研究生實驗課植物生理

1、研究生實驗課植物生理實驗課的要求掌握實驗原理，學習方法。培養(yǎng)研究生的獨立工作能力，科學、規(guī)范完成實驗及其實驗報告。學會打時間差，提高效率。研究生實驗報告基本要求格式 實驗題目：（居中）姓名 專業(yè) 學號 日期 成績一、實驗目的：二、實驗原理三、實驗器皿：四、實驗步驟：1.*2.*五、實驗記錄六、實驗結果與分析研究生實驗報告基本要求每次實驗完畢后一周內(nèi)交實驗報告B209。A4打印。中文用宋體，英文和數(shù)字用Times New Roman。數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。用Excel作圖，圖包括圖序、圖標、圖線、圖注等，注明參數(shù)及單位。表格采用三線表，必要時可加輔助線；表中參數(shù)應注明量和單位，如所有欄或大部分欄的單

2、位相同，可將單位標注在表的右上角，其余單位標注在相應的欄內(nèi)；單位一律采用中華人民共和國法定計量單位。植物適應逆境機制生長發(fā)育與形態(tài)結構滲透脅迫與滲透調(diào)節(jié)植物激素與抗逆性活性氧及其清除系統(tǒng)逆境蛋白與抗逆基因植物抗性的交叉反應實驗內(nèi)容（40學時）酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定植物激素含量（）1植物的莖尖培養(yǎng)（）2氣孔運動及其影響因素、鈣參與ABA 調(diào)控氣孔運動的信號轉(zhuǎn)導（）3幾種逆境相關生理指標的測定（）4常用儀器講座（11月）5氣孔運動及其影響因素 鈣參與ABA 調(diào)控氣孔運動的信號轉(zhuǎn)導B116氣孔是陸生植物與外界環(huán)境交換水分和氣體的主要通道及調(diào)節(jié)機構。目的和意義探明植物激素和外界環(huán)境因素對氣孔運動

3、的影響證明鈣參與ABA對氣孔運動的調(diào)控學習剝離表皮的方法和顯微鏡的使用氣孔運動及其影響因素、 鈣參與ABA 調(diào)控氣孔運動的信號轉(zhuǎn)導B116取3-4周齡蠶豆或鴨跖草幼苗最上端剛完全展開的葉片.暗處或光下預處理23h實驗材料：1.鉀離子對氣孔開度的影響（3種處理）KNO3、 NaNO3與蒸餾水。2. CO2對氣孔運動的影響（2種處理） 1 mol/L NaOH 溶液的大培養(yǎng)皿中，用燒杯罩住，其中CO2被NaOH所吸收。3. IAA和6-BA對氣孔的作用 用的10mmol/L Tris或MES緩沖液配制不同濃度的IAA和6-BA溶液（0、10-4、10-5和10-6mol/L）。關開促進氣孔張開氣孔

4、運動及其影響因素、 鈣參與ABA 調(diào)控氣孔運動的信號轉(zhuǎn)導B1164. ABA和SA等植物激素對氣孔關閉的作用用的10mmol/L Tris或MES緩沖液配制不同濃度的ABA和SA溶液（0、10-4、10-5和10-6mol/L）。5. Ca2+參與ABA調(diào)節(jié)氣孔運動中的信號轉(zhuǎn)導用的10mmol/LTris或MES緩沖液配制不同濃度的ABA溶液（0、10-4、10-5和10-6mol/L）、Ca2+（、1、10mmol/L）溶液、含有2 mmol/L EGTA的ABA系列濃度溶液，含有1 mmol/L LaCl3的ABA系列濃度溶液。處理2-3h，測量隨機取3個視野，每個視野內(nèi)隨機取5（10）個

5、氣孔。根據(jù)測量結果，作出處理濃度和孔徑的關系圖。分析各處理對氣孔開度的影響。開關阻止氣孔張開，誘導氣孔關閉。氣孔運動及其影響因素、 鈣參與ABA 調(diào)控氣孔運動的信號轉(zhuǎn)導B116用反應板反應體系為2000mlBuffer 2000mlABA10-4 mol/L200mlA+1800mlBABA10-5 mol/LABA10-6 mol/LEGTA20mmol/LE+ABA10-4 mol/L200mlE+200mlA+1600mlB母液 ABA10-3 mol/L稀釋到終濃度思考題測量前為何要進行照光或暗處理?ABA為何能影響氣孔開度? 如何進一步證明鈣參與ABA誘導氣孔關閉的過程？附：互動顯微

6、鏡的使用基本步驟 Mie-設置（倍數(shù)、保存路徑等） -預覽（顯示待觀測視野） -測量（直線，每次一選） -讀數(shù)。剝離表皮的方法：水中撕下表皮去葉肉細胞切0.50.3cm置處理液中酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定植物激素含量 抗原抗體反應的高度專一性和敏感性；酶的高效催化特性。原理固相抗原型（間接法）和固相抗體型（直接法）。目的和意義掌握間接法測定植物激素的原理和方法了解逆境對玉米根系ABA和IAA含量的影響間接酶聯(lián)免疫原理示意圖 示反應板（固相載體） 示激素特異抗體（一抗）示激素（抗原）示非特異二抗示蛋白質(zhì)激素復合物示標記酶間接酶聯(lián)免疫原理示意圖 包被 洗板 競爭(-抗)洗板二抗 洗板底物顯色 比

7、色 酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定植物激素含量實驗材料自選材料和玉米幼苗（正常和鹽脅迫，2個處理）實驗步驟樣品中激素的提?。禾崛。海?4 4h）-封口膜（留孔） 吹干: （置于低溫） 樣品測定 包被 3h洗板 -上午11:0014:30（ 37 3h ） 競爭 30min（ 37）洗板 加IgG-HRP(二抗 ） 30min （37）洗板 加底物顯色 15-20min 比色酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定植物激素含量1.樣品中激素的提取計量 稱取1g 左右材料，加2ml 樣品提取液，在冰浴下研磨成勻漿(一定要磨細)，轉(zhuǎn)入5ml試管，再用2ml 提取液分次沖洗研缽并轉(zhuǎn)入試管中，搖勻。 在 4下提取4h

8、，30004000 rpm 離心1520min，取上清液，沉淀中加1ml 提取液，搖勻，置4下再提取1hr,離心，合并上清液。記錄體積，殘渣棄去。 上清液（約2-3ml）放青霉素小瓶中，置于真空干燥器中吹干。 或?qū)⒁欢w積的上清液轉(zhuǎn)入表面皿中，吹干（低溫保存）。 用樣品稀釋液定容(一般1g樣品用1ml樣品稀釋液定容)，搖勻后再用于測定。酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定植物激素含量2. 樣品測定包被 每孔加100ml。然后將酶標板放入內(nèi)鋪濕紗布的帶蓋瓷盤內(nèi)。 37 3h 洗板 放在室溫下平衡。用洗滌液洗4次，第一次迅速倒掉并甩干。競爭 a、配標樣： 稀釋成一系列濃度(2000 ng/ml、1000n

9、g/ml、500ng/ml、250、125、0) 8個。 b、加標樣及樣品：每個濃度加3孔，每孔50ml， 每個樣品重復3孔，每孔50 ml，邊緣孔不加。 C、加抗體：每孔加 50 ml，然后將酶標板放入濕盒內(nèi)開始競爭。 IAA 、ABA， 洗板四人一組2000100050025012562.52000100050025012562.531.250CK根CT根CK葉CT葉31.250CK根CT根CK葉CT葉酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定植物激素含量2. 樣品測定加IgG-HRP(二抗 ）：每孔加100 ml，然后將其放入濕盒內(nèi)， 37下溫育30min。 洗板加底物顯色：每孔加100 ml(在暗處

10、操作)，然后放入濕盒內(nèi)，當顯色適當后，即0 ng/ml 孔OD490nm為，而本底即完全抑制孔不超過，( 兩者之差為1左右 ) 。每孔加入50 ml 23 mol/L硫酸終止反應。 15-20min比色： 用標準曲線最高濃度孔調(diào)0，測定OD490nm 計算軟件酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定植物激素含量注意事項洗板（低上-高下）時間安排樣品吹干真空干燥器-有機溶劑植物的莖尖培養(yǎng)原理 植物細胞具有全能性，即每個植物細胞包含著能產(chǎn)生完整植株的全部遺傳基因。從理論上講，只要條件合適，包含著全部遺傳基因的細胞都能分裂分化，產(chǎn)生完整的植株。 在莖尖和根尖的分生組織中一般是無毒或僅含極低濃度的病毒粒子，而較老

11、的組織中，病毒含量隨離莖尖距離的增加而提高。根據(jù)這一原理采用莖尖組織培養(yǎng)可獲得無毒植株。目的和意義掌握莖尖培養(yǎng)的原理和方法植物的莖尖培養(yǎng)實驗材料：自己感興趣的任何植物材料-幼嫩植株初生芽15-20個 實驗步驟：1. 配置基本培養(yǎng)基 MS；半天（上午）2. 滅菌 （包括無菌水和器皿） 半天（中午）3. 接種（解剖鏡剝離莖尖 接種）（下午）練習使用解剖鏡剝離莖尖 植物的莖尖培養(yǎng)1.配置培養(yǎng)基 大量元素：20倍 微量元素：1000倍 EDTA-Fe：200倍 CaCl2H2O：200倍 KI：1000倍 BA： IAA： NAA：肌醇：50mg/L水解乳清蛋白：300mg/L蔗糖：30g/L瓊脂：8

12、-9g/L需要自己計算稱量的試劑已配母液1、MS（pH）2、3、4、5、6、分組添加植物的莖尖培養(yǎng)1.配置培養(yǎng)基 在制作培養(yǎng)基時，按照以下順序加入各種試劑：先吸取-，再加入蔗糖，溶解后，加母液，混勻后加蒸餾水，用0.5N NaOH調(diào)pH至5.86并用試紙檢驗。加水定容至所計算體積后，調(diào)整pH至。然后將混勻的溶液傾入燒杯中，加入瓊脂8g/L，在微波爐上加熱融化（如果瓊脂質(zhì)量不好，含雜質(zhì)較多時，可事先在水中浸泡，清洗后使用）。待瓊脂徹底融化后，就可以開始分裝。 培養(yǎng)基的分裝：將制作好的培養(yǎng)基分裝到組織培養(yǎng)用的三角瓶中，分裝時，小心地將培養(yǎng)基倒入三角瓶中，以免瓶口沾上培養(yǎng)基容易引起污染。分裝量可根據(jù)

13、三角瓶大小而定，一般使培養(yǎng)基體積占瓶體的1/4到2/5比較合適。裝好后，塞上棉塞，用羊皮紙包嚴，線繩扎緊，準備消毒滅菌。植物的莖尖培養(yǎng)2.滅菌培養(yǎng)基消毒壓力為0.9lkgcm2消毒20min。玻璃器皿及用具、無菌水消毒應適當增加壓力和延長時間，一般為，3050min。在消毒用具前，每人應準備好蒸餾水，用棉塞塞好，紙包嚴，線繩扎緊，同時再準備兩套培養(yǎng)皿、皿底內(nèi)鋪兩張與培養(yǎng)皿大小相應的濾紙，蓋好皿蓋，用羊皮紙分別包好，兩包合起來，再用一塊紗布包好，扎上線繩，一起滅菌。 滅菌121126 滅20min， 放氣，2次 植物的莖尖培養(yǎng)3.接種接種室的消毒：材料表面消毒：植物器官(莖尖)用水沖凈用70的酒

14、精漂洗材料半分鐘放入的升汞中進行表面消毒2-10min用無菌水沖洗材料。莖尖剝離：表面消毒的莖尖和解剖鏡都置于超靜工作臺上。剖取莖件尖時，把莖芽置于解剖鏡下，一手用鑷子將其按住，另一手用解剖針或解剖刀將葉片和葉原基剝掉。解剖針或解剖刀要常常浸入酒精，并用火焰灼燒，冷卻。當形似一個晶亮半圓球形的頂端分生組織充分露出來后，將其切下一般0.11mm（實際操作時可24mm），再用同一工具接到培養(yǎng)基上。接種：每瓶中放置1-3個莖尖放置好材料的培養(yǎng)瓶，立即塞好瓶塞。用一小塊錫鉑紙包好瓶口；并用線繩或橡皮繩纏兩圈結成活頭，便于以后解開。記錄個人信息。植物的莖尖培養(yǎng)1.配置培養(yǎng)基每人做三種配方，相同配方的同學

15、原則上6人一組配置培養(yǎng)基（pH）400ml每人量取60ml MS培養(yǎng)基，3名同學搭配分別要配置的培養(yǎng)基添加不同激素，分裝到3個三角瓶中。32套培養(yǎng)皿（32*3=96）及2L 蒸餾水進行高壓濕熱滅菌。實 驗 流 程母液配制培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基等的滅菌接 種培 養(yǎng)外植體表面消毒412356逆境脅迫（鹽）對玉米幼苗的影響材料-根、葉片處理-1mol/L NaCl （自選逆境）指標： 激素ABA-IAA(選一) 膜-MDA 滲透物質(zhì)脯氨酸 保護酶-活性氧代謝-SOD、POD(選一) 幾種逆境相關生理指標的測定自己查閱文獻，設定脅迫條件（高溫、低溫、鹽害、干旱，等等），或處理材料；自己配制部分藥品。任選選3

16、個指標。SOD活性測定（B112）POD活性測定（B112）丙二醛含量的測定（B112）游離脯氨酸的測定（B116）實驗儀器：紫外可見分光光度計 離心機二、實驗原理 因此光還原反應后，反應液藍色愈深說明酶活性愈低，反之酶活性愈高。本實驗依據(jù)超氧物歧化酶抑制氮藍四唑（NBT）在光下的還原作用來確定酶活性大小。核黃素被氧化物質(zhì)還原的核黃素氧氮藍四唑藍色的化合物（560nm） 2 + 2H+ H2O2 + O2SOD植物組織中超氧物歧化酶活性的測定 實驗步驟試 劑（酶）用量(ml)終濃度（比色時）0.05mol/L磷酸緩沖液130mmol/L Met溶液750mol/L NBT溶液100mol/L

17、EDTA-Na2液20mol/L核黃素酶液蒸餾水30.60.60.60.60.20.413mmol75mol10mol2.0mol對照管加緩沖液代替酶液總體積6.01、酶液提取 2、顯色反應 表1 各溶液加入量，加1ml磷酸緩沖液(pH7.8) 研磨成漿，加緩沖液使終體積為4ml。取23ml于10000rpm下離心10分鐘 3、SOD活性測定以不照光的對照管作空白，在560nm下分別測定其它各管的光密度值，SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活性單位表示。按下式計算SOD活性。 SOD總活性 = 單位：酶單位/g鮮重表示；Ack照光對照管的光密度值；AE樣品管的光密度值；V樣液總

18、體積（ml）；a測定時樣品用量（ml）；W樣重（g）；思考題 1、在SOD測定中為什么設暗中和照光兩個對照管？2、影響本實驗準確性的主要因素是什么？應如何克服？實驗原理：硫代巴比妥酸TBA丙二醛3,5,5-三甲基惡唑2,4-二酮 （三甲川）逆境膜脂的過氧化作用丙二醛酸性粉紅色植物組織或器官中丙二醛含量的測定 實驗步驟：1 MDA的提取 稱2g葉片，加入5ml 磷酸緩沖液（50mmol，pH值為）及少量石英砂，于冰浴中研磨提取，勻漿液以12000g 離心力作用下（4度）離心10min，其上清液即為MDA提取液。 2 MDA的測定 取1ml MDA提取液，加3ml 27三氯乙酸和 1ml 2%TB

19、A?；旌鸵涸?5度水浴中保溫30min后，立即置于冰浴中冷卻，然后離心10min，于波長532nm和600nm下測定OD值。 結果計算以測得的OD532減去OD600的非特異吸收值，按155mmol-1cm-1消光系數(shù)計算MDA含量。 分別計算衰老和對照組的值。 MDA濃度(mol/L)=6.45(D532-D600)-0.56D450 MDA含量(mol/g FW) D450、D532、D600分別代表450nm、532nm和600nm波長下的光密度值。注意事項：的三氯乙酸對MDATBA反應較合適，若高于此濃度，其反應液的非專一性吸收偏高；MDA-TBA顯色反應的加熱時間，最好控制沸水浴10

20、-15min之間。時間太短或太長均會引起532nm下的光吸收值下降； 如待測液渾濁，可適當增加離心力及時間，最好使用低溫離心機離心。低濃度的鐵離子能增強MDA與TBA的顯色反應，當植物組織中鐵離子濃度過低時應補充 Fe3+（最終濃度為0.5 nmolL-1）可溶性糖與TBA顯色反應的產(chǎn)物在532 nm也有吸收（最大吸收在450 nm），當植物處于干旱、高溫、低溫等逆境時可溶性糖含量會增高，必要時要排除可溶性糖的干擾。植物組織中過氧化物酶活性測定原理在過氧化物酶 (peroxidase) 催化下 ,H2O2 將愈創(chuàng)木酚氧化成茶褐色產(chǎn)物。此產(chǎn)物在 470nm 處有最大光吸收, 故可通過測 470n

21、m 下的吸光度變化測定過氧化物酶的活性。方法和步驟1. 酶液的制備取 2g 材料 , 切碎 , 加適量的磷酸緩沖液（）研磨成勻漿。將勻漿液全部轉(zhuǎn)入離心管中 , 于 3000g 離心 l0min, 上清液轉(zhuǎn)入 10ml 容量瓶中。2. 過氧化物酶活性測定-l 磷酸緩沖液 ；1.0m12%H202；-l 愈創(chuàng)木酚和 0.1ml 酶液。用加熱煮沸 5min 的酶液為對照 , 反應體系加入酶液后 , 立即于 37 水浴中保溫15min, 然后迅速轉(zhuǎn)入冰浴中 , 并加入 2.0ml20% 三氯乙酸終止反應 , 然后 , 過濾 ， 適當稀釋 ,470m 波長下測定吸光度。計算以每分鐘內(nèi) A470 變化 0

22、.01 為 1 個過氧化物酶活性單位 (u)。過氧化物酶活性 =(A470 Vt) /（ 0.01WVs t）-1 式中：A470 一 反應時間內(nèi)吸光度的變化 ；w 一 馬鈴薯鮮重 (g)；t 一 反應時間 (min)；Vt 一 提取酶液總體積 (ml)； Vs 一 測定時取用酶液體積 (ml) 。植物體內(nèi)游離脯氨酸含量的測定 原理在酸性條件下，脯氨酸與茚三酮反應生成穩(wěn)定的紅色縮合物，用甲苯萃取后，此縮合物在波長520nm處有一最大吸收峰。脯氨酸濃度的高低在一定范圍內(nèi)與其光密度成正比。1標準曲線制作表 各試管中試劑加入量管 號0123456標準脯氨酸量(ml)00.20.40.81.21.62.0H2O(ml)2.01.81.61.20.80.40冰乙酸(ml)2.02.02.02.02.02.02.0顯色液(ml)3.03.03.03.03.03.03.0脯氨酸含量(g)0248121620以光密度值為縱坐標，脯氨酸含量為橫坐標，繪制標準曲線，求線性回歸方程。步 驟2樣品測定（1）脯氨酸提取 取不同處理的材料，分別置于大試管中，加入5ml 3%磺基水楊酸溶液，管口加蓋玻璃球塞，于沸水浴中浸提10min。（2）取出試管，待冷卻至室溫后，吸取上清液2ml，加2ml冰乙酸和3ml顯色液，于沸水浴中加熱4