不同刺激劑和培養(yǎng)環(huán)境對(duì)CD4+ 、 CD8+ T細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)的影響

1、差異刺激劑和造就環(huán)境對(duì)CD4+ 、 CD8+ T細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)的影響【關(guān)鍵詞】流式細(xì)胞術(shù);,T細(xì)胞亞群;,細(xì)胞因子;,刺激劑;,造就條件ytkineexpressinfD4+andD8+TellsinduedbydifferentstiuliunderdifferentulturenditinsAbstratAI:TinvestigatetheeffetfdifferentstiulianddifferentulturenditinsntheytkineexpressinfD4+andD8+Tells.ETHDS:PBsereislatedfrnralhuanperipheralbldan

2、dulturediththreekindsfstiuli(PHA,antiD3andantiD28Abs,PAandinyin)underfurdifferentulturenditins(rteperature,37aterbath,37inubatr,37and50L/L2inubatr)fr4.55handintraellularytkines(IL2,IFNandTNF)inTellsereassessedbyflytetry(F).RESULTS:ytkineexpressinfD4+andD8+Tellsvariedhentreatedithdifferentstiuliunder

3、differentnditins.PAhadthestrngeststiulativeeffetnytkineexpressinfPB,hiletheeffetfantiD3Abaseaker,andthatfPHAastheeakest.DifferentulturenditinsdidntgreatlyhangetheytkineexpressinprfilefTells(P0.05)exeptthatthereereveryfeytkineprduingellshenPBsereulturedatrteperature.NLUSIN:AntiD3andantiD28Abs,PAandin

4、yinarereendedfrthestiulatinfPBsanddetetinfintraellularytkineusingF.ultureteperaturebutntthenentratinf2isthestiprtantfatrduringtheshrtterTellstiulatin.Keyrdsflytetry;Tellsubset;ytkine;stiulus;ulturenditin摘要目的:探究差異的刺激劑和差異的造就條件對(duì)D4+和D8+T細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)的影響。要領(lǐng):分散正凡人的外周血單個(gè)核細(xì)胞PB,別離參加3種差異的刺激劑PHA,抗D3和抗D28Ab,PA和離子霉素

5、,置于4種差異的造就環(huán)境下室溫,37水浴,37造就箱,3750L/L2造就箱造就455h。網(wǎng)絡(luò)細(xì)胞,以熒光素Ab標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟后,用流式細(xì)胞術(shù)闡發(fā)D4+、D8+T細(xì)胞內(nèi)IL2、IFN和TNF的表達(dá)。結(jié)果:D4+和D8+T細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá),隨著刺激劑的差異而有所差異,且在上述4種造就環(huán)境中,PA的刺激結(jié)果最強(qiáng),抗D3Ab次之,PHA的刺激效應(yīng)最弱。以上述3種刺激劑刺激后,差異造就條件對(duì)T細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)有必然的影響。室溫造就時(shí)險(xiǎn)些檢測(cè)不到細(xì)胞因子的表達(dá),而在37水寓37造就箱和3750L/L2造就箱中造就時(shí),表達(dá)細(xì)胞因子的D4+和D8+T細(xì)胞的百分率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05。結(jié)論:差異刺

6、激劑體外刺激T細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的效應(yīng)差異,依次為PA和離子霉素抗D3和抗D28AbPHA。體外刺激造就的T細(xì)胞活化歷程中,溫度是緊張的條件,2無(wú)顯著影響。關(guān)鍵詞流式細(xì)胞術(shù);T細(xì)胞亞群;細(xì)胞因子;刺激劑;造就條件應(yīng)用熒光素標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的抗細(xì)胞外貌抗原的單克隆抗體Ab和抗細(xì)胞因子的Ab,流式細(xì)胞術(shù)不但可檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的多種細(xì)胞因子,還可區(qū)分表達(dá)特定細(xì)胞因子的細(xì)胞亞群1。但該技能涉及的環(huán)節(jié)較多,因此,需對(duì)各方面的影響因素舉行探究。我們?cè)U發(fā)了刺激時(shí)間和結(jié)實(shí)破膜劑等因素對(duì)該要領(lǐng)的影響2,但對(duì)付差異刺激劑和差異造就環(huán)境對(duì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)的影響尚未見報(bào)道。為此,本研究中闡發(fā)了3種刺激劑PHA,抗D3和抗

7、D28Ab,PA和離子霉素以及4種造就環(huán)境室溫,37水浴,37造就,3750L/L2條件下造就對(duì)D4+和D8+T細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)的影響。本研究可為在沒(méi)有2造就箱的條件下,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞外貌和細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子提供實(shí)行根據(jù),同時(shí)為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的尺度化奠基了基矗1質(zhì)料和要領(lǐng)1.1質(zhì)料PerP標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的抗D8AbPerPantiD8Ab、AP標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的抗D4Ab(APantiD4Ab)、PE標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的抗TNFAb(PEantiTNFAb)、PE標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的抗IL2AbPEantiIL2Ab、FIT標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的抗IFNAb(FITantiIFNAb)及匹配的同型比擬Ab抗體,均

8、購(gòu)自美國(guó)BD公司。佛波酯PA、離子霉素(Inyin)、布雷桿氏菌素ABFA、皂苷(Sapnin)等,均購(gòu)自Siga公司。鼠抗人D3和抗D28Ab購(gòu)自美國(guó)BDPharingen公司。RPI1640造就液和Hanks液購(gòu)自GIB公司。葡聚糖泛影葡胺Fillhypaque購(gòu)自上海華精生物科技公司。BDFASalibur流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)物。2造就箱為美國(guó)RSBiteh公司產(chǎn)物。1.2要領(lǐng)圖1在PA刺激下,4種造就環(huán)境造就的T細(xì)胞中3種細(xì)胞因子的表達(dá)略Fig1Expressinf3ytkinesinD4+andD8+Tellsulturedunderthenditinsf4differentu

9、lturesafterPAstiulatinFS:Frardsatter;SS:Sidesatter.R1:Lyphytes;R2:D8+Tells;R3:D4+Tells.ThenubersinthedensitypltaretheperentagefytkineprduingellsangD4+()andD8+(D)Tells.A:DensitypltfFSvsSSallsidentifiatinflyphytes;B:DensitypltfD8vsD4allsidentifiatinfD4+andD8+Tells;:Expressinf3ytkinesinD4+Tells;D:Expre

10、ssinf3ytkinesinD8+Tells.RT:Rteperature;B:aterbath.2結(jié)果Fig2TheeffetsfdifferentstiulatrsandulturenditinsnytkinesexpressininD4+andD8+TellsatRT;Bat37;Inubatrat37;Inubatrntaining50L/L2at37.aP0.05,bP0.01vsatRTunderthesaestiulatinnditin.2.2D4+和D8+T細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的差異當(dāng)以PA或抗D3Ab刺激PB時(shí),在37水寓37造就箱和3750L/L2造就箱中造就4.55h后,D

11、4+和D8+T細(xì)胞均可表達(dá)細(xì)胞因子。進(jìn)一步闡發(fā)的結(jié)果表白,當(dāng)以抗D3Ab刺激PB時(shí),D8+T細(xì)胞中IFN和TNF的表達(dá)均明顯高于D4+T細(xì)胞。當(dāng)以PA刺激PB時(shí),表達(dá)IL2的T細(xì)胞中,D4+T細(xì)胞的陽(yáng)性率明顯高于D8+T細(xì)胞P0.05;而在表達(dá)IFN的T細(xì)胞中,D8+T細(xì)胞的陽(yáng)性率那么明顯高于D4+T細(xì)胞P0.05。表達(dá)TNF的T細(xì)胞中,D4+T細(xì)胞與D8+T細(xì)胞的陽(yáng)性率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異圖3。2.3抗D3Ab/PA誘導(dǎo)細(xì)胞因子表達(dá)的特點(diǎn)當(dāng)以抗D3Ab刺激時(shí),大多數(shù)D4+T細(xì)胞只表達(dá)TNF或同時(shí)表達(dá)TNF和IFN;而大多數(shù)D8+T細(xì)胞可同時(shí)表達(dá)TNF和IFN或只表達(dá)IFN,僅表達(dá)IL2的細(xì)胞只占少數(shù)

12、。當(dāng)以PA刺激時(shí),得到雷同的結(jié)果,但表達(dá)細(xì)胞因子的細(xì)胞的百分率顯著增長(zhǎng)圖4。圖3D4+和D8+T細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的差異略Fig3DifferenefytkineexpressininD4+andD8+Tells圖4抗D3Ab/PA誘導(dǎo)D4+和D8+T細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的特點(diǎn)略Fig4harateristisfytkinesexpressinfD4+andD8+TellsinduedithantiD3AbrPA3討論比年來(lái),使用流式細(xì)胞術(shù)在單個(gè)細(xì)胞程度上闡發(fā)細(xì)胞外貌標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá),它具有特異性強(qiáng)、敏感度高、快速省時(shí)及易于操縱等特點(diǎn),在臨床和科研中已普及應(yīng)用3-5。由于活化的T細(xì)

13、胞才氣產(chǎn)生細(xì)胞因子,為此,我們接納了3種多克隆刺激劑PHA、PA和離子霉素、抗D3和抗D28Ab刺激PB后,并置于4種差異的造就環(huán)境室溫,37水浴,37造就箱,3750L/L2造就箱中舉行造就,不雅察T細(xì)胞中細(xì)胞因子的表達(dá)環(huán)境。結(jié)果表白,PA的刺激結(jié)果最強(qiáng),抗D3Ab次之,PHA的刺激效應(yīng)最弱。幾種差異的造就環(huán)境對(duì)D4+和D8+T細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子影響的結(jié)果表現(xiàn),室溫造就時(shí),表達(dá)細(xì)胞因子的T細(xì)胞的比率很低,但其他3種造就環(huán)境比擬力,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05,尤其用抗D3Ab刺激時(shí),結(jié)果非常不變,提示溫度是緊張的條件。2的重要作用是維持造就體系的酸堿度,假設(shè)細(xì)胞在體外只短期4.55h造就,造就箱

14、中有無(wú)2對(duì)實(shí)行的結(jié)果影響不大。T細(xì)胞非均一的細(xì)胞群體,按照成效和H分子限定性的差異,可將成熟的T細(xì)胞分為D4+和D8+T細(xì)胞兩個(gè)亞群6,7,它們表達(dá)的細(xì)胞因子有所差異8,9。Jasn等8報(bào)道,在PHA/PA/離子霉素刺激淋巴細(xì)胞45.5h后,表達(dá)IL2的D4+T細(xì)胞的百分率高于D8+T細(xì)胞;而表達(dá)IFN的T細(xì)胞的比率那么恰相反,但表達(dá)TNF的細(xì)胞的比率在兩群T細(xì)胞間無(wú)顯著差異,與本實(shí)行的結(jié)果根本同等。但上述細(xì)胞因子的表達(dá)環(huán)境在以抗D3Ab刺激時(shí)那么稍有差異,即表達(dá)TNF的D8+T細(xì)胞的比率高于D4+T細(xì)胞。關(guān)于上述3種細(xì)胞因子同時(shí)表達(dá)的環(huán)境,本研究的結(jié)果也與Jasn等的報(bào)道根本同等,即以PA刺

15、激時(shí),D4+和D8+T細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)IFN和TNF、IFN和IL2的細(xì)胞的比率均較高,而以抗D3Ab刺激時(shí),同時(shí)表達(dá)IFN和IL2的D4+和D8+T細(xì)胞的比率很低,與用特異性抗原刺激時(shí)所不雅察到的結(jié)果較為相似10?？傊?通過(guò)闡發(fā)差異的刺激劑和差異的造就環(huán)境對(duì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)的影響,可選擇差異的刺激劑和差異的造就條件,這不但更有利于流式細(xì)胞術(shù)的普及,并且為該技能在科研和臨床中的應(yīng)用并使其尺度化奠基了基矗參考文獻(xiàn):1PerfettSP,hattpadhyayPK,Rederer.Seventeenlurflytetry:unravelingtheiunesysteJ.NatRevIunl,202

16、2,4(8):648-655.2周茂華,王丁,張建軍,等.四色法流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的要領(lǐng)學(xué)探究J.當(dāng)代查驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2022,184:1-3.3ShlbinA,estEE,LehtzinN,etal.PersistentytegalvirusspeifieryrespnsesinthelungallgraftandbldfllingpriaryinfetininlungtransplantreipientsJ.JIunl,2022,176(4):2625-2634.4KtakeS,NankeY,gi,etal.IFNgaaprduinghuanTellsdiretlyindues

17、telastgenesisfrhuannytesviatheexpressinfRANKLJ.EurJIunl,2022,35(11):3353-3363.5錢莘,施明,王福生.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的研究希望J.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2022,211:S62-64.6dlandDL,DuttnR.HetergenEityfD4(+)andD8(+)TellsJ.urrpinIunl,2022,15(3):336-342.7SederRA,AhedR.SiilaritiesanddifferenesinD4+andD8+effetranderyTellsgeneratinJ.NatIunlRev,2022,4(9):835-842.8JasnJ,LarnedJ.Singleellytkineprfilesinnralhuans:parisnfflytetrireagentsandstiulatinprtlsJ.JIunlethds,1997,207(1):13-22.9LeeBN,Fllen,ShenDY,etal.Depressedtype1ytkinesynthesisbysu