Lipstatin高產(chǎn)菌株篩選

1、Lipstatin高產(chǎn)菌株挑選【摘要】以毒三素鏈霉菌X-lp-2的變株T-3為動身菌株，經(jīng)UV和微波復(fù)合誘變處置懲罰，并在含豆油的平板上定向挑選耐豆油突變株，得到了高產(chǎn)突變株X-lp-69，其lipstatin發(fā)酵效價到達(dá)911g/l，較動身菌株T-3進步了71.6%。傳代試驗表白突變株X-lp-69的高產(chǎn)遺傳特性不變。【關(guān)鍵詞】Lipstatin；菌種選育；誘變；毒三素鏈霉菌ABSTRATAfterStretyestxytriiniT-3astreatedbyUVandiraveirradiatin,thesybeaniltlerantutantseresreenedandahigh-tit

2、restrainX-lp-69asbtained.TheprdutivityfstrainX-lp-69reahed911g/l,hihis71.6%rethanthatfthestartingstainT-3.ThesubultureexperientsindiatedthatthehereditaryharaterfhighprdutivityfstrainX-lp-69isstable.KEYRDSLipstatin;Strainbreeding;Induedutatin;Streptyestxytriini收稿日期：2022-11-29作者簡介：韓俊茹，女，生于1966年，女，碩士。研

3、究標(biāo)的目的：生物制藥。Lipstatin(利普司他汀)是毒三素鏈霉菌(Stretyestxytriini)的代謝產(chǎn)物，能選擇性按捺胃腸道中胰脂肪酶的活性，淘汰脂肪的剖析和汲取，其四氫衍生物奧利司他(rlistat)已被Rhe公司開拓為減胖藥(商品名：賽尼可，Xenial)1，2，是如今唯逐一個作為非中樞神經(jīng)體系作用上市的治療胖胖癥的藥物3。因此，發(fā)酵法消費lipstatin備受存眷。進步lipstatin的發(fā)酵消費程度重要依靠于菌種選育和發(fā)酵工藝(造就基和造就條件)的優(yōu)化這兩個相輔相成的環(huán)節(jié)。本文接納紫外線照耀和微波瓜代處置懲罰，并結(jié)合豆油耐受性菌株的理性化挑選，選育lipstatin高產(chǎn)菌株

4、，得到了高產(chǎn)突變株X-lp-69，發(fā)酵程度較原始菌株(X-lp-2)進步了2倍多，且該菌株經(jīng)屢次傳代后高產(chǎn)特性不變性較好。1質(zhì)料與要領(lǐng)1.1菌種毒三素鏈霉菌(Stretyestxytriini)X-lp-2由浙江醫(yī)藥股份新昌制藥廠提供，發(fā)酵效價300g/l擺布。1.2造就基(1)歪面及分散平板造就基(g/L)可溶性淀粉10.0，卵白胨5.0，KN32.0，Nal2.0，KH2P42.0，瓊脂20.0，去離子水配制，pH6.87.0。(2)搖瓶種子造就基(g/L)冷榨黃豆餅粉15.0，甘油15.0，酵母膏7.5，豆油5.0，KN32.0，gS47H21.0，自來水配制，pH7.07.2。(3)發(fā)

5、酵造就基(g/L)冷榨黃豆餅粉30.0，甘油20.0，大豆卵磷脂12.0，酵母粉10.0，豆油5.5，自來水配制，pH7.07.2。1.3造就條件(1)歪面造就條件造就溫度(300.5)，相對濕度35%50%，造就時間120150h。(2)種子造就條件造就溫度27，250l三角瓶裝量25l，轉(zhuǎn)速240r/in，造就時間2024h。(3)發(fā)酵造就條件造就溫度27，250l三角瓶裝量25l，轉(zhuǎn)速240r/in，造就時間120h。1.4誘變處置懲罰(1)紫外線照耀將單孢子懸浮液置紫外誘變箱(紫外燈功率30，波長253n照耀垂直間隔30)中誘變處置懲罰一按時間，用黑布包好，在紅燈下用無菌水做梯度稀釋后

6、涂布平板，30避光造就56d，挑單菌落傳歪面。(2)微波處置懲罰將單孢子懸浮液置于滅菌10l試管中，在500l燒杯中冰浴；然后將冰浴燒杯連同試管放入800的微波爐中，功率開至中檔，照耀一按時間，經(jīng)梯度稀釋后涂布平板，30造就56d，待菌完工熟后挑單菌落傳歪面。1.5耐豆油突變株挑選將顛末UV照耀、微波處置懲罰或兩者瓜代處置懲罰后得到的孢子懸液梯度稀釋后，別離涂布于含必然豆油濃度的分散平板上，30造就。1.6闡發(fā)要領(lǐng)(1)Lipstatin發(fā)酵效價測定試樣制備取發(fā)酵液10l，4000r/in離心15in，上清液用丙酮14的比例稀釋搖勻浸泡1h，取上清液再次10000r/in離心3in或膜過濾，取

7、清液舉行HPL測定胞外效價，并用同樣的要領(lǐng)測定菌絲體沉淀中的產(chǎn)物量(胞內(nèi)效價)。本文中發(fā)酵效價為胞表里效價之和。HPL色譜條件色譜柱18DS(4.6250，5)，柱溫35，檢測器DAD(HP1100)，檢測波長210n，活動相為乙腈水(8614)，流速0.8l/in。(2)pH測定用酸度計測定。(3)菌絲濃度測定取10l發(fā)酵液，4000r/in離心15in，測定沉淀物在發(fā)酵液中所占比例作為菌絲濃度。2效果與討論2.1動身菌株的選擇取4冰箱保存的10株菌(X-lp-2經(jīng)屢次天然分散或其他誘變處置懲罰，經(jīng)差異模子選擇的較優(yōu)菌株)，一連發(fā)酵三批，其效果均勻值見表1。由表1可以看出T-3菌株lipst

8、atin發(fā)酵效價較高，因此選擇T-3為動身菌株。2.2紫外線誘變處置懲罰效果試驗中對動身菌株T-3舉行差異劑量的UV誘變處置懲罰，經(jīng)梯度稀釋后涂布平板，待菌落生長成熟后，從每個處置懲罰劑量平板中挑取30個單菌落別離傳歪面，逐一接種發(fā)酵瓶，觀察誘變株的發(fā)酵程度，統(tǒng)計其致死率、變異率(10%以上)和正變率，所得效果見表2。由表2可知，隨紫外線照耀時間的延伸，致死率、變異率相應(yīng)增長，但正變率較超過如今偏低劑量(60s)，這與有關(guān)報道4同等，故后續(xù)試驗中均接納UV照耀60s。經(jīng)屢次UV誘變選得菌株T-63，較動身菌株T-3效價進步20%，到達(dá)636g/l。2.3微波誘變處置懲罰效果試驗中對動身菌株舉行

9、了差異時間的微波照耀處置懲罰，稀釋涂平板，待菌完工熟后轉(zhuǎn)接歪面，搖瓶發(fā)酵觀察。統(tǒng)計致死率、正突變率和產(chǎn)量的最大進步率，效果見表3。由表3可以看出，隨著微波照耀時間的延伸致死率上升，正變率落落，但產(chǎn)量最大進步率隨時間延伸而上升，故后續(xù)試驗接納微波照耀7in。以T-63為動身菌株，舉行微波誘變，微波處置懲罰后的孢子懸浮液經(jīng)得當(dāng)稀釋后涂布于分散平板，待菌完工熟后，挑單菌落傳歪面，舉行搖瓶發(fā)酵初篩和復(fù)篩。得到高產(chǎn)菌株-39，總發(fā)酵效價和胞外發(fā)酵效價均高于菌株T-63，效果見圖1、圖2。從圖1、圖2可以看出，T-63造就至發(fā)酵竣事時(5d)排泄至胞外的lipstatin只有35%，而-39達(dá)50%，比本

10、來進步了15%，且總的發(fā)酵效價也進步了18%。推測微波的作用改變了菌體細(xì)胞膜的通透性，促進了胞內(nèi)lipstatin的外排，減輕了lipstatin對其自身表1冰箱保存菌株產(chǎn)生lipstatin的環(huán)境表2差異UV劑量誘變處置懲罰效果(表3差異時間微波處置懲罰效果生物合成途徑的反響調(diào)治作用，促進lipstatin的合成。2.4耐豆油突變株挑選文獻(xiàn)報道，豆油為lipstatin的合成提供前體5，6。通過選育耐豆油突變株，能充實使用造就基中的豆油合成大量前體物質(zhì)到場lipstatin的生物合成，大幅度進步產(chǎn)量。以T-63的單孢子懸浮液經(jīng)得當(dāng)稀釋后，涂布于含差異濃度豆油的分散平板上，造就不雅察，效果如表

11、4。從表4可以看出，當(dāng)豆油濃度為1.5%(V/V)時，lipstatin產(chǎn)生菌的生長受到嚴(yán)峻的按捺，同時創(chuàng)造隨著豆油濃度的增長，造就皿中菌落的生長速率也隨之變慢，且菌落變校確定1.5%(V/V)劑量舉行耐受突變株的挑選，進一步對耐豆油變株的消費本領(lǐng)舉行了統(tǒng)計闡發(fā)，其產(chǎn)量漫衍效果見圖3。從圖3可以不雅察到耐豆油突變株中，lipstatin合本錢領(lǐng)高于動身菌株的占42%，低于動身菌株的占10%，與動身菌株持平的占48%。云云高的正變率，說明白此挑選要領(lǐng)的公正性。表4差異濃度豆油對lipstatin產(chǎn)生菌生長的影響圖3耐豆油變株產(chǎn)量漫衍圖耐受劑量1.5%(V/V)顛末5輪UV和微波瓜代處置懲罰，高濃

12、度豆油平板選擇，得到菌株X-lp-69發(fā)酵效價達(dá)911g/l，較原始菌株X-lp-2(300g/l)進步了2倍多。推測這種誘變和挑選要擁有助于進步菌體的脂肪酶的合本錢領(lǐng)或活性，或進步脂肪酶的排泄速率，增長lipstatin合成所需前體濃度，進步lipstatin的效價。2.5高產(chǎn)菌株X-lp-69的不變性觀察用群體傳代的要領(lǐng)觀察了高產(chǎn)菌株X-lp-69的歪面?zhèn)鞔蛔冃?，效果見?。表5X-lp-69高產(chǎn)菌株的不變性觀察表5效果表現(xiàn)，顛末一連傳5代，菌株X-lp-69的消費本領(lǐng)根本同等，說明菌株X-lp-69的高產(chǎn)性能遺傳特性不變。3討論通過UV和微波復(fù)合挑選得到遺傳性能不變的lipstatin

13、高產(chǎn)菌株X-lp-69?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1endy,PaulB.listatatJ.Drugs,1998,56(2):2412eliaAT,ZhiJ,ZelaskR,etal.TheinteratinfthelipseinhibitrrlistatithethanlinhealthyvlunteersJ.EurJlinPharal,1998,54(910):7733HllanderPA,ElbEinS,HirshIB,etal.Rlefrlistatinthetreatentfbesepatientsithtype2diabetesJ.Diabare,1998,21(8):12884周德慶著.微生物教程