RAPD在絞股藍種類鑒別應用上的條件摸索

1、RAPD在絞股藍種類區(qū)分應用上的條件探究羅育，李雄英，吳耀生，蔣軍富，趙瑞強，曾麒燕【摘要】目的為接納隨機擴增多態(tài)性技能區(qū)分絞股藍及其易混品烏蘞莓，舉行RAPD條件探究。要領運用革新TAB法提取七葉絞股藍、五葉絞股藍、烏蘞莓以及煙草基因組DNA，探究影響RAPD的條件。結(jié)果用革新TAB法提取所得的DNA質(zhì)量較好，均能用于RAPD擴增，并探究出了最優(yōu)RAPD擴增條件。結(jié)論革新的TAB法得當于這4蒔植物的DNA提取，探究得到的RAPD擴增條件可用于絞股藍種類區(qū)分及與其易混品烏蘞莓的區(qū)別?！娟P鍵詞】絞股藍基因組DNA隨機擴增多態(tài)性DNA區(qū)分Keyrds:Gynsteapentaphyllu;Gene

2、DNA;RAPD;Identifiatin絞股藍Gynsteapentaphyllu，(Thunb)akin系葫蘆科絞股藍屬多年生攀緣草質(zhì)藤本植物。絞股藍具有較普及的生態(tài)順應性，天然漫衍于秦嶺及長江以南的15個省區(qū)。絞股藍全草入藥，有清熱解毒、鎮(zhèn)咳祛痰、抗癌、落血脂、防朽邁、抗疲憊等成效，臨床上應用于老年慢性支氣管炎、哮喘、胃腸炎和感染性肝炎等疾病的治療。從絞股藍屬植物中分散出的84種皂苷中有6種與人參皂苷的四環(huán)三萜達瑪烷型布局完全雷同，以是有“南邊人參的美譽。RAPDrandaplifiedplyrphiDNA技能是1990年由illias和elsh兩個研究小組同時生長起來的一項DNA多態(tài)檢

3、測技能。RAPD具有不必要利用同位素、無需知道基因組DNA序列信息、操縱歷程輕便、快速等良好性，它是浩繁分子標識表記標幟中應用最廣的一種1，2，在動植物的遺傳多樣性檢測、品系斷定、遺傳圖譜構建和體系學研究等范疇已得到了普及的應用3，4。本實行通過探究影響RAPD擴增的幾個重要因素，尋出最優(yōu)擴增條件，試圖在DNA程度上構建絞股藍的分子標識表記標幟，為絞股藍種類區(qū)分及與其易混品烏蘞莓的區(qū)別提供理論根據(jù)，也為更好地利用絞股藍這一藥用植物提供幫助。1東西1.1質(zhì)料絞股藍GynsteaPentaphyllu，(Thunb)akin和烏蘞莓a(chǎn)yratiajapnia(Thunb)Gagn由廣西藥用植物園凌

4、征柱傳授提供；煙草Tba由中國科學院上海植物生理生態(tài)研究所提供。因絞股藍掌狀葉片常有五枚小葉，本文中稱為五葉絞股藍；別的，網(wǎng)羅了另一種掌狀葉片均為七枚小葉的絞股藍，本文中稱為七葉絞股藍，其種類待斷定。1.2儀器電泳儀DYY-10型，北京六一儀器廠；SartspeTplus核酸卵白測定儀Bi-RADLab，In，USA.；yylerTPR儀(Bi-RADLab,In，USA.)；UVI-7600Z凝膠成像體系。1.3試劑TAB，BSA牛血明凈卵白，瓊脂糖，10堿基引物均購自上海生工生物工程；Taq酶，dNTP，gl2均購自寶生物工程大連。2要領2.1基因組DNA的提取接納TAB法，參照陳莉等5要

5、領加以革新。詳細操縱：奇怪葉片液氮中留宿，加液氮舉行研磨至細粉末狀后，敏捷轉(zhuǎn)入離心管中；加65預熱1.5TAB提取緩沖液1.5%TAB，75l/LTris-H1(pH8.0)，15l/LEDTA(pH8.0)，1.05l/LNal混勻，65水浴20in；取出冷卻至室溫，6200r/in離心10in。網(wǎng)絡上清液，加等體積的氯仿異戊醇241混勻，6200r/in離心10in。再網(wǎng)絡上清液，加1/10體積1TAB提取緩沖液1%TAB，0.7l/LNal及等體積氯仿異戊醇241混勻，6200r/in離心10in；重復1次。上清液參加等體積1TAB沉淀緩沖液1.0%TAB，50l/LTris-H1(pH

6、8.0)，10l/LEDTA(pH8.0)混勻，65水浴30in。冷卻至室溫，6200r/in離心10in。棄上清液，加0.5l1l/LNal，沉淀完全溶解后加2.5倍體積預冷無水乙醇，混勻。-20下靜置15in，5200r/in離心5in。棄上清液，加70%乙醇漂洗沉淀2次，沉淀天然揮干。末了加300l滅菌dddH2或TE含10l/LTris-Hl，1l/LEDTA，pH8.3，溶解后作為母液DNA于-20下儲存。各取基因組DNA母液5l在1.5%瓊脂糖凝膠上，100v恒壓電泳15in，查驗可否得到DNA。將DNA母液取出10l稀釋11倍后，用核酸卵白測定儀測波長260n，280n處吸光值，

7、直接從儀器主屏上讀出被測樣品A260，A280，A260/A280和DNA含量，以確定提取總DNA的純度及濃度。末了將DNA母液稀釋為60ng/l擺布的事情液分裝成小包裝于-20儲存或4保存?zhèn)溆谩?.2PR擴增及電泳檢測反響在PR擴增儀上舉行，利用25l反響體系，其身分為：10Buffer2.5l，25l/Lg2+2l，2.5l/LdNTP2l，10l/L10堿基隨機引物各1l，TaqDNA聚合酶1U，模板DNA60ng擺布。反響步伐：預變性943in；擴增步伐：9430s，3830s，7280s，40個循環(huán)；然后72增補延伸10in，4保存。取擴增產(chǎn)物7l在1.5%瓊脂糖凝膠上，100v恒壓

8、電泳20in，電泳竣事后在UVI-7600Z凝膠成像體系上不雅察并照像。3結(jié)果3.1植物基因組DNA提取要領的革新由于差異藥用植物所含的身分及其次生代謝物不盡雷同，在提取DNA時，當前還沒有同一要領實用于全部植物DNA的提齲本實行應用革新TAB法，樂成提取了七葉絞股藍、五葉絞股藍及煙草葉片基因組DNA，而對烏蘞莓提取時由于上清液黏稠且顏色深，故再行革新：研磨時加必然量PVP，破膜前，先用不含TAB緩沖液把核外的多酚、多糖等雜質(zhì)撤除，同時加-巰基乙醇終濃度為2%及少量活性炭，別的步調(diào)與要領中所述的操縱同等。終極樂成提取了這4蒔植物的基因組DNA。3.2植物基因組DNA瓊脂糖電泳、DNA純度及含量

9、檢測結(jié)果接納革新TAB法所提的DNA顏色均為透明的白色、干后無色，說明質(zhì)量較好。由圖1可見，七葉絞股藍、五葉絞股藍、烏蘞莓及煙草葉片DNA在點樣孔四周均有一條亮且會合的條帶，說明DNA未落解；亮帶前面的條帶經(jīng)RNase處置懲罰后不再存在，可用于RAPD擴增。經(jīng)核酸卵白測定儀測A260，A280。由表1可看出，A260和A280比值在1.8461.905之間，DNA濃度在89419g/l之間，產(chǎn)率在197.1921.8g/g之間。表1基因組DNA純度及含量檢測略3.3RAPD擴增條件探究變性溫度和延伸溫度一樣平常別離為94和72，本實行起首將這兩個溫度確定下來，按照要領中所述的反響體系和擴增步伐

10、，僅改變退火溫度，別離為38，40，45，用挑選來的一組引物對七葉絞股藍、五葉絞股藍舉行擴增。由圖2可見，45時擴增條帶最少，38和40時擴增出來的條帶相似，且重復性均較好，但由于所選的10堿基引物T均在36.9041.00之間，更低溫度對擴增有利，而當在40以上會按捺PR產(chǎn)物2，條帶淘汰，以是確定38為本實行終極的退火溫度。PR反響中的緩沖液是一個緊張的影響因素，特殊是此中的g2+能影響反響的特異性和擴增片斷的產(chǎn)率6。本實行方案了一系列g2+濃度，別離為1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0l/L，按照要領中所述的反響體系和擴增步伐，對七葉絞股藍舉行擴增。由圖3可見，當g2+濃度為2

11、.54.0l/L之間范疇時，雖此中大部門濃度下擴增條帶均清楚，但得到的條帶顯著比g2+濃度為1.5l/L或2.0l/L時少；而2.0l/L擴增條帶清楚，1.5l/L擴增條帶多但較為模糊，故確定2.0l/L為本實行RAPD擴增的最適g2+濃度。對植物舉行RAPD擴增時，先創(chuàng)立不變的反響體系，有助于RAPD結(jié)果的可靠性與重復性。在符合的擴增條件下，為了得到更抱負的實行結(jié)果，有研究報道7在RAPD反響身分中添加酶庇護劑，如BSA。本實行在反響體系中添加了一系列差異濃度BSA，別離為0，0.5，1，2，3，4，5g/l，且設立空缺比較即不加模板，可使RAPD擴增片斷顯著增長，差異BSA用量對擴增影響的

12、結(jié)果見圖47。差異濃度的BSA對這4蒔植物RAPD擴增的影響不盡雷同。在七葉絞股藍、五葉絞股藍擴增體系中，BSA濃度為1g/l對RAPD擴增結(jié)果的改進最顯著。當BSA濃度小于1g/l時條帶有但亮度略弱，且部門弱帶擴增不敷；當濃度在14g/l范疇內(nèi)對擴增結(jié)果影響不大；當BSA濃度變?yōu)?g/l時，擴增條帶的亮度顯著削弱，條帶亦見淘汰。在烏蘞莓擴增體系中，未加BSA時RAPD無顯著擴增，當BSA濃度為0.5g/l時擴增結(jié)果有所改進但條帶少且模糊；當BSA濃度為1，2g/l時對擴增結(jié)果最好，條帶多且清楚；當在35g/l范疇內(nèi)，擴增條帶的亮度顯著削弱且條帶淘汰、模糊。本實行BSA的濃度變革范疇與文獻中應

13、用的BSA濃度相差不大，如邊才苗等7在水杉RAPD擴增中應用0.6g/l就可到達最正確擴增結(jié)果，而在七子花中BSA濃度至少需到達1g/l才可得到最正確的結(jié)果。外洋也有文獻報道8以0.25g/l為最適濃度。我們確定用濃度3g/l，由于當濃度3g/l時創(chuàng)造RAPD產(chǎn)物呈乳白色，溶液有差異程度的污濁，對電泳的加樣有顯著的影響，且電泳后不雅察，加樣孔處出現(xiàn)較亮的熒光，因此在植物RAPD反響體系中添加BSA的最適濃度必要顛末探究才可確定。4討論要舉行植物DNA的提取，一樣平常先將樣品置于液氮中留宿，然后在液氮中研磨，使樣品易于充實研磨，可進步DNA提取率，便利后續(xù)事情。本實行接納革新TAB法對七葉絞股藍

14、、五葉絞股藍及煙草的基因組DNA舉行提取，得到了質(zhì)量較好的DNA；由于烏蘞莓DNA大概含更多的多糖和多酚類雜質(zhì)，不適實用該革新要領，再行革新才氣提取到質(zhì)量較好的DNA。由于植物身分的龐大性及多變性，當前還沒有那種提取要領對全部植物均實用。因此對某一種屬或某一蒔植物來說，探究出符合的提取要領是必不成少的。從實行結(jié)果看，退火溫度在必然的范疇內(nèi)(25)變更，對RAPD擴增影響不是很大，這與illias2得出的結(jié)論一樣等。如擴增反響對退火溫度要求在某一溫度，說明擴增條件還沒有到達優(yōu)化，必要進一步改進，不然實行結(jié)果照舊不不變的。因此，在優(yōu)化RAPD擴增條件歷程中，應盡大概尋出種種條件對RAPD擴增產(chǎn)生不

15、良影響的凹凸變數(shù)9。g2+是TaqDNA聚合酶實現(xiàn)其聚合反響所必須的，且影響反響的特異性和擴增服從。本實行探究得到的g2+最正確濃度為2.0l/L，與文獻報道的終濃度1.52.0l/L6是一樣等的。所確定的濃度雖僅在七葉絞股藍中探究，但應用于別的3蒔植物也能得到較好的擴增結(jié)果。由于經(jīng)抽提純化的植物DNA中還含有必然量的雜質(zhì)，如多糖、多酚類化合物等，每每會影響PR擴增反響。添加適量的BSA可以關閉這種影響8，同時添加BSA還可以低落Taq酶的用量7。因此在植物RAPD擴增中，添加BSA是一種既經(jīng)濟又有用的幫助方法。本實行從差異濃度的BSA對4蒔植物RAPD擴增反響的差異影響，可看出BSA在必然范疇內(nèi)是可以改進RAPD擴增結(jié)果的，但參加的用量應按照差異植物而作得當調(diào)解。5結(jié)論通過對絞股藍及其易混品烏蘞莓，用革新的TAB法提取DNA，均可用于RAPD的擴增。對RAPD擴增的重要條件舉行了探究，終極確定了RAPD擴增七葉絞股藍、五葉絞股藍及烏蘞