碩士研究生開題報(bào)告課件

1、碩 士 研 究 生開題報(bào)告 姜黃素對(duì)鼻咽癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn) 移的影響機(jī)理及放射增敏研究 研究生 范德生 導(dǎo)師 孫 寧 教授 時(shí)間 2004 10 第一部分立 題 依 據(jù)鼻咽癌的特點(diǎn)1.發(fā)病 2. 病變及治療特點(diǎn) 3 .鼻咽癌患者死亡原因 總之，在華南地區(qū)研討鼻咽癌的 轉(zhuǎn)移及放療問(wèn)題具有重要的意義 鼻咽癌轉(zhuǎn)移 關(guān)于腫瘤的轉(zhuǎn)移研究有“種子和土壤學(xué)說(shuō)”、腫瘤的異質(zhì)性等許多理論和學(xué)說(shuō)。而細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力則是腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的先決條件細(xì)胞骨架與細(xì)胞運(yùn)動(dòng) 一 細(xì)胞骨架 1） 微絲 2） 微管 3) 中間纖維 二 細(xì)胞運(yùn)動(dòng) 大概分三步，但具體機(jī)制尚不十 分清楚。與肌動(dòng) 蛋白、肌球蛋白 等的變化有關(guān)。細(xì)胞骨架與腫瘤

2、轉(zhuǎn)移有研究顯示惡性程度不同腫瘤細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白微絲和微管骨架均有數(shù)量減少及發(fā)育不良，其完善程度與橫紋肌肉瘤的轉(zhuǎn)移潛能呈負(fù)相關(guān)，纖維狀肌動(dòng)蛋白（fibrous actin，F(xiàn)-actin）的出現(xiàn)頻率與橫紋肌肉瘤的轉(zhuǎn)移潛能呈正相關(guān)，細(xì)胞骨架與腫瘤轉(zhuǎn)移 研究提示不同程度細(xì)胞骨架的異?？赡芘c橫紋肌肉瘤的轉(zhuǎn)移潛能不同有關(guān)，微管持續(xù)解聚可能與細(xì)胞的高活動(dòng)性、低粘附性和高轉(zhuǎn)移性有一定聯(lián)系。細(xì)胞骨架與腫瘤轉(zhuǎn)移有學(xué)者采用cDNA代表性差異分析法篩選鼻咽癌中不表達(dá)的或表達(dá)降低的cDNA序列，發(fā)現(xiàn)了與細(xì)胞骨架成分相關(guān)的基因。提示鼻咽癌早期轉(zhuǎn)移極有可能與細(xì)胞骨架相關(guān)的基因不表達(dá)或表達(dá)下調(diào)相關(guān)。 EGF、EGFR與腫瘤轉(zhuǎn)

3、移 表皮生長(zhǎng)因子（EGF)是一種小分子多肽，EGF是由53個(gè)氨基酸構(gòu)成的單鏈多肽,，分子量為6.45kD，內(nèi)含三個(gè)雙硫鍵，其生物學(xué)作用極其廣泛,特別是上皮細(xì)胞的增殖有重要影響。表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）是EGF的唯一受體，其超表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 EGF、EGFR與腫瘤轉(zhuǎn)移 1）有研究證實(shí)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和遷移能力隨EGF量的增加而增強(qiáng) 2）我教研室亦有試驗(yàn)證實(shí)隨著NPC單克隆細(xì)胞的演進(jìn)，移植瘤保持了高水平的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率，EGFR的表達(dá)亦增強(qiáng) 3)原因可能是EGF促進(jìn)細(xì)胞DNA合成同時(shí)增加角蛋白、纖維蛋白和膠原蛋白的合成 EGF、EGFR與細(xì)胞骨架 1） EGF作為一種配體與細(xì)胞膜上

4、的EGFR結(jié)合，改變受體的三維構(gòu)象，使之二聚體化，進(jìn)而可激活眾多的下游信號(hào)路徑 2）研究較明確的主要有兩條途徑：一條是ras-raf-MEK-erk/MAPK途徑；另一條是PI3K-PKC-IKK途徑 。 3）以上途徑使IJBA磷酸化后導(dǎo)致NFJB移位至核內(nèi)，而將信息傳遞入核，該途徑與細(xì)胞移動(dòng)性的增強(qiáng)有關(guān) EGF、EGFR與細(xì)胞骨架EGF與EGFR結(jié)合后，可以激活細(xì)胞骨架，通過(guò)對(duì)細(xì)胞骨架重構(gòu)、粘附、移動(dòng)、表達(dá)和蛋白酶的活化等多種作用，影響腫瘤的轉(zhuǎn)移性 actin修飾蛋白的動(dòng)員是EGFR介導(dǎo)的遷移反應(yīng)所必需的 EGF與電離輻射研究證明電離輻射會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞EGFR應(yīng)激性激活。姜黃素概況 充分利用

5、我國(guó)中醫(yī)藥資源 姜黃(curcuma)是姜科植物的根莖， 因其根莖盤屈呈黃色，形似生姜而故名 姜黃素藥理作用廣泛，主要特性為抗炎 和抗氧化。姜黃素的抗腫瘤研究Kuttan等發(fā)現(xiàn)姜黃素明顯抑制CHO(倉(cāng)鼠卵巢)細(xì)胞的生長(zhǎng)后來(lái)試驗(yàn)陸續(xù)證實(shí)對(duì)其它腫瘤的抑制作用 體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，姜黃素對(duì)食管癌、胃癌、結(jié)腸癌細(xì)胞等具有直接殺傷作用 姜黃素抗腫瘤的機(jī)理 目前研究情況 誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡 抑制蛋白激酶C的活性 降低轉(zhuǎn)移率，抑制血管生成 Liu Squires的研究結(jié)果提示，姜黃素在與抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡有關(guān)的MAPK和 PI3K信號(hào)傳導(dǎo)通路中有多種不同的靶分子 研究提示姜黃素在體外是通過(guò)與磷酯酰絲氨酸競(jìng)爭(zhēng)來(lái)

6、抑制PKC的活力 姜黃素抗腫瘤的可能機(jī)理姜黃素抗鼻咽癌的機(jī)理姜黃素具有較好的抗腫瘤活性，對(duì)正常生物體無(wú)毒、副作用 本室已完成的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，姜黃素可抑制CNE-2Z細(xì)胞體外生長(zhǎng)、及產(chǎn)生G2/M期阻滯。 姜黃素抗鼻咽癌的機(jī)理新探是否通過(guò)抑制EGF/EGFR-PKC途徑而改變腫瘤細(xì)胞骨架影響其侵襲轉(zhuǎn)移能力 是否能通過(guò)細(xì)胞骨架的破壞對(duì)鼻咽癌細(xì)胞起直接殺傷的作用 姜黃素與輻射增敏 1）已有研究證明對(duì)多種腫瘤有增敏作用 2）對(duì)鼻咽癌細(xì)胞輻射增敏本室已有研究 姜黃素與輻射增敏姜黃素抑制EGF/EGFR的PKC作用通路而EGFR具有較強(qiáng)輻射抗性 4) 未見鼻咽癌姜黃素輻射增敏體內(nèi)試驗(yàn)報(bào)道 第二部分實(shí)驗(yàn)?zāi)康?EG

7、F、EGFR對(duì)鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響是否通過(guò)PKC-細(xì)胞骨架改變的途徑進(jìn)行 姜黃素對(duì)鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，是否通過(guò)EGF/EGFR-PKC-細(xì)胞骨架改變的途徑進(jìn)行姜黃素是否可以通過(guò)抑制PKC活力的途徑起到增敏作用姜黃素是否可能通過(guò)破壞細(xì)胞骨架直接殺傷腫瘤細(xì)胞總之，要（通過(guò)體內(nèi)體外試驗(yàn)）探討姜黃素抑制腫瘤轉(zhuǎn)移及輻射增敏的可能機(jī)制。 第三部分技術(shù)路線CNE-2Z體外培養(yǎng)接種裸鼠姜黃素MTT電鏡光鏡RT-PCRWB IP IHC觀察腫瘤生長(zhǎng)特性增殖試驗(yàn)侵襲運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)細(xì)胞形態(tài)ACTIN KERATINTUBLINEGF EGFRCNE-2接種裸鼠對(duì)照組姜黃素組放射組姜黃素放射組原發(fā)瘤體積的測(cè)量轉(zhuǎn)移瘤的

8、數(shù)量及體積原發(fā)瘤血管密度的檢測(cè)PKC活性的檢測(cè)主要實(shí)驗(yàn)方法1）鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z的復(fù)蘇培養(yǎng)及裸鼠皮下接種；2）光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察姜黃素處理前后CNE-2Z及其裸鼠移植瘤的細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞骨架改變；主要實(shí)驗(yàn)方法 3 ） 體外粘附侵襲動(dòng)力實(shí)驗(yàn)檢測(cè)姜黃素處理CNE-2Z的侵襲動(dòng)力能力的變化； 4） RT-PCR：EGF、EGFR、actin、keratin和tublin mRNA的轉(zhuǎn)錄； 5）Western-blot、免疫熒光化學(xué)染色：檢測(cè)CNE-2Z細(xì)胞actin、keratin、tublin、EGF及EGFR的蛋白表達(dá)。動(dòng)物試驗(yàn)觀察各組移植瘤重、體積的變化，瘤組織內(nèi)血管形成和計(jì)數(shù)（免疫組化），轉(zhuǎn)移瘤情況，及細(xì)胞形態(tài)骨架改變。液相色普法檢測(cè)各組移植瘤與轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞PKC的活性。 第四部分預(yù)期結(jié)果1 EGF/ EGFR可以引起CNE-2Z的細(xì)胞骨架改變 2 姜黃素對(duì)NPC的轉(zhuǎn)移的影響通過(guò)EGF/EGFR-PKC-細(xì)胞骨架改變的途徑進(jìn)行 3 姜黃素對(duì)CNE-2Z有直接殺傷作用4 姜黃素可以通過(guò)抑制PKC活性的作用起到增敏效果編號(hào) 項(xiàng)目 經(jīng)費(fèi)(元) 1細(xì)胞培養(yǎng)基本材料3000.00 2RT-PCR試劑盒5000.003裸鼠培養(yǎng)、電鏡、放