植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建與操作技術(shù)ppt課件

1、主要內(nèi)容 組織培育實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備及運(yùn)用方法 無菌操作技術(shù) 培育基的制備方法和步驟 外植體的滅菌方法 褐變和玻璃化緣由及應(yīng)對措施 2 植物細(xì)胞組織培育的根本技術(shù)第一節(jié)植物組織培育實(shí)驗(yàn)室及主要設(shè)備實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)原那么：保證無菌操作，到達(dá)任務(wù)方便，防止污染。實(shí)驗(yàn)室的大小應(yīng)取決于任務(wù)的目的和規(guī)模按組織培育流程來設(shè)計(jì)，防止某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后任務(wù)混亂利用一定的設(shè)備、器材和特殊的實(shí)驗(yàn)室構(gòu)造設(shè)計(jì)，到達(dá)嚴(yán)厲無菌的條件一、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)與設(shè)備根本設(shè)備1.預(yù)備室：根據(jù)實(shí)驗(yàn)操作的性質(zhì)，進(jìn)展適當(dāng)?shù)姆謪^(qū) 清洗區(qū) 培育基配制區(qū) 試劑存放區(qū) 滅菌區(qū)預(yù)備室主要儀器設(shè)備：任務(wù)臺藥品柜冰箱 普通冰箱、低溫冰箱等。主要用于儲存母液、各種易

2、蛻變、易分解的化學(xué)藥品以及植物資料等。天平 感量0.001g的分析天平、感量0.0001g的電子天平用于稱量微量元素和一些較高準(zhǔn)確度的實(shí)驗(yàn)用品、感量為0.1g的托盤天平用于稱取用量較大的糖和瓊脂等 放置在程度、枯燥、不受震動的操作臺上(5)恒溫水浴鍋(6)蒸餾水發(fā)生器 蒸餾水用于配制母液或培育基普通實(shí)驗(yàn)可以用自來水替代蒸餾水(7)電爐(8)高壓滅菌鍋 進(jìn)展培育基、水和器械器具的滅菌(9)酸度計(jì) 測定培育基及酶制劑的pH值普通實(shí)驗(yàn)可運(yùn)用pH試紙(10)烘箱 枯燥洗凈的玻璃器皿，也可用于干熱滅菌 和測定干物重(11)搖床 振蕩培育(12)離心機(jī) 分別培育基中的細(xì)胞以及解離細(xì)胞壁后的原生質(zhì)體PHS-

3、802中文臺式酸度計(jì)通用型或經(jīng)濟(jì)型酸度計(jì)全溫型恒溫培育搖床多振幅高速軌道搖床不銹鋼蒸餾水器單蒸水、緩沖室留意門的朝向任務(wù)人員在此換上任務(wù)服、拖鞋，戴上口罩功能 減少人體從外界帶入的塵埃等污染物。 要求 緩沖間需3-5平方米，應(yīng)堅(jiān)持清潔無菌； 有清潔的實(shí)驗(yàn)用拖鞋、已滅菌過的任務(wù)服； 1-2盞紫外燈定時照射，對衣物及空間進(jìn)展滅菌。根本設(shè)備3.無菌操作室區(qū) 主要用于植物資料的消毒、接種等 是植物組織培育研討中最關(guān)鍵的部分分區(qū)： 預(yù)備室 接種室：定期消毒，甲醛和高錳酸鉀蒸汽 熏蒸目前，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用超凈任務(wù)臺替代根本設(shè)備3.培育室根本設(shè)備4.器具培育瓶廣口瓶三角瓶量筒燒杯容量瓶移液管培育皿試管鑷子解

4、剖針接種針剪刀器具的洗滌：1.玻璃器皿的消毒 1新購置，用1%稀HCL浸泡一夜，肥皂水洗凈，清水沖洗，蒸餾水沖洗一遍 2用過，清水沖洗，蒸餾水沖洗一遍，干后備用 3已污染，高壓蒸汽滅菌30min2.金屬器皿的消毒 擦凈油膩，熱肥皂水洗凈，清水沖洗，擦干備用器具的滅菌 高溫滅菌：干熱滅菌 高壓蒸汽滅菌、培育室功能 接種的資料進(jìn)展培育生長的場所其設(shè)計(jì)以充分利用空間和節(jié)省能源為原那么。要求：能控制光照和溫度堅(jiān)持相對的無菌環(huán)境有排風(fēng)窗和換氣扇等培育室的換氣安裝有適宜的培育架，日光燈照明。 主要設(shè)備 培育架、培育箱、空調(diào)機(jī)、除濕機(jī)、換氣扇、臭氧發(fā)生器等。小型臭氧發(fā)生器二、培育器皿及器具1、培育器皿包括玻

5、璃器皿和塑料器皿 各種規(guī)格的培育皿、三角瓶、試管、培育瓶。2、微孔過濾器細(xì)菌過濾器 0.45微米，抽濾滅菌用，如激素3、器械器具 鑷子、剪刀、解剖刀、接種針鏟等。第二節(jié)培育基及其配制定義： 培育基(culture medium)根據(jù)植物生長所需營養(yǎng)成分，配制成的供植物生長的人工制造的營養(yǎng)物質(zhì)。是植物組織培育的重要基質(zhì)。不同植物的組織對營養(yǎng)有不同的要求，甚至同一種植物不同部位的組織對營養(yǎng)的要求也不一樣沒有一種培育基可以適宜一切類型的植物組織或器官找到一適宜的培育基，是培育勝利的根底。一培育基成分主要為： 水無機(jī)鹽有機(jī)化合物生長調(diào)理物質(zhì)水水是植物體的重要組成成分，是一切代謝過程的介質(zhì)和溶媒，是生命

6、活動過程中不可短少的物質(zhì)。培育基大部分是水固體培育基 約7580%天然水或自來水不能直接用于培育基配制原生質(zhì)體培育、細(xì)胞培育及分生組織培育普通運(yùn)用雙蒸水或超純水。大批量快速繁衍培育，可用單蒸水或純真水。 堅(jiān)持母液及培育基成分的準(zhǔn)確性防止貯藏過程發(fā)霉蛻變無機(jī)鹽類(inorganic element離體組織生長發(fā)育的根本成分，根據(jù)植物對必需元素需求的量，可以分為：大量元素微量元素大量元素指植物所需元素的濃度大于0.5mmolL的元素，有C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。除C、H、O外，其它礦質(zhì)元素通常以一定濃度的無機(jī)化合物方式，按一定比例配制而成，溶于水中以離子態(tài)被吸收N有硝態(tài)氮KNO3和銨

7、態(tài)氮(NH4)2SO4兩種方式普通NH4N對植物生長較為有利。 微量元素濃度小于0.5mmolL的元素，有 Fe、Cu、Zn等。 鐵鹽在合成葉綠素中起重要作用，缺鐵影響到胚的發(fā)育，妨礙子葉變綠。3.有機(jī)化合物(organic compound) 根本培育基只含有大量和微量元素 為使培育物的生長更好，還需添加各種有機(jī)成分：糖類、維生素、醇類、嘌呤、氨基酸等糖類碳水化合物 碳源，維持培育基的浸透壓在1.5-4.1MPa。多運(yùn)用蔗糖。 不同濃度會影響細(xì)胞的增殖分化，試管苗生長與繁衍濃度2-3%，幼胚培育4-6%，某些特殊培育中用8-10%。 細(xì)胞和原生質(zhì)體培育還用麥芽糖、葡萄糖、果糖維生素明顯的促進(jìn)

8、離體培育物的生長。 鹽酸硫胺素-VB1、鹽酸吡哆醇-VB6、煙酸、生物素、抗壞血酸-Vc等。 普通用量為0.11.0mgL。肌醇環(huán)己六醇促進(jìn)胚狀體和芽的構(gòu)成。用量普通50-100mg/L。氨基酸常用甘氨酸和多種氨基酸混合物水解酪蛋白、水解乳蛋白 用量在10-1000mgL之間。 營養(yǎng)豐富，極易引起污染，如在培育中無特別需求，以不用為宜。 天然復(fù)合物包括部分蛋白質(zhì)水解物其成分比較復(fù)雜，大多含氨基酸、激素、酶等一些復(fù)雜化合物。 對細(xì)胞和組織的增殖與分化有明顯的促進(jìn)作用，但對器官的分化作用不明顯。 成分大多不清楚，普通盡量防止運(yùn)用。、生長調(diào)理物質(zhì)植物激素 植物激素hormone是植物新陳代謝中產(chǎn)生的

9、天然化合物，能以極微小的量影響到植物的細(xì)胞分化、分裂、發(fā)育，影響到植物的形狀建成、開花、結(jié)實(shí)、成熟、零落、衰老和休眠以及萌生等多種生理生化活動，是培育基的關(guān)鍵物質(zhì)。 主要包括：生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素生長素0.05-5mgL細(xì)胞分裂素0.0510mgL。生長素類(auxin) 生長素主要被用于誘導(dǎo)愈傷組織構(gòu)成，促進(jìn)細(xì)胞脫分化，誘導(dǎo)根的分化和促進(jìn)細(xì)胞伸長生長。天然的生長素?zé)岱€(wěn)定性差，高溫高壓或受光條件易被破壞。在植物體內(nèi)也易遭到體內(nèi)酶的分解。組織培育中常用人工合成的生長素類物質(zhì)常用IAA、IBA、NAA、2,4-D配成1mg/ml的溶液貯于冰箱中IAA-天然生長素，亦可人工合成，其活力較低，是

10、生長素中活力最弱的激素，對器官構(gòu)成的副作用小，高溫高壓易被破壞，受光也易分解NAA-啟動才干比IAA高出3-4倍，可大批量人工合成，耐高溫高壓，不易被分解破壞，運(yùn)用較普遍IBA-促進(jìn)發(fā)根才干較強(qiáng) NAA和IBA廣泛用于生根，并與細(xì)胞分裂素互作促進(jìn)芽的增殖和生長。2，4D -啟動才干比IAA高10倍，特別是促進(jìn)愈傷組織的構(gòu)成，同時劇烈抑制芽的構(gòu)成，影響器官的發(fā)育。適宜的用量范圍較狹窄，過量常有毒效應(yīng)腺嘌吟的衍生物，包括6-BA、Kt、Zt 等。其中Zt活性最強(qiáng)，但非常昂貴，常用的是6-BA。作用：誘導(dǎo)芽的分化促進(jìn)側(cè)芽萌生生長促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)展莖增粗，抑制根的分化，延緩衰老多用于誘導(dǎo)不定芽的分化、

11、芽的增殖。 細(xì)胞分裂素類(cytokinin，CTK)赤霉素gibberellic acid有20多種，培育基中添加的是GA3，普通極少運(yùn)用作用促進(jìn)幼苗莖的伸長生長促進(jìn)胚發(fā)育成小植株；離體培育下，還與生長素協(xié)調(diào)作用對構(gòu)成層分化有影響當(dāng)生長素赤霉素比值高，木質(zhì)部分化，比值低，韌皮部分化。突破休眠，促進(jìn)種子、塊莖、鱗莖等提早萌生。在器官構(gòu)成后，添加赤霉素有時可促進(jìn)器官或胚狀體的生長激素配比方式 生長素/細(xì)胞分裂素的比值決議分化發(fā)育的方向，是愈傷組織、長根還是長芽。生長素/細(xì)胞分裂素高 利于根、愈傷組織的構(gòu)成適中 利于根芽的分化低 有利于芽的構(gòu)成 生長素與細(xì)胞分裂素同時運(yùn)用有協(xié)調(diào)作用。同時其在培育基

12、中的絕對值也會影響外植體分化發(fā)育的方向。Growth medium is optimised for regeneration of plantletsNo sucrose (0%)Sucrose reduced to 1%Sucrose increased to 5%The explant is completely covered with green shoots, and roots are developing on the lower surface Very few shoots have developed on the explant. No roots and no cal

13、lus.Shoots developed on edges of upper surface, and some root development has occuredShoots have developed over the surface of the explant, along with roots from the lower surface. The result is comparable with the control mediumtissue culture in the African Violet No 6-BA6-BA reduced to 0.1 mg. l-1

14、 No NAAPoor shoot development and no roots. Extensive callus generationPoor shoot development and no rootsNAA reduced to 0.1 mg. l-1 More balanced development of roots and shoots. However, undifferentiated callus is developing at the edges of the explantProfuse development of roots and a reduced num

15、ber of shoots. Undifferentiated callus is developing at the edges of the explantNAA increased to 5.0 mg. l-1Profuse development of roots over the explant upper and lower surface, and few shoots. Some callusNo MS saltsNo sign of regeneration from explant at all.MS salts reduced to 0.47 g. l-1 Some ro

16、ot growth but reduced development of shootsMS salts increased to 9.52 g. l-1 Shoots developed on upper surface of explant. No roots or callus.其它附加成分瓊脂(agar) 是一種由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何營養(yǎng)。組織培育中最常用作凝固劑，是最方便、最好的凝固劑和支持物，常用量6-10gL ，不是培育基必需成分?；钚蕴?active carbon) 常用的吸附劑，某些培育類型中，可以吸附培育過程中產(chǎn)生的一些有毒物質(zhì)，有利于培育物的生長。

17、常用濃度0.5%左右，其吸附作用選擇性較差，常受溫度影響，低溫吸附效果好，高溫吸附才干降低甚至解吸附。 二、常用培育基的種類、配方及特點(diǎn)、培育基種類根據(jù)作用分：誘導(dǎo)培育基：誘導(dǎo)外植體啟動生長。增殖培育基：誘導(dǎo)離體培育苗擴(kuò)展繁衍。生根培育基：誘導(dǎo)離體培育苗生根。根據(jù)營養(yǎng)程度分：根本培育基：包含無機(jī)鹽等根本營養(yǎng)成分。完全培育基：包含使植物離體生長全面營養(yǎng)。培育基的種類1681，出現(xiàn)由無機(jī)鹽組成的Sacks和Knop溶液，至今仍在作為根本的無機(jī)鹽培育基40年代多用White培育基60年代至今大多采用MS等高濃度培育基可以保證培育資料對營養(yǎng)的需求，由于濃度高，在配制、消毒過程中某些成分有些出入，也不致

18、影響培育基的離子平衡 培育基的稱號，多以發(fā)明人的名字來命名，也有對某些成分進(jìn)展改良稱作改良培育基。 MS培育基 無機(jī)鹽和離子濃度較高，硝酸鹽含量較其他培育基為高。 B5培育基 含有較低的銨，雙子葉植物特別是木本植物許多都適于用B5。White培育基 1963年又作了改良，稱作White改良培育基。無機(jī)機(jī)鹽數(shù)量較低，適于生根培育。N6培育基 成分較簡單，KNO3和NH42SO4含量高。廣泛運(yùn)用于小麥、水稻及其他植物的花藥培育和其他組織培育。KM8P培育基 有機(jī)成分較復(fù)雜，它包括了一切的單糖和維生素，廣泛用于原生質(zhì)交融的培育。 三、培育基的配制、母液的配制和保管 母液是欲配制液的濃縮液保證各物質(zhì)成

19、分的準(zhǔn)確性，減少微量元素用藥稱量誤差配制時能快速移取，減少稱藥費(fèi)事便于低溫保藏。普通母液配成比所需濃度高10-100倍。本卷須知濃度高耐儲存，但準(zhǔn)確度低；濃度過低不耐貯防止不恰當(dāng)混合引起沉淀母液保管在5冰箱中，出現(xiàn)沉淀、霉變的不能運(yùn)用母液濃縮倍數(shù)=稱取藥物的量1000ml/每升培育基需藥物量母液體積大量元素可以混在一同配制成10100倍液常用50倍高濃度的Ca2+和Mg2+會與磷酸鹽混合，產(chǎn)生不溶性沉淀，應(yīng)單獨(dú)配制/或者單獨(dú)配制CaCl2 也可微量元素可配成50-1000倍常用100、200倍混合母液，KI可單獨(dú)配。鐵鹽硫酸亞鐵和EDTA鈉鹽易沉淀，需單獨(dú)配制，配成100200倍鰲合劑不易沉淀

20、。有機(jī)化合物維生素、肌醇、氨基酸等一同配成100或200倍液，也可分別配制。激素 每種單獨(dú)配成母液儲于冰箱，濃度普通為0.51mg/ml。普通一次只配50ml或100ml。 激素難溶于水，配制母液時用95%酒精或 1NHCl，1NNaOH溶解后再定容。 生長素類用NaOH、細(xì)胞分裂素用HCl溶解6有機(jī)附加物椰乳 液體胚乳紗布濾渣-80水浴濾液20分鐘-過濾去蛋白-高溫高壓滅菌-冰箱保管酵母提取液 酵母粉加水煮沸30分鐘-過濾去渣-消毒、培育基的配制及滅菌培育基配制程序：取適量蒸餾水放入容器將母液取出混合將瓊脂和糖參與容器蒸餾水定容至所需體積調(diào)整p分裝培育瓶培育基的滅菌：濕熱滅菌法，滅菌1520

21、min某些遇熱不穩(wěn)定的物質(zhì)如IAA、ZT等進(jìn)展過抽濾滅菌第三節(jié)外植體的選擇與培育 植物細(xì)胞組織培育的成敗除與培育基的組分有關(guān)外，另一個重要要素就是外植體本身，為了使外植體適于在離體培育條件下生長，使組織培育任務(wù)順利進(jìn)展，有必要對外植體進(jìn)展選擇與處置。一、外植體的選擇有代表性的主要植物優(yōu)良的種質(zhì)、特殊的基因型在植株生長的最適時期取材花藥培育在單核期取材大小普通在0.5-1.0cm之間胚胎培育或脫毒在0.5cm以下，資料太大易污染，資料太小難于成活。從生長強(qiáng)壯的無病蟲害的植株上選取發(fā)育正常的器官和組織。最好采用莖尖，后代性狀較穩(wěn)定，攜帶細(xì)菌較少。 二、外植體的滅菌外植體選取 流水沖洗 轉(zhuǎn)入超凈任務(wù)

22、臺70%酒精外表消毒2060s 無菌水沖洗 消毒劑處置 無菌水充分洗凈備用三、外植體的接種無菌操作外植體的接種是把經(jīng)過外表滅菌后的植物資料切碎或分別出器官、組織、細(xì)胞、轉(zhuǎn)放到無菌培育基上的全部操作過程。整個過程均需無菌操作。1借助接種用工具將資料切割分別。2將培育基放入超凈任務(wù)臺內(nèi)，火焰灼燒培育基瓶口，然后翻開培育瓶口，置培育瓶為斜角，防止灰塵雜菌落入瓶中。3迅速將切割分別下的所需組織、細(xì)胞、器官，放入培育基上，及時蓋上瓶蓋。4工具用后應(yīng)及時滅菌，防止交叉污染。5任務(wù)人員操作時制止不用要的說話。四、外植體的培育主要要素：光照、溫度、濕度、氧氣、光照光照強(qiáng)度、光質(zhì)以及光照時間，對細(xì)胞的增殖、器官

23、的分化都有很大影響。除特殊要求外，普通都采用日光燈作光源，根據(jù)不同植物或器官需求，可以每天延續(xù)光照12-16小時，也可每天光照16小時，8小時黑暗。、溫度大所數(shù)植物最適溫度在23-32之間。培育室溫度是252。、濕度培育瓶內(nèi)相對濕度常是100%，培育室普通要求相對濕度堅(jiān)持在70-80%，相對濕度過低影響培育物生長和分化，應(yīng)向室內(nèi)噴灑水，以提高濕度；過高雜菌繁殖，大量污染，應(yīng)及時地通風(fēng)除濕。、氧氣接種時要有部分組織和空氣接觸。振蕩培育是處理通氣的良好方法。固體培育中，如瓶塞不透氣，培育物也不能生長，要選擇通氣性好的培育瓶蓋，添加可利用的氧氣，迅速除去釋放出來的CO2，有利于外植體外層細(xì)胞開場分裂

24、。、 pH值不同的植物對培育基最適pH值的要求也是不同的，大多在56.5左右，普通培育基皆要求5.8，這根天性順應(yīng)大多植物培育的需求。五、外植體的成苗途徑外植體的成苗途徑有三種：一外植體-愈傷組織-完好植株同時長芽和根-植株芽-根-植株根-芽-植株二外植體-胚狀體-植株器官上愈傷組織游離單細(xì)胞小孢子 誘導(dǎo)胚狀體比誘導(dǎo)芽數(shù)量多、速度快、構(gòu)造完好三外植體-直接構(gòu)成根與芽-植株六、培育中常見問題一污染 病原菌 ：細(xì)菌、真菌細(xì)菌污染：菌斑呈黏液狀，接種后1-2天發(fā)現(xiàn)。污染途徑：外植體帶菌；培育基及器皿滅菌不徹底操作人員未遵守操作規(guī)程 真菌污染：污染部分長有不同顏色的霉菌，接種后3-10天發(fā)現(xiàn)。污染途徑

25、：周圍環(huán)境不清潔；超凈任務(wù)臺過濾安裝失效；培育瓶的口徑過大在組織培育過程中培育基和培育資料繁殖雜菌，導(dǎo)致培育失敗的景象2、污染的預(yù)防措施6點(diǎn)防止資料帶菌的措施莖尖作外植體時，進(jìn)展預(yù)培育無糖或暗培育，以新抽嫩枝作外植體。晴天取材，下午取材，經(jīng)日曬可殺死部分細(xì)菌或真菌接種時除去外部韌皮組織，只接內(nèi)部的分生組織。2外植體的滅菌 多次滅菌法：次氯酸鈉-無菌水-次氯酸鈉多藥劑交替法：肥皂水-酒精-次氯酸鈉-無菌水器皿與金屬器械的滅菌玻璃器皿可采用濕熱滅菌或干熱滅菌金屬器皿普通火焰滅菌，也可干熱滅菌-140攝氏度滅菌3-5h；160-170攝氏度滅菌2-4h；180-200攝氏度滅菌0.5-1h布質(zhì)制品的

26、滅菌 濕熱滅菌無菌操作室的滅菌 2%新潔爾滅或70%酒精擦拭噴霧，紫外燈照射，定期甲醛和高錳酸鉀熏蒸。嚴(yán)厲按照無菌操作程序進(jìn)展在枯燥環(huán)境如火焰或干熱空氣進(jìn)展滅菌的技術(shù)二褐變基因型外植體的生理形狀幼年的資料、分生組織含醌類物質(zhì)較少培育基的成分無機(jī)鹽濃度過高生長調(diào)理物質(zhì)運(yùn)用不當(dāng)，BA過多培育條件不適宜，溫度過高或光照過強(qiáng)資料轉(zhuǎn)移時間時間過長引起資料褐變外植體體內(nèi)的多酚氧化酶被激活，使細(xì)胞內(nèi)的酚類物質(zhì)氧化成棕褐色的醌類物質(zhì)，這種致死的褐變物向外分散致使培育基逐漸變成褐色，抑制其它酶的活性，影響外植體的分化，最后變褐死亡的景象。1、影響要素選擇適宜的外植體及最正確培育基提高轉(zhuǎn)管率加抗氧化劑抗壞血酸、P

27、VP、牛血潔白蛋白等加活性炭 0.1-0.5%活性炭 2、褐變的防止措施三玻璃化Vitrification組培苗外觀形狀呈 半透明狀的生長異常景象葉、嫩梢呈水晶透明或半透明水浸狀；矮小腫脹失綠；葉片伸展卷曲、脆弱易碎葉表幾無角質(zhì)層蠟質(zhì)，沒有功能性氣孔，不具有柵欄組織，僅有海綿組織體內(nèi)含水量高，干物質(zhì)低，光合才干和酶活性降低，組織畸形，器官功能不全，分化才干降低生根困難，很難繼續(xù)培育和移栽成活激素：CTK濃度、比例過高繼代次數(shù)太多瓊脂：瓊脂濃度低培育基太“稀溫度：光照時間：光照太多、太強(qiáng)通風(fēng)條件：氣體交換不良(6)離子程度：無機(jī)離子種類及比例不當(dāng) N主要緣由提高蔗糖和瓊脂濃度提高浸透勢適當(dāng)降低細(xì)