第二章-蛋白質(zhì)化學(xué)

1、第五節(jié) 蛋白質(zhì)的重要(zhngyo)性質(zhì)一、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) 真溶液的溶質(zhì)分子的顆粒大小(dxio)1nm； 膠體溶液中溶質(zhì)分子的顆粒大小在1-100nm； 蛋白質(zhì)分子的相對(duì)分子量在1-100萬(wàn)，其顆粒大小(2-20nm)屬于膠體粒子的范圍。 另外，蛋白質(zhì)分子表面有許多極性基團(tuán)，親水性極強(qiáng)，易溶與水形成穩(wěn)定的親水膠體溶液。共五十五頁(yè)1、穩(wěn)定蛋白質(zhì)膠體溶液的兩個(gè)因素 (1) 表面電荷(dinh)(在非等電點(diǎn)時(shí))與雙電層； (2) 水化膜蛋白質(zhì)膠體溶液具有一般膠體溶液的性質(zhì)丁道爾現(xiàn)象、布朗運(yùn)動(dòng)、半透膜不透性、吸附性、膠凝性、粘性。共五十五頁(yè)2、蛋白質(zhì)的膜分離技術(shù)（Membrane Separati

2、on Technique ） 利用蛋白質(zhì)的半透膜不透性，將蛋白質(zhì)中所含的、可以(ky)通過半透膜將低分子物質(zhì)(如鹽等小分子)分離的技術(shù)稱為膜分離技術(shù)(或膜過濾技術(shù))。 膜分離技術(shù)可分為透析（dialysis ） 超濾（ultrafiltration ）共五十五頁(yè)共五十五頁(yè)共五十五頁(yè)超濾膜孔徑(kngjng)與截留蛋白質(zhì)分子量的對(duì)應(yīng)關(guān)系膜孔平均直徑（108cm） 分子量截留值 膜孔平均直徑（108cm） 分子量截留值10 500 22 310412 1000 30 510415 1104 55 1010418 2104 140 30104共五十五頁(yè) 二、蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點(diǎn)蛋白質(zhì)中可解離的酸

3、性(sun xn)基團(tuán)Glu的-COOHAsp的-COOHTyr的酚羥基Cys的-SH 堿性基團(tuán)Lys的-NH2His的咪唑基Arg的-胍基共五十五頁(yè)蛋白質(zhì)分子(fnz)的總解離可用下式表示 NH+3-P-COOH (P+) NH+3-P-COO- (P+-) NH2-P-COO- (P-) 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)蛋白質(zhì)溶液在特定的pH下，其分子所帶的正、負(fù)電荷相等，凈電荷為零，這一pH稱為 (用pI表示)。 共五十五頁(yè)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不是一個(gè)恒定值，它受溶液的離子種類和離子強(qiáng)度的影響(yngxing)。蛋白質(zhì)在純水中的帶電狀態(tài)不受其它離子的干擾，完全由H+的解離和結(jié)合來決定，這種條件下的等電點(diǎn)稱為蛋白

4、質(zhì)的等離子點(diǎn)(isoionic point) 。 蛋白質(zhì)的等離子點(diǎn)是特性常數(shù)。共五十五頁(yè) 蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的大小與其氨基酸組成有關(guān)。 對(duì)于變性的蛋白質(zhì)，可由其酸性氨基酸與堿性氨基酸的比例來判斷。 對(duì)于天然蛋白質(zhì)，由于其R基團(tuán)不能完全(wnqun)暴露在外，故不易判斷。共五十五頁(yè)幾種(j zhn)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)蛋白質(zhì) 等電點(diǎn) 蛋白質(zhì) 等電點(diǎn)胃蛋白酶 1.0 卵清蛋白 4.6血清蛋白 4.7 -乳球蛋白 5.2胰島素 5.3 血紅蛋白 6.7-胰凝乳蛋白酶 8.3 核糖核酸酶 9.5細(xì)胞色素C 10.7 溶菌酶 11.0共五十五頁(yè)在等電狀態(tài)下，蛋白質(zhì)分子物理性質(zhì)有所改變(gibin)，最顯著的是溶解度

5、最小。 （a）高pH：蛋白質(zhì)溶解(rngji)（去質(zhì)子化）；（b）等電點(diǎn)：蛋白質(zhì)絮凝 （靜電排斥最?。┕参迨屙?yè)（c）低pH：蛋白質(zhì)溶解(rngji)（質(zhì)子化）；（d）-乳清蛋白的溶解度與pH的關(guān)系共五十五頁(yè) 根據(jù)蛋白質(zhì)兩性解離和等電點(diǎn)的性質(zhì)發(fā)展起來的蛋白質(zhì)純化方法有蛋白質(zhì)電泳(din yn)離子交換法等電點(diǎn)沉淀法共五十五頁(yè)三、蛋白質(zhì)的變性作用（ protein denaturation ）1、概念天然的蛋白質(zhì)在受到某些物理或化學(xué)因素的作用，有序的空間結(jié)構(gòu)被破壞，致使生物活性喪失，并伴隨發(fā)生一些理化性質(zhì)的異常變化，但一級(jí)結(jié)構(gòu)(jigu)并未破壞，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性作用。共五十五頁(yè)2、蛋白

6、質(zhì)變性的可逆性可逆變性是指使蛋白質(zhì)變性的條件解除 后，能恢復(fù)(huf)其原有性質(zhì)。不可逆變性是指使蛋白質(zhì)變性的條件解除 后，仍不能恢復(fù)其原有性質(zhì)。共五十五頁(yè)蛋白質(zhì)復(fù)性(f xn)（renaturation）去除變性因素后，可逆變性的蛋白恢復(fù)原來的空間結(jié)構(gòu)，恢復(fù)生物(shngw)活性的現(xiàn)象為復(fù)性共五十五頁(yè)3、蛋白質(zhì)的變性因素及其作用機(jī)理物理因素?zé)?、UV、超聲波、X-射線、高壓、表面張力、攪拌、劇烈振蕩、研磨。例如 皮膚(p f)粗糙、白內(nèi)障、殺菌化學(xué)因素酸、堿、有機(jī)溶劑、重金屬鹽、脲、胍、表面活性劑、生物堿 。作用機(jī)理 重金屬與-SH生成不溶性的硫化物濃乙醇、去污劑破壞疏水作用力共五十五頁(yè) 4、

7、變性蛋白質(zhì)的性質(zhì)變性蛋白質(zhì)與天然蛋白質(zhì)性質(zhì)的差別主要表現(xiàn)(1)理化性質(zhì)的變化如：旋光性改變、粘度增加、光吸收性質(zhì)增加、失去結(jié)晶能力、溶解度下降、易發(fā)生凝聚和沉淀。(2) 生化(shn hu)性質(zhì)的變化變性后的蛋白質(zhì)易被酶水解。(3) 生物活性喪失這是蛋白質(zhì)變性的重要標(biāo)志。共五十五頁(yè) 四、蛋白質(zhì)的變構(gòu)作用 （protein allosteric effect )對(duì)于具有四級(jí)結(jié)構(gòu)、含有亞基的蛋白質(zhì)來講，當(dāng)一個(gè)亞基的構(gòu)象發(fā)生變化，而引起其余亞基和整個(gè)蛋白質(zhì)分子(fnz)構(gòu)象、性質(zhì)和功能發(fā)生改變的作用稱為蛋白質(zhì)的變構(gòu)作用(或稱別構(gòu)作用）。 如血紅蛋白的變構(gòu)作用共五十五頁(yè)五、蛋白質(zhì)的沉淀作用（preci

8、pitation） 1、概念蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性是有條件的、相對(duì)的，若改變環(huán)境條件，破壞其水化膜和表面(biomin)電荷，蛋白質(zhì)親水膠體便失去穩(wěn)定性，發(fā)生絮凝沉淀的現(xiàn)象，就稱為蛋白質(zhì)的沉淀作用。共五十五頁(yè)蛋白質(zhì)的沉淀可分為 不變性沉淀用于分離活性的天然(tinrn)蛋白質(zhì)產(chǎn)品。如： 酶、抗體等。 變性沉淀用于生物制品中除去蛋白質(zhì)。共五十五頁(yè)2、沉淀的方法(1) 等電點(diǎn)沉淀蛋白質(zhì)分子在其等電點(diǎn)時(shí)，容易相互吸引，聚合成沉淀(2) 中性鹽沉淀鹽析(yn x)（salting out) 在蛋白質(zhì)溶液中加入高濃度的中性鹽后，它與蛋白質(zhì)膠體粒子競(jìng)爭(zhēng)水份，使蛋白質(zhì)膠體粒子表面的水化層破壞而失去穩(wěn)定性，同

9、時(shí)降低了蛋白質(zhì)與水的親和力而使蛋白質(zhì)沉淀的現(xiàn)象。鹽溶（salting in)在鹽濃度很低時(shí)，大多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨著鹽濃度的增加而增加，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的鹽溶。 共五十五頁(yè)低濃度的鹽可增加(zngji)蛋白質(zhì)表面的電荷數(shù)量和與水分子的相互作用。共五十五頁(yè)鹽析(yn x)鹽濃度高時(shí)，中和了蛋白質(zhì)分子表面的電荷、破壞(phui)了水化層，使疏水區(qū)域暴露，疏水基團(tuán)發(fā)生相互作用而沉淀。共五十五頁(yè)不同的蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、分子量不同，水膜厚度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不同。分級(jí)鹽析一般來講，分子量越大的蛋白質(zhì)分子，越容易鹽析，所需鹽濃度也越低。因此，對(duì)于不同分子大小(dxio)的蛋白質(zhì)，可采用不同的鹽濃

10、度進(jìn)分級(jí)沉淀。常用的鹽是(NH4)2SO4共五十五頁(yè)(3) 有機(jī)溶劑沉淀(chndin)一些極性的有機(jī)溶劑(如乙醇、丙酮等)能破壞蛋白質(zhì)膠粒的水化層，使疏水基團(tuán)暴露使蛋白質(zhì)沉淀。(4) 重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì)在堿性溶液中帶負(fù)電，可與重金屬離子如Zn+2、Cu+2、Hg+2、Pb+2、Fe+3等作用，產(chǎn)生重金屬蛋白鹽沉淀。(5) 熱變性沉淀共五十五頁(yè)(6) 生物堿試劑(shj)沉淀生物堿試劑（如單寧酸、鉬酸、鎢酸、三氯醋酸等）具有酸性，而蛋白質(zhì)在酸性溶液中帶正電荷，故能與帶負(fù)電的酸根相結(jié)合，成為溶解度很小的鹽類。共五十五頁(yè)六、蛋白質(zhì)的沉降(chnjing)作用（sedimentation) 1、概念

11、蛋白質(zhì)由于其比重大于水，而水中下沉，這就是蛋白質(zhì)的沉降作用。 蛋白質(zhì)膠體粒子在靜止溶液中，因重力F=mg 很小，沉降1cm需幾年的時(shí)間。為了便于觀察和利用這一現(xiàn)象，通常外加一定的力（如離心力），來加速沉降過程。 蛋白質(zhì)的沉降速度與分子大小和密度有關(guān)。 蛋白質(zhì)的沉降性能通常用單位離心力場(chǎng)中的沉降速度沉降系數(shù)來表示 （沉降系數(shù)的測(cè)定詳見后面的蛋白質(zhì)分子量測(cè)定）共五十五頁(yè)七、蛋白質(zhì)的水解反應(yīng)可分為 完全(wnqun)水解，產(chǎn)物是氨基酸。 不完全水解，產(chǎn)物可以是胨、小肽、 二肽和氨基酸。共五十五頁(yè)八、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)（1）一般顏色反應(yīng)：氨基酸所具有的顏色反應(yīng)一般情況下蛋白質(zhì)都有。一些氨基酸地R基團(tuán)具有

12、特殊地顏色反應(yīng)：米倫反應(yīng) 紅色 酚基黃色(hungs)反應(yīng) 黃色 苯基酚試劑反應(yīng) 藍(lán)色 酚基、吲哚基坂口反應(yīng) 紅色 胍基共五十五頁(yè)（2）特殊顏色反應(yīng)雙縮脲反應(yīng)兩個(gè)以上肽鍵（雙縮脲）在堿性溶液中與硫酸銅結(jié)合。生成紫紅色(hngs)或紅色(hngs)物質(zhì)。共五十五頁(yè)九、蛋白質(zhì)的紫外吸收(xshu)性質(zhì)一般蛋白質(zhì)在280nm波長(zhǎng)具有最大吸收，這是由于蛋白質(zhì)分子中的Trp、Tyr和Phe存在共軛雙鍵的緣故。共五十五頁(yè)十、蛋白質(zhì)的免疫學(xué)性質(zhì) 抗原Ag：刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異(ty)免疫反應(yīng)的物質(zhì)，特點(diǎn)是異物性、大分子性和特異性抗體。Ab：抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生能與抗原特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，存在于電泳-區(qū)（ -、

13、免疫球蛋白Ig）,抗體的特異性決定于抗原的表面基團(tuán)，免疫產(chǎn)生抗體多種，多克隆抗體免疫反應(yīng)：抗原與抗體結(jié)合引起的反應(yīng)，是人類對(duì)疾病具有抵抗力的重要標(biāo)志正常免疫反應(yīng)：機(jī)體保護(hù)作用；異常免疫反應(yīng)：機(jī)體有害的病理性免疫反應(yīng)半抗原：不具抗原性的小分子物質(zhì)，與蛋白結(jié)合后具有抗原性，這里小分子為半抗原此性質(zhì)在食品加工中也具有重要應(yīng)用共五十五頁(yè)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子(fnz)質(zhì)量一般在6000至100萬(wàn)常用的測(cè)定方法有:1、根據(jù)化學(xué)組成測(cè)定最低相對(duì)分子質(zhì)量2、滲透壓法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)最3、凝膠過濾法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量4、凝膠電泳法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量5、沉降法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量第六節(jié) 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量(zhling)的測(cè)定

14、共五十五頁(yè)1、凝膠過濾法原理：將具網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的葡聚糖凝膠裝柱，對(duì)分子量不同(b tn)的蛋白質(zhì)，由于進(jìn)入多孔性凝膠顆粒的能力不同(b tn)而在流動(dòng)相流動(dòng)過程中所走路徑不同(b tn)，從而有不同(b tn)的洗脫體積，來達(dá)到分離。凝膠法只適于測(cè)定球狀蛋白分子的相對(duì)(xingdu)質(zhì)量共五十五頁(yè)共五十五頁(yè)共五十五頁(yè)洗脫(x tu)體積與相對(duì)分子質(zhì)量的關(guān)系 相對(duì)(xingdu)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)洗脫體積（mL）共五十五頁(yè)聚丙烯酰胺凝膠具網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，作為電泳介質(zhì) SDS十二烷基硫酸鈉【CH3(CH2)11OSO3Na】 它是一種陰離子表面活性劑，也是一種有 效的蛋白變性劑 通常在待測(cè)分子量的蛋白質(zhì)樣品中加

15、入巰基乙醇和SDS。巰基乙醇打開(d ki)蛋白質(zhì)分子二硫鍵； SDS破壞蛋白質(zhì)分子的氫鍵和疏水鍵，并與之形成Pr-SDS復(fù)合物2、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳共五十五頁(yè)十二烷基硫酸鈉原態(tài)蛋白質(zhì)變性(binxng)？磺酸基 極性親水烷基 親油（蛋白質(zhì)疏水區(qū)）共五十五頁(yè)SDS-Pr復(fù)合物的特點(diǎn)：復(fù)合物帶大量負(fù)電，使得不同Pr電荷密度相同使球狀Pr變成雪茄狀，長(zhǎng)軸MW電泳時(shí)遷移率僅與蛋白質(zhì)分子量（MW或分子的長(zhǎng)軸）有關(guān)，而與分子形狀和帶電(di din)狀態(tài)無(wú)關(guān)。共五十五頁(yè)共五十五頁(yè)共五十五頁(yè)共五十五頁(yè)原理：不同分子量的Pr顆粒會(huì)以不同的速度沉降下來。用特殊的光學(xué)系統(tǒng)可觀察(gunch)到沉降界面，

16、從而得pr沉降速度。3、超離心(lxn)沉降法共五十五頁(yè)蛋白質(zhì)的沉降常數(shù)(沉降系數(shù), Svedberg Unite)不同的蛋白質(zhì)由于其分子大小不同，在一定的離心力場(chǎng)中沉降的速度也不同。沉降的速度是蛋白質(zhì)在單位時(shí)間內(nèi)下沉的距離，即v=dx/dt。沉降常數(shù)(s小寫)單位引力場(chǎng)中沉降分子的下沉速度。它表示沉降分子的大小特性。s=v（沉降速度）/2（角速度）x（顆粒距中心(zhngxn)距離）沉降常數(shù)是蛋白質(zhì)的特征性常數(shù)，它反應(yīng)蛋白質(zhì)分子的大小。共五十五頁(yè)由于已知的蛋白質(zhì)分子的沉降常數(shù)在110-1320010-13秒之間，把110-13s這一沉降系數(shù)值定為一個(gè)斯維德伯(Svedberg)氏單位(dnw

17、i)(s)，沉降常數(shù)為110-13 (簡(jiǎn)寫為1S，大寫)。蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量：Ms共五十五頁(yè) 斯維德貝格公式（Svedberg )M = RTs / D(1-）其中：M：蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量 s：為沉降系數(shù)，單位秒或“S”一般Pr的“s”在120010-13 秒 范圍內(nèi)，為方便將10-13 秒 作一個(gè)單位漂浮(pio f)單位“S” D：擴(kuò)散系數(shù)； ：蛋白質(zhì)的偏微比容（0.74cm3/g）；：溶劑的密度；R：氣體常數(shù)；T：絕對(duì)溫度共五十五頁(yè)一些蛋白質(zhì)的物理(wl)常數(shù)蛋白質(zhì) 相對(duì)分子量 擴(kuò)散系數(shù) 沉降系數(shù) 摩擦比 （D20，w107）cm2s1 （s020，w1013）s （f/f0）核糖核

18、酸酶A（牛） 12600 11.9 1.85 1.14細(xì)胞色素C（牛心肌） 13370 11.4 1.71 1.19肌紅蛋白（馬心?。?16900 11.3 2.04 1.11胰凝乳蛋白酶原（牛胰） 23240 9.50 2.54 1.19血清清蛋白（人） 68500 6.10 4.6 1.29血紅蛋白（人） 64500 6.90 4.46 1.16過氧化氫酶（馬肝） 247500 4.10 11.3 1.25血纖蛋白原（人） 339700 1.98 7.63 2.34肌球蛋白（鱈魚?。?524800 1.10 6.43 3.63煙草花葉病毒 40590000 0.46 198 2.03共五十

19、五頁(yè)第七節(jié) 蛋白質(zhì)在食品(shpn)加工中的變化一、熱處理的影響 1、溫和(wnh)加熱（60-90）：提高消化率；抗?fàn)I養(yǎng)因子和引起食品力變酶滅活：大豆脂肪氧合酶-不良風(fēng)味抗?fàn)I養(yǎng)因子-胰蛋白酶抑制劑，影響消化吸收，抑制引起胰腺過量分泌，引起胰腺腫大。 2、加熱和過度加熱：外消旋化；去硫；去酰胺；交聯(lián)（降低消化率、產(chǎn)生健康不利物質(zhì)）二、堿處理的影響 引起交聯(lián)，降低消化率和生物利用率，有的還有毒性，PH應(yīng)在11以下。三、冷凍對(duì)蛋白質(zhì)的影響 冰晶擠壓（原子間距離變化）蛋白變性，性質(zhì)發(fā)生變化（慢速降溫冰大，變性大）。共五十五頁(yè)四、干燥對(duì)蛋白質(zhì)的影響 破壞結(jié)合水膜，易受光氧影響五、蛋白質(zhì)的氧化 含硫和芳香氨基酸易氧化，易氧化順序：蛋半胱色