環(huán)境、指示污染程度等方面的研究也有了一些進(jìn)展2。因此，分離和研究噬菌體，弄清楚噬菌體與其宿主之間的生態(tài)學(xué)關(guān)系，對于監(jiān)測水質(zhì)環(huán)

7、境，控制水質(zhì)污染等方面的工作無疑具有指導(dǎo)意義。鑒于噬菌體有溶菌作用和嚴(yán)格的種型特異性3，可利用噬菌體作細(xì)菌的鑒定和分型，亦可用于檢測標(biāo)本中的未知細(xì)菌和防治某些傳染病4。噬菌體作為一種新的治療制劑已受到廣泛關(guān)注5。本研究旨在通過分離大腸桿菌噬菌體, 研究其生理特性，為將噬菌體作為一種生物制劑，應(yīng)用于治療細(xì)菌性感染等方面提供參考和依據(jù)。2 材料(cilio)與方法(fngf)2.1材料(cilio)噬菌體樣品來源：陰溝污水（100ml）菌種：隴東學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗室保藏的大腸桿菌E.coli NO1和E.coli NO2培養(yǎng)基：3倍牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液，牛肉膏培養(yǎng)液，牛肉膏蛋白胨半固體

8、培養(yǎng)基（倒上層用），牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（倒底層平板用）6試驗器材：離心機(jī)，細(xì)菌濾器，抽濾裝置，恒溫水浴鍋，高壓蒸汽滅菌鍋，超凈工作臺，無菌涂布器，無菌吸管，培養(yǎng)皿，三角瓶，移液管，試管，漏斗等2.2方法2.2.1大腸桿菌噬菌體的分離7,8A.培養(yǎng)大腸桿菌：活化培養(yǎng)實(shí)驗室保藏的大腸桿菌E.coli NO1和E.coli NO2至對數(shù)期（OD600值0.8左右）。B.增殖噬菌體樣品：取上述大腸桿菌培養(yǎng)液6ml于盛有50ml 3倍牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液的三角瓶內(nèi)，后加入污水樣100ml（離心并過濾除菌），繼續(xù)37搖床振蕩培養(yǎng)1214h，以增殖噬菌體。C.富集噬菌體：將以上培養(yǎng)液3000r/min離心

9、30min，將上清液過濾除菌，取100ml濾液及5ml大腸桿菌液加入50ml 3倍牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，37培養(yǎng)1218h進(jìn)行噬菌體富集。將以上富集液3000r/min離心30min后，取上清液10mL加入 5mL 3倍牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液及相應(yīng)宿主菌液1mL，室溫下放置 1h，37 120rpm振蕩培養(yǎng) 3.5h。D.收集(shuj)噬菌體：將上述(shngsh)培養(yǎng)液于 4下12000g 離心(lxn)30min，上清液再經(jīng)微孔濾膜（0.22m）過濾，濾液即為擬含有相應(yīng)宿主菌噬菌體的原液9。E.驗證噬菌體存在：在大腸桿菌平板上，滴加上述濾液57小滴,同時滴加生理鹽水作為對照，進(jìn)行標(biāo)記，37培

10、養(yǎng)1820h，若出現(xiàn)噬菌斑，則證明濾液中存在噬菌體10,11 。2.2.2大腸桿菌噬菌體的純化12(1)用接種環(huán)取菌液一環(huán)接種于液體培養(yǎng)基內(nèi)，再加人0.1ml大腸桿菌懸液，使混合均勻。(2）取上層瓊脂培養(yǎng)基，溶化并冷至48（可預(yù)先溶化、冷卻，放48水溶箱內(nèi)備用）,加入以上噬菌體與細(xì)菌的混合液0.2ml，立即混勻，并立即倒人底層培養(yǎng)基上，混勻，置37培養(yǎng)12h。(3）此時長出的分離的單個噬菌斑，其形態(tài)、大小常不一致，再用接種針在單個噬菌斑中刺一下，小心采取噬菌體，接入含有大腸桿菌的液體培養(yǎng)基內(nèi)。于37培養(yǎng)。(4)等待管內(nèi)菌液完全溶解后，過濾除菌，即得到純化的噬菌體。2.2.3噬菌體效價的測定13

11、(1)倒平板：將融化后冷卻到45左右的下層肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基傾倒于11個無菌培養(yǎng)皿中，每皿約傾注10mL培養(yǎng)基，平放，待冷凝后在培養(yǎng)皿底部注明噬菌體稀釋度。(2)稀釋噬菌體：按10倍稀釋法，吸取0.5mL大腸桿菌噬菌體，注入一支裝有4.5mL1%蛋白胨水的試管中，即稀釋到10-1，依次稀釋到10-6稀釋度。(3)噬菌體與菌液混合:將11支滅菌空試管分別標(biāo)記10-4、10-5、10-6和對照。分別從10-4、10-5和10-6噬菌體稀釋液中吸取0.1mL于上述編號的無菌試管中，每個稀釋度平行做三個管，在另外兩支對照管中加0.1mL無菌水，并分別于各管中加入0.2mL大腸桿菌菌懸液，振蕩試管使菌

12、液與噬菌體液混合均勻，置37水浴中保溫5min，讓噬菌體粒子充分吸附并侵入菌體細(xì)胞。(4)接種上層平板:將11支融化并保溫于45的上層肉膏蛋白胨半固體瓊脂培養(yǎng)基5mL分別加入到含有噬菌體和敏感菌液的混合管中，迅速搖勻，立即倒入相應(yīng)編號的底層培養(yǎng)基平板表面，邊倒入邊搖動平板使其迅速地鋪展表面。水平靜置，凝固后置37培養(yǎng)。(5)觀察并計數(shù)(j sh)：觀察平板中的噬菌斑，并將結(jié)果記錄于實(shí)驗報告表格(biog)內(nèi)，選取每皿有30300個噬菌斑的平板計算(j sun)噬菌體效價的測定。 計算公式：N=Y/VX（：效價值，：平均噬菌斑數(shù)皿，：取樣量，：稀釋度） 2.2.4噬菌體對大腸桿菌的裂解曲線14在

13、細(xì)菌懸液中加入噬菌體，由于噬菌體對細(xì)菌的裂解作用，導(dǎo)致細(xì)菌懸液OD600的值產(chǎn)生變化，由此得到噬菌體對細(xì)菌的裂解曲線。分別以E. coli NO1和E. coli NO2作為宿主菌。將過夜培養(yǎng)的細(xì)菌懸液以1:100的比例轉(zhuǎn)接到100mL LB培養(yǎng)基中，37160rpm振蕩培養(yǎng)1.5h（OD600約0.5，約 1.5108cfu/ml），將菌懸液平均分裝在2個無菌的錐形瓶中，向其中分別加入E. coliNO1和E. coliNO2噬菌體懸液1109pfu（經(jīng)過 0.22m微孔濾膜過濾），立即置于37、160rpm振蕩培養(yǎng)，每隔20min取樣0.1ml，測定OD600的值。同時以不加噬菌體的細(xì)菌作

14、為對照，試驗重復(fù)三次。2.2.5 Ca2+、Mg2+對噬菌體裂解率的影響15,16在下層固體瓊脂和上層半固體瓊脂中分別加入Mg2+和Ca2+ ,使終濃度分別為0、50、100、150、200、250、300、350、400、450mg/l, 然后取1.0103pfu/ml的噬菌體液和培養(yǎng)8h 的菌液，用雙層平板法，測定出斑情況17。3結(jié)果與分析3.1噬菌體的分離與純化本試驗采用雙層瓊脂平板法分離純化噬菌體，以實(shí)驗室保藏的E. coli NO1和E. coli NO2為宿主菌，分離得到了1株烈性噬菌體Pha1。初次分離所得的噬菌體噬菌斑較小，效價比較低，約為1.5104pfu/mL。故需進(jìn)一步純

15、化擴(kuò)增。為得到效價較高、裂解能力較強(qiáng)的噬菌體，對初次分離得到的噬菌體進(jìn)行反復(fù)分離純化，直到噬菌斑在形態(tài)和大小上基本一致，即可得到純化的大腸桿菌噬菌體(圖1)。噬菌體Pha1形成的噬菌斑較明顯，圓形透明，直徑0.8-2.0mm，表現(xiàn)出典型的裂性噬菌體的菌斑特征。噬菌斑的大小不一，可能表示有不同的噬菌體被富集, 為不同噬菌體的進(jìn)一步純化提供了良好的基礎(chǔ)。圖1.分離(fnl)所得大腸桿菌(d chn n jn)噬菌斑Fig1. Plaques of pha13.2噬菌體效價的測定(cdng)表1. 噬菌體效價測定結(jié)果Tab 1 Pfu/ml of phage Pha1噬菌體稀釋倍數(shù)效價（pfu/ml

16、）10-410-510-610-7CK4.311033.131042.981032.03102/3.3噬菌體pha1對大腸桿菌的裂解曲線 圖2 噬菌體pha1對大腸桿菌(d chn n jn)E-coli NO1的裂解(li ji)曲線Fig.2 The curves of E.coli NO1 lysed by pha1圖3 噬菌體pha1對大腸桿菌(d chn n jn)E-coli NO2的裂解曲線Fig.2 The curves of E.coli NO2 lysed by pha1由圖2和3可知，E. coli NO1菌體混合懸液的OD600值先升高后下降，說明噬菌體pha1對E-c

17、oli NO1有較強(qiáng)的裂解作用；E. coli NO2與噬菌體混合液的OD600值一直呈上升趨勢，故噬菌體pha1對E. coli NO2沒有裂解作用。3.4 Ca2+、Mg2+對噬菌體裂解率的影響18由結(jié)果(圖4) 可知，在培養(yǎng)基中添加Ca2+和Mg2+時，噬菌體出斑率明顯高于對照，說明添加Ca2+和Mg2+均可促進(jìn)噬菌體出斑。當(dāng)加入200mg/ L 的Ca2+或250mg/L Mg2+時，相對出斑率最高，分別達(dá)到187%和178%。圖4 Ca2+ 和Mg2+離子(lz)對噬菌體出斑率的影響(yngxing)Fig 4 .The effects of Ca2+ and Mg2+ on the

18、 number of plagues4討論(toln)噬菌體是感染細(xì)菌的病毒, 按其與宿主的關(guān)系可將其可分為烈性噬菌體與溫和噬菌體19。噬菌體對宿主的裂解和感染是特異性的, 是由受體決定的, 很少產(chǎn)生耐藥性的問題, 也不會造成機(jī)體的菌群失調(diào), 每種細(xì)菌都有自身敏感的噬菌體 20,21 。本試驗從污水中分離出1株烈性大腸噬菌體Pha1。初次分離所得的噬菌體噬菌斑較小，效價比較低，對初次分離得到的噬菌體進(jìn)行反復(fù)分離純化得到了效價較高、裂解能力較強(qiáng)的噬菌體。噬菌體對宿主菌的裂解作用具有極強(qiáng)的特異性22，噬菌體pha1對E.coli NO1有較強(qiáng)的裂解作用，對E.coli NO2沒有裂解作用，說明噬菌

19、體pha1對E.coli NO1有特異性。Ca2+和Mg2+能夠促進(jìn)噬菌體的吸附與注入，有利于噬菌體的繁殖，對促進(jìn)噬菌體的形成有明顯效果，所以在培養(yǎng)基中添加Ca2+和Mg2+時，噬菌體出斑率明顯高于對照。參考文獻(xiàn)1司穉東,何曉青.噬菌體學(xué)M.北京:科學(xué)出版社,1996. 2 李梅, 胡洪營. 噬菌體作為水中病毒指示物的研究進(jìn)展 J . 中國給水排水, 2005, 21 ( 2) : 23 26.3徐焰.噬菌體溶菌機(jī)制研究進(jìn)展J.重慶醫(yī)學(xué),2003,32(1):106-108.4 邢繼蘭(譯).利用噬菌體治療大腸桿菌病和預(yù)防食源性 病原J.國外畜牧學(xué)-豬與畜,2005,25(6):39-41.5

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