第九章—核酸分子雜交(上)周琳

1、核酸分子雜交技術(shù)Nucleic Acid Molecular Hybridization共四十頁主講(zhjing)內(nèi)容核酸分子(fnz)雜交的基本原理核酸探針核酸分子雜交技術(shù)共四十頁一、DNA的變性(binxng)（denaturation）變性：在一定的條件下，DNA雙螺旋之間的氫鍵斷裂，解離成兩條無規(guī)則的卷曲狀單鏈DNA分子(fnz)，此現(xiàn)象稱為變性。共四十頁復(fù)性：去除變性因素后，單鏈DNA通過堿基互補(bǔ)配對原則重新結(jié)合(jih)成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過程稱為復(fù)性。二、DNA的復(fù)性(f xn) (renaturation)退火淬火共四十頁 根據(jù)核酸變性和復(fù)性的原理，來源不同的兩條單鏈核酸

2、分子(fnz)通過堿基互補(bǔ)配對形成異源雙鏈雜交體的過程。三、核酸(h sun)分子雜交雜交的基礎(chǔ)：核酸分子單鏈之間的堿基互補(bǔ)配對。注：分子雜交可以在DNA與DNA、RNA與RNA、RNA與DNA的兩條單鏈之間進(jìn)行。共四十頁 核酸分子(fnz)的濃度 溫度 離子強(qiáng)度 核酸分子的復(fù)雜性 影響核酸(h sun)分子雜交的因素共四十頁四、核酸分子(fnz)雜交技術(shù) 通過標(biāo)記的單鏈核酸探針與固相支持物上或液相中單鏈的互補(bǔ)靶序列(xli)退火形成雙鏈雜交體，而定性或定量檢測特異DNA或RNA的技術(shù)。 共四十頁 第二節(jié) 核酸(h sun)探針 核酸(h sun)探針的概念 核酸探針的類型 核酸探針的標(biāo)記 核

3、酸探針的檢測方法 共四十頁 核酸探針( nucleic probe )：指能夠(nnggu)與待測的靶核酸片段互補(bǔ)結(jié)合的帶有特殊可檢測標(biāo)記的核苷酸片段。一、概念(ginin)共四十頁按化學(xué)(huxu)本質(zhì)分： DNA探針 RNA探針按標(biāo)記(bioj)物分： 放射性標(biāo)記探針 非放射性標(biāo)記探針按分子大小分： 寡核苷酸探針 單鏈探針 雙鏈探針二、核酸探針的類型共四十頁二、常見核酸(h sun)探針1.基因組DNA探針(tn zhn) 2.cDNA探針 3.RNA探針4.寡核苷酸探針來源于某種生物的基因組，為某 一基因的全部或部分序列。來源于cDNA,不含有內(nèi)含子序列，適用于基因表達(dá)研究。大多以單鏈形

4、式存在,雜交效率高?？赏ㄟ^體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)獲得。用化學(xué)合成技術(shù)在體外合成的單鏈DNA,長度一般為20-50bp。共四十頁三、核酸(h sun)探針的標(biāo)記 1.核酸(h sun)探針的標(biāo)記物 （1）放射性核素標(biāo)記物常用放射性核素標(biāo)記物有： 32P、35S、 3H優(yōu)點(diǎn)：靈敏度極高,可檢測到10-14 10-18g的物質(zhì)，在最適 條件下，可以測出樣品中少于1000個(gè)分子的核酸含量，光譜分析法只能鑒定10-9g的物質(zhì)。 對堿基配對的特異性和穩(wěn)定性無影響。 特異性高。缺點(diǎn)：放射性污染，有半衰期。共四十頁32P或35S同位素標(biāo)記(bioj)的單核苷酸（）（）（OH）HOH共四十頁(2)非放射性標(biāo)記(bioj)

5、物優(yōu)點(diǎn)：無放射性污染，穩(wěn)定性好，可以較長時(shí)間存放， 處理方便。缺點(diǎn)：靈敏度、特異性不夠(bgu)理想。常用非放射性標(biāo)記物有：生物素、地高辛、酶、熒光素 共四十頁2.核酸探針的標(biāo)記(bioj)方法（一）酶促法缺口平移(pn y)法隨機(jī)引物法DNA探針末端標(biāo)記法（二） 化學(xué)法預(yù)先標(biāo)記酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)移探針共四十頁（1）缺口(quku)平移法（nick translation） 由DNA酶和大腸桿菌DNA聚合酶共同完成。酶促法共四十頁隨機(jī)引物：含有(hn yu)各種可能排列順序的六核苷酸片段的混合物。（2）隨機(jī)(su j)引物法（random priming）酶促法共四十頁 在5或3端通過酶促反應(yīng)(fny

6、ng)加上標(biāo)記物DNA聚合酶Klenow片段(pin dun)3末端標(biāo)記法T4多核苷酸激酶5末端標(biāo)記法聚合酶鏈反應(yīng)標(biāo)記DNA探針RNA探針的標(biāo)記寡核苷酸鏈探針的標(biāo)記（3）探針的末端標(biāo)記酶促法共四十頁 DNA聚合酶Klenow片段(pin dun)3末端標(biāo)記法限制性內(nèi)切酶酶促法共四十頁 T4多核苷酸激酶(jmi)5末端標(biāo)記法ATPADP32PT4多核苷酸激酶(jmi)堿性磷酸酶酶促法共四十頁1.生物素地高辛標(biāo)記(bioj)核酸探針2.酶、熒光素標(biāo)記核酸探針化學(xué)法共四十頁生物素化核苷酸 生物素 ( biotin ) 標(biāo)記(bioj)生物素-16-dUTP共四十頁 光敏生物素標(biāo)記(bioj)法 強(qiáng)光

7、10-20分鐘 光敏生物素的結(jié)構(gòu)(jigu)共四十頁 地高辛 ( digoxigenin ) 標(biāo)記(bioj)Dig-11-dUTP的結(jié)構(gòu)(jigu)共四十頁 酶標(biāo)記(bioj)堿性(jin xn)磷酸酶辣根過氧化物酶 熒光素標(biāo)記異硫氰酸熒光素（FITC）熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架結(jié)合共四十頁四、 核酸探針(tn zhn)的檢測 核酸分子雜交反應(yīng)(fnyng)完成后，必須使已標(biāo)記的核酸探針顯示出可檢測信號，方能檢測未知的待測核酸序列。 1.放射性同位素標(biāo)記探針的檢測 2.非放射性標(biāo)記探針的檢測 共四十頁1.放射性同位素標(biāo)記(bioj)探針的檢測（1）放射自顯影：利用放射線在X線底片的

8、成影作用來 檢測雜交信號。（2）液體(yt)閃爍計(jì)數(shù)器：共四十頁2.非放射性標(biāo)記探針(tn zhn)的檢測（1）直接檢測：雜交反應(yīng)后可以立刻觀測結(jié)果。如酶 和熒光素直接標(biāo)記的探針。（2）間接(jin ji)檢測：反應(yīng)結(jié)果不能被直接檢測, 需經(jīng)兩步 反應(yīng)：與可檢測系統(tǒng)偶聯(lián)的偶聯(lián)反 應(yīng)，顯色反應(yīng)。 共四十頁 （1）直接(zhji)檢測法 堿性磷酸酶顯色(xin s)體系 辣根過氧化物酶顯色(xin s)體系酶促顯色法熒光法共四十頁Dig-DNA探針(tn zhn) + 抗Dig抗體-堿性磷酸酶（或辣根過氧化物酶）+ 底物 （2）間接(jin ji)檢測法 偶聯(lián)反應(yīng)共四十頁 顯色(xin s)反應(yīng)酶

9、法：通過(tnggu)酶促反應(yīng)使其底物形成有顏色的反應(yīng)產(chǎn)物堿性磷酸酶辣根過氧化物酶 DAB（二氨基聯(lián)苯胺）紅棕色TMB（四甲基聯(lián)苯胺）藍(lán)色共四十頁第三節(jié) 核酸(h sun)分子雜交技術(shù) 印跡雜交 核酸(h sun)原位雜交 液相印跡雜交固相雜交共四十頁 是將電泳分離的待測DNA片段固定在固相載體上，與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交，在與探針有同源(tn yun)序列的位置上顯示雜交信號的方法。一、傳統(tǒng)的核酸分子雜交(zjio)技術(shù)1、Southern 印跡雜交共四十頁提取(tq)DNA限制性內(nèi)切酶消化(xiohu)瓊脂糖凝膠電泳堿變性轉(zhuǎn)移到NC膜，高溫烘烤與DNA探針雜交放射自顯影基本步驟預(yù)雜交共四十

10、頁圖 虹吸印跡法共四十頁 與Southern Blotting不同的是：1. 不需要(xyo)限制性核酸酶切; 2. 變性方法不是堿變性，而是采用聚乙二醛和二甲基亞砜、甲醛、甲基氫氧化汞等方法。 檢測(jin c)靶分子為RNA RNA極易被環(huán)境中存在的RNase 降解，提取時(shí)要特別注意RNase 污染問題。2、Northern 印跡雜交共四十頁 3、斑點(diǎn)雜交與狹縫(xi fn)雜交 將RNA或DNA變性后直接點(diǎn)樣或用狹縫點(diǎn)樣器加樣于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，再用探針進(jìn)行(jnxng)雜交，這樣的方法稱為稱為斑點(diǎn)雜交（dot blotting）或狹縫雜交(slot blotting)。dot blottingslot blotting共四十頁4、Western 免疫(miny)印跡檢測(jin c)蛋白質(zhì)共四十頁共四十頁內(nèi)容摘要核酸分子雜交技術(shù)Nucleic Acid Molecular Hybridization。復(fù)性：去除變性因素后，單鏈DNA通過堿基互補(bǔ)配對原則重新結(jié)合成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過程稱為復(fù)性。雜交的基礎(chǔ)：核酸分子單鏈之間的堿基互補(bǔ)配對。來源于某種生物的基因(jyn)組，為某 一基因(jyn