薄層色譜分離葉綠素

1、一實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆仗崛∪~綠素的方法；了解薄層層析的原理，掌握薄層層析的一般操作和定性鑒定方法二實(shí)驗(yàn)原理葉綠素提取高等植物體內(nèi)的葉綠體色素有葉綠素和類胡蘿卜素兩類，主要包括葉綠素a (C55H72O5N4Mg)、葉綠素 b(C55H70O6N4Mg)、8胡蘿卜素(C40H56)和葉黃素 (C40H56O2)等4種。葉綠素a和葉綠素b為毗咯衍生物與金屬鎂的配合物，胡蘿卜素是一 種橙色天然色素，屬于四萜類，為一長鏈共軛多烯，有a、8、y三種異構(gòu)體，其中，8異構(gòu) 體含量最多。葉黃素為一種黃色色素，與葉綠素同存在于植物體中，是胡蘿卜素的羥基衍生 物，較易溶于乙醇，在乙醚中溶解度較小。根據(jù)它們的化學(xué)特性，可將

2、它們從植物葉片中提 取出來，并通過萃取、沉淀和色譜方法將它們分離開來。薄層色譜薄層層析是快速分離和定性分析微量物質(zhì)的一種極為重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，具有設(shè)備簡單、操作 方便而快速的特點(diǎn)。它是將固定相支持物均勻地鋪在玻片上制成薄層板，將樣品溶液點(diǎn)加在 起點(diǎn)處，置于層析容器中用合適的溶劑展開而達(dá)到分離的目的。用此法分離時(shí)幾乎不受溫度 的影響，可采用腐蝕性顯色劑，而且可在高溫下顯色，特別適用于揮發(fā)性小或在較高溫度下 易發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)，同時(shí)也常用來跟蹤有機(jī)反應(yīng)或監(jiān)測有機(jī)反應(yīng)完成的程度。薄層層析的器材選擇：(1)基板：玻璃、塑料、金屬箔，常用玻璃板。2)吸附劑：吸附劑要有合適的吸附力，并且必須與展開劑和被吸附物

3、質(zhì)均不起化學(xué)反應(yīng)?？捎米魑絼?的物質(zhì)很多，常用的有硅膠和氧化鋁，由于吸附性好，適用于各類化合物的分離，應(yīng)用最廣。 選擇吸附劑時(shí)主要根據(jù)樣品的溶解度、酸堿性及極性。氧化鋁一般是微堿性吸附劑，適用于 堿性物質(zhì)及中性物質(zhì)的分離；而硅膠是微酸性吸附劑，適用于酸性物質(zhì)及中性物質(zhì)的分離。 以下簡單介紹吸附劑的幾個(gè)基本參數(shù)。種類：常用：氧化鋁(強(qiáng)極性)、硅膠(中強(qiáng)極性)不常用：硅藻土、纖維素、糖類、活性碳符號(hào)：H無任何添加劑；G加有鍛石膏(Gypsum，CaSO41/2 H2O)粘合劑；F加有熒光素(Fluorescein)CMC加有羧甲基纖維素鈉(Carboxymethyl cellulose)例：硅膠

4、GF254表示硅膠中既加有煅石膏粘合劑，也加有熒光素，可以在波長254nm的 紫外光下激發(fā)出熒光粒度：目：1cm2內(nèi)的篩孔數(shù)，數(shù)目越大，顆粒越小。薄層所用吸附劑顆粒較細(xì)，氧化鋁為 200目，硅膠為100150目。山顆粒的平均直徑，以微米表示。例如：40p的顆粒與100目相當(dāng)?；钚裕何絼┌雌浜康亩嗌俑鞣譃槲鍌€(gè)等級(jí)：I級(jí)含水量最少，活性最高；V級(jí)含水量最多， 活性最低；但并不是活性越高分離效果越好，選用哪種活性級(jí)別的吸附劑，要用實(shí)驗(yàn)的方法 來確定。酸堿性：市售氧化鋁有酸性（用以分離酸性化合物）、中性、堿性（用以分離生物堿等堿性化合物）， 其蒸餾水洗出液的pH值分別為4、7.5、9-10；其中

5、以中性氧化鋁應(yīng)用最廣，可用來分離 各種化合物，特別是那些對(duì)酸、堿敏感的化合物。硅膠沒有酸堿性之分。（3）展開劑在樣品組分-吸附劑-展開劑三個(gè)因素中。對(duì)一確定組分，樣品的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)可看作是一不 變因素，吸附劑和展開劑是可變因素。而吸附劑的種類有限，因此選擇合適的展開劑就成為 解決問題的關(guān)鍵。展開劑的選擇有以下要求：（a）對(duì)待測組分有很好的溶解度。（b）能使待測組分與雜質(zhì)分開，與基線分離。（c）使展開后的組分斑點(diǎn)圓而集中，不應(yīng)有拖尾現(xiàn)象。（d）使待測組分的Rf值最好在0.40.5，如樣品中待測組分較多，Rf值則可在0.250.75 范圈內(nèi)，組分間的Rf值最好相差0.1左右。由于薄層色譜法用途非常廣

6、泛，國內(nèi)外均有現(xiàn) 成的鋪有吸附劑的薄層板出售。一般實(shí)驗(yàn)室中也可自己制備。（e）不與組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，或在某些吸附劑存在下發(fā)生聚合。（f）具有適中的沸點(diǎn)和較低的粘滯度。展開劑的極性是指與樣品組分相互作用時(shí)。展開劑分子與吸附劑分子的色散作用、偶極作 用、氫鍵作用及介電作用的總和。展開劑要根據(jù)樣品的極性及溶解度，吸附劑活性等因素進(jìn) 行選擇，總的原則是展開劑的極性能使組分的Rf值在0.5左右。常用溶劑極性次序是：石 油醚 環(huán)己烷 苯 乙醚 氯仿 乙酸丁酯 正丁醇 丙酮 乙醇 甲醇。如一種溶劑不能充分展開，可選用二元或多元溶劑系統(tǒng)。展開槽與展開：薄層的展開在密閉的容器即展開槽或稱為層析缸中進(jìn)行。展開：合

7、適的展開劑用量為浸及下端硅膠，但不浸及樣點(diǎn)；點(diǎn)樣端向下，每次只展開一塊，放在正 中，以免爬斜（進(jìn)而展開傾斜）。顯色：如果化合物本身有顏色，就可直接觀察它的斑點(diǎn)。如果本身無色，可先在紫外燈光下觀察有 無熒光斑點(diǎn)（有苯環(huán)的物質(zhì)都有），用鉛筆在薄層板上劃出斑點(diǎn)的位置；對(duì)于在紫外燈光下 不顯色的，可放在含少量碘蒸氣的容器中顯色來檢查色點(diǎn)（因?yàn)樵S多化合物都能和碘成黃棕 色斑點(diǎn)），顯色后，立即用鉛筆標(biāo)出斑點(diǎn)的位置。常用普適性顯色劑：濃硫酸、碘蒸氣、熒光素，專用顯色劑：茚三酮、三氯化鐵溶液等三、實(shí)驗(yàn)儀器與藥品儀器：半微量玻璃儀器一箱，小燒杯，層析缸（槽），載玻片（100mmx25mm）干燥器，電吹風(fēng)， 毛細(xì)

8、管，移液管，研缽，布氏漏斗，抽濾裝置。試劑：硅膠，1% CMC，石油醚（6090C），乙醇，丙酮，乙醚，飽和NaCl溶液，無水 Na2SO4四、實(shí)驗(yàn)步驟1、制板：將硅膠加1% CMC，調(diào)成槳狀（硅膠：CMC=1:34）（在平鋪玻璃板上能晃動(dòng)但不能流動(dòng)）， 將其涂在載玻片上（100mmx25mm），為使其坦平，可將載玻片用手端平晃動(dòng)，至平坦 為止，放在干凈平坦的臺(tái)面上，晾干之后放入105C烘箱活化1小時(shí)，取出放入干燥器內(nèi)待 用。2、葉綠素的提取在研缽中放入幾片（約5g）菠菜葉（新鮮的或冷凍的都可以.如果是冷凍的，解凍后包在紙中 輕壓吸左水分）。加人10mL2:1石油醚和乙醇混合液，適當(dāng)研磨。將提

9、取液用滴管轉(zhuǎn)移至分 液漏斗中，加人10 mL飽和NaCl溶液（防止生成乳濁液）除去水溶性物質(zhì)，分去H2O層， 再用蒸餾水洗滌兩次。將有機(jī)層轉(zhuǎn)入干燥的小錐形瓶中，加2g入無水Na2SO4干燥。干燥 后的液體傾至另一錐形瓶中（如溶液顏色太淺，可在通風(fēng)柜中適當(dāng)蒸發(fā)濃縮）。3、點(diǎn)樣用一根內(nèi)徑1mm的毛細(xì)管，吸取適量提取液，輕輕地點(diǎn)在距薄板一端1.5cm處，平行 點(diǎn)兩點(diǎn)，兩點(diǎn)相距1cm左右。若一次點(diǎn)樣不夠，可待樣品溶劑揮發(fā)后.再在原處點(diǎn)第二次， 但點(diǎn)樣斑點(diǎn)直徑不得越過2mm。4、展開先在層析缸中放入展開劑石油醚（6090C）-丙酮一乙醚（體積比為3:1:1），加蓋使缸內(nèi)蒸 氣飽10min，再將薄層板斜靠

10、于層析缸內(nèi)壁。點(diǎn)樣端接觸展開劑但樣點(diǎn)不能浸沒于展開劑 中，密閉層祈缸。待展開劑上升到距薄層板另一端約1crm時(shí)，取出平放，用鉛筆或小針劃 前沿線位置，晾干或用電吹風(fēng)吹干薄層。五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)制板時(shí)用注意使板上硅膠厚度盡量一致。植物葉片不要研成糊狀，否則會(huì)給分離造成困難六、實(shí)驗(yàn)思考題做薄層色譜法實(shí)驗(yàn)時(shí)，為什么展開劑不可浸過樣品點(diǎn)？根據(jù)原理，色譜法需要溶劑與固定相的相對(duì)流動(dòng)，才能夠通過不同組分“溶解、吸 附平衡”的不同，使它們隨溶劑的遷移速率不同（極性小溶解好的遷移快，極性大易于吸附 的遷移慢），從而達(dá)成分離。具體到TLC而言，溶劑靠硅膠板“虹吸作用”從溶劑液面起向上流動(dòng)。這也就是說，被溶劑 泡著的那部分板子上，溶劑實(shí)際上是同板子相對(duì)靜止的，沒有相對(duì)流動(dòng)也就自然無法達(dá)到分 離。為什么薄層色譜檢時(shí)出現(xiàn)一條線而不是一個(gè)亮點(diǎn)？出現(xiàn)像你所說的這種情況的原