第四章 胚胎(共15頁)

1、第四章 胚胎，花藥(huyo)和花粉培養(yǎng)胚胎(piti)培養(yǎng)：是指將種胚及其相關器官或組織（子房、胚珠、胚乳）進行離體培養(yǎng)，使其發(fā)育成完整(wnzhng)植株的技術。包括幼胚培養(yǎng)、成熟胚培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)、子房培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)等 背景Hanning and Laibach 建立了合子胚培養(yǎng)技術20世紀20年代建立了幼胚培養(yǎng)和胚胎拯救技術1934 清華的李繼侗和沈同發(fā)現銀杏gingko胚乳提取物可刺激離體胚生長1940 La Rue 最先培養(yǎng)胚乳1941 Van Overbeek 發(fā)現椰乳對幼胚發(fā)育的促進作用之后胚胎培養(yǎng)技術逐漸成熟，1970 Bhojwani 白花寄生獲得胚乳植株第一節(jié) 胚胎培養(yǎng)一

2、胚培養(yǎng)1. 胚培養(yǎng)的用途1)克服遠緣雜種的不育性: 在高等植物的種間和屬間雜交后代胚敗育，胚發(fā)育不全而不能正常萌發(fā)，因而得不到雜種種子，用胚胎培養(yǎng)和試管受精技術就可以解決這些問題。2) 克服了種子休眠和種子自交(z jio)不育性，使胚發(fā)育不全的植物(zhw)獲得后代。如在種子接近成熟時，把胚分離出來進行培養(yǎng)，就能生長發(fā)育成正常植物。3）胚的拯救(zhngji)： 遠交的種胚常因胚乳發(fā)育不良而敗育，敗育前培養(yǎng)可得植株；早熟、生活力低的種子亦然。 4) 縮短育種年限 在雜交育種中，應用胚培養(yǎng)技術可以縮短育種周期12年。5）獲得單倍體植株遠緣雜交結合胚培養(yǎng)，是獲得單倍體的有效途徑之一。6）誘導胚狀

3、體用幼胚或其他胚胎組織進行培養(yǎng)，可獲得大量胚性愈傷和胚狀體。7）胚胎發(fā)育研究。8）種子生活力的快速測定：未后熟和經后熟的種胚在離體培養(yǎng)下萌發(fā)速率一致。用于休眠期長的植物。2、 內容：包括胚胎發(fā)育不同時期的胚，一般分為未成熟胚（子葉期前）和成熟胚（子葉期后）的培養(yǎng)。成熟胚培養(yǎng)較易，在含大量元素和糖的培養(yǎng)基上就能培養(yǎng)成苗。未成熟胚培養(yǎng)較難，需提供必需的營養(yǎng)和條件。3. 胚培養(yǎng)的技術3.1 成熟(chngsh)胚方法(fngf)：種子(zhng zi)表面消毒無菌水沖洗剝胚接種于簡單培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：具休眠習性者，4 處理后轉入常溫培養(yǎng)25度；12 h左右光照。3.2 幼 胚方法：胚珠表面消毒解

4、剖鏡下剝胚（帶胚柄）接種培養(yǎng)。培養(yǎng)基：成熟胚對培養(yǎng)基要求不高，而幼胚要求較高，MS，B5，Nitsch培養(yǎng)基，其他適于未成熟胚和幼胚培養(yǎng)。幼胚需要較高的蔗糖濃度，以提供較高的滲透壓，但由于幼胚在自然條件下賴以生存的是無定形的液體胚乳，并具有較高的滲透壓，所以人工培養(yǎng)基中要創(chuàng)造高滲透壓的條件，使它可以調節(jié)胚的生長，阻止可能滲透壓的影響，并能抑制中早熟萌發(fā)中的細胞延長，以及抑制胚的萌發(fā)，避免把細胞的伸長狀態(tài)轉化為分裂狀態(tài)。Nitch、MS、B5 培養(yǎng)基；胚乳看護培養(yǎng)：培養(yǎng)基中加同種/相近種的胚乳。高濃度蔗糖（812%）：模擬胚乳高滲環(huán)境；適量的激素：GA3、 IAA等，刺激幼胚發(fā)育。溫度：對于大多

5、數植物的胚來說，在2530為宜。光暗交替培養(yǎng)較為有利。4. 離體胚發(fā)育(fy)途徑1) 一種是繼續(xù)進行正常(zhngchng)的胚胎發(fā)育，維持“胚性生長(shngzhng)”；2）另一種是在培養(yǎng)后迅速萌發(fā)成幼苗，而不繼續(xù)進行胚性生長，通常稱為 “早熟萌發(fā)”；指幼胚在離體培養(yǎng)條件下，越過正常胚胎發(fā)育階段，在未達到生理和形態(tài)成熟的情況下，萌發(fā)長成幼苗的現象。越過某一發(fā)育時期，如子葉形期而提早萌發(fā)，苗瘦弱，常死亡。措施：增加培養(yǎng)基中糖和無機鹽的濃度，提高培養(yǎng)基滲透壓。添加 ABA；高溫、強光照下培養(yǎng)。3）第三種是在很多情況下，胚在培養(yǎng)基中能發(fā)生細胞增殖形成愈傷組織，并由此再分化形成多個胚狀體或芽原基

6、。特別是進行生長調節(jié)時，就更為如此。培養(yǎng)基成分不適宜，如激素濃度較高，幼胚（較多胚性）愈傷再生植株。二、胚珠培養(yǎng)將受精或未受精胚珠進行離體培養(yǎng)。1. 胚珠培養(yǎng)的用途1）成熟胚小或幼胚培養(yǎng)難成活時，用受精胚珠培養(yǎng)。1958，Maheshwar，授粉5d 的罌粟胚珠（合子或2細胞原胚）培養(yǎng)得到種子。2）未受精胚珠培養(yǎng)可誘發(fā)大孢子發(fā)育成單倍體植株，克服花粉(hufn)單倍體植株白化苗問題。1980開始，非洲菊、煙草、甜菜(tinci)、柑橘等成功。3）未受精胚珠培養(yǎng)(piyng)可為離體受精提供雌配子體。2. 胚珠培養(yǎng)技術花蕾取子房滅菌無菌水沖洗 取胚珠接種培養(yǎng)。有時，連同胎座或用子房進行培養(yǎng)。3.

7、 影響胚珠培養(yǎng)的主要因素1）胚囊發(fā)育時期：是關鍵，水稻未受精胚珠培養(yǎng)單核四核期較好。2）胎座和子房：提供營養(yǎng)和激素。3）培養(yǎng)基：常用Nistch，MS、N6、B5也可。三、胚乳（endosperm）培養(yǎng)胚乳：被子植物雙受精產物，三倍體；大多數植物隨胚的發(fā)育，胚乳常被耗盡（豆科、葫蘆科）。在胚乳培養(yǎng)中，除少數寄生或半寄生植物可以直接從胚乳分化器官以外，絕大多數被子植物的胚乳，無論成熟還是未成熟，都要先經歷愈傷組織階段，然后才能分化出植株。1. 胚乳培養(yǎng)的用途1）獲得三倍體：無籽西瓜、香蕉、甜菜、楊樹等，重要經濟價值。2）獲得非整倍體：如三體，遺傳研究和育種材料。3）獲得同源(tn yun)六倍體

8、：將胚乳三倍體加倍。4）理論研究系統(tǒng)(xtng)：均質薄壁細胞，研究淀粉、蛋白、脂類等生物合成代謝。 2. 胚乳培養(yǎng)(piyng)技術取授粉后412 d 的幼果常規(guī)消毒切開果實、取種子 剝取/分離胚乳 接種暗培養(yǎng)愈傷組織分化培養(yǎng) 器官或體胚途徑再生植株。3. 影響胚乳培養(yǎng)的主要因素1） 胚乳發(fā)育時期 受精胚乳核 游離核型期 細胞型期（有壁）。取細胞型期、旺長的胚乳易成功（胚已分化），半透明固體狀、有彈性；大戟科等木本植物，成熟胚乳也可。2）培養(yǎng)基成分常用White, LS, MS等;添加CH等有機物和激素：可促進愈傷形成。3）胚因子的影響幼胚乳帶胚易成功；成熟胚乳常不能脫分化，需先進行“原位胚

9、”萌發(fā)使其活化，借助“胚因子”才能形成愈傷。GA3可部分代替胚因子的作用。四、離體授粉（in vitro pollination）在人工控制條件下，使離體的胚珠、子房、胎座或雌蕊等完成授粉、受精(shu jng)，形成種子的過程。包括雌蕊/子房離體受精和胚珠試管受精。1. 離體授粉(shufn)的意義1）克服(kf)遠緣雜交的不親和性受精前不親和：花粉不能萌發(fā)；花粉管不能進入胚珠；花粉管在花柱中破裂。2）克服自交不親和性自交不親和：花粉不能萌發(fā)；花粉管不能長入子房。3）誘導孤雌生殖用異源花粉授粉，誘導卵細胞、助細胞和反足細胞等產生單倍體。4）植物受精機制和生理研究。2. 離體授粉技術1）雌性外

10、植體的培養(yǎng)：取花蕾 去花瓣、花萼等 表面消毒剝取雌蕊、胚珠或子房等 接種培養(yǎng)。2）花粉的滅菌：取花藥 收集花粉 表面消毒。3）離體授粉：將無菌的花粉授于培養(yǎng)的胚珠、子房、胎座等。方法：將花粉粒直接撒于胚珠；用花粉懸液注射或滴加于子房；將花粉授于培養(yǎng)的雌蕊柱頭等。3. 影響離體授粉的因素1）雌性(c xn)外植體發(fā)育階段：雌性外植體成熟度與培養(yǎng)(piyng)成活率一般呈正相關。2）花粉(hufn)萌發(fā)力：用鈣、硼、蔗糖等對花粉進行預處理，提高萌發(fā)率。3）母體組織的影響：保留胎座、花柱等組織，并提供相關因子，可提高成功率和結實率。4）培養(yǎng)基：添加CH、增加蔗糖和B族維生素等，利于胚珠培養(yǎng)或促進花粉

11、萌發(fā)和花粉管生長。第二節(jié) 花藥和花粉培養(yǎng)花藥和花粉培養(yǎng)實際上都是通過培養(yǎng)小孢子獲得單倍體再生植株。一. 培養(yǎng)條件下小孢子的發(fā)育1. 自然條件下小孢子的發(fā)育未分化花藥孢原組織造孢組織小孢子母細胞四分孢子小孢子（單核早期 單核靠邊期） 雙核期（1個營養(yǎng)核+1個生殖核）成熟三核花粉（1個營養(yǎng)核+2個生殖核）。小孢子只進行2次分裂！從小孢子母細胞四分孢子，為孢子體；從單核小孢子成熟三核花粉，為配子體2 培養(yǎng)條件下小孢子的發(fā)育 小孢子第二次分裂偏離正常途徑，四種情況：1）營養(yǎng)細胞發(fā)育(fy)途徑；2）生殖細胞發(fā)育(fy)途徑；3）營養(yǎng)(yngyng)細胞和生殖細胞并進發(fā)育途徑；4）均等分裂途徑。無論哪種

12、，花藥單倍體愈傷/胚狀體破藥壁單倍體植株。二. 花藥培養(yǎng)花藥培養(yǎng)：指將花粉發(fā)育到一定階段的完整花藥接種到培養(yǎng)基上，誘導小孢子經孢子體途徑形成單倍體再生植株的技術，又稱雄核發(fā)育(androgenesis)。1 花藥培養(yǎng)技術流程選花蕾表面消毒取花藥+花絲鏡檢發(fā)育時期（醋酸洋紅） 從花絲上摘花藥接種培養(yǎng)。2 花藥培養(yǎng)再生途經1）間接雄核發(fā)育：小孢子分裂產生愈傷，再經器官或胚狀體發(fā)生途徑形成小植株。2）直接雄核發(fā)育：煙草、曼陀羅等少數植物，小孢子直接分化成胚狀體/花粉胚，待一定大小時為促進發(fā)育，移到生根培養(yǎng)基上形成小植株。3 影響花藥培養(yǎng)的因素 1）基因型：重要因素。 2）供體植株生長條件：控制條件下

13、生長，便于根據花蕾或花藥長度等判斷花粉發(fā)育時期。3）供體植株(zhzh)的年齡：一般，幼年植株(zhzh)優(yōu)于老年植株，開花初期優(yōu)于開花后期。4）花粉發(fā)育(fy)時期：一般從單核早期到雙核早期，進入二核期后發(fā)育方向預定，再作改變難度較大。5）花蕾和花藥的預處理：低溫：413，也可在接種后進行；熱激：高于常溫約5 ；饑餓：無糖或無氨基酸培養(yǎng)基；射線照射;秋水仙素、脫落酸、高低滲等。幾十幾天; 上述因子的結合可能更有效。目的: 誘導小孢子胚胎發(fā)生，促進花粉胚形成。機理: 可能調節(jié)細胞周期，改變細胞分化發(fā)育方向。6）培養(yǎng)基：MS、N6。蔗糖: 必須，且濃度較高。激素: 關鍵，如2,4-D在花粉愈傷和

14、胚誘導時必須，但在分化和發(fā)育時應降除。需經預實驗確定。有機物、pH: 有些植物有一定要求?；钚蕴浚嚎商岣邿煵?、玉米等單倍體誘導率。7）培養(yǎng)條件：有些植物接種后經一定的低溫或高溫處理，可提高誘導率；一般在愈傷或花粉胚誘導階段暗培養(yǎng)，分化(fnhu)階段光照培養(yǎng)。 4 單倍體植株(zhzh)的加倍單倍體植株矮小(ixio)瘦弱、高度不育，須進行加倍。誘導劑：1）秋水仙素：微管聚合抑制劑，注意時間和劑量。可在培養(yǎng)的任何時期加倍，如在培養(yǎng)基中添加、浸苗、涂抹莖芽生長點等。是誘變劑，時間過長易出現混倍體和嵌合體，并引起變異。2）氟樂靈: 微管聚合抑制劑，比秋水仙素藥效大。三. 花粉培養(yǎng)花粉培養(yǎng)：將離體的

15、花粉粒接種到培養(yǎng)基上，誘導形成單倍體再生植株的技術?；ǚ鄣亩托裕╬ollon dimorphism）：在自然或離體培養(yǎng)條件下，同一花藥中存在大、小2種類型花粉粒，通常小花粉/S-花粉在適宜培養(yǎng)條件下會發(fā)育成胚狀體，而大花粉為非胚性，朝成熟花粉方向發(fā)展，此現象即。S-花粉又稱胚性花粉, 即E-花粉。早期鏡檢發(fā)現：1 花粉與花藥培養(yǎng)的比較1）異同點：（1）培養(yǎng)目的相同，均獲得小孢子植株。（2）外植體不同，花藥（器官）與花粉(hufn)（細胞），花藥培養(yǎng)屬于器官培養(yǎng)；而花粉培養(yǎng)屬于細胞培養(yǎng)。（3）單倍體起源(qyun)的本質同，（4）花粉(hufn)比花藥培養(yǎng)技術難度大。2）花粉培養(yǎng)的優(yōu)勢：（1）

16、花藥中有害物質會影響小孢子的第一次分裂，花粉培養(yǎng)不存在此問題。（2）花粉植株都是單倍體，不含由藥壁、花絲等誘導的體細胞植株。（3）花粉是研究發(fā)育、吸收、遺傳、轉化和誘變的理想材料。花粉培養(yǎng)的優(yōu)勢：2 花粉的分離與培養(yǎng)2.1 分離花粉的方法1）自然釋放法：花蕾消毒花藥接種于液體或固體培養(yǎng)基花粉釋放去藥壁。2）研磨過濾收集法：花蕾消毒培養(yǎng)基/分離液里研磨篩網過濾離心收集洗滌接種。3）剖裂/擠壓釋放法：用工具剖裂或用玻棒、注射器活塞擠壓花藥（在液體培養(yǎng)基中）釋放花粉培養(yǎng)。2.2 花粉培養(yǎng)技術 1）液體(yt)淺層培養(yǎng)：用液體培養(yǎng)基將小孢子(boz)配成懸液，取少許在培養(yǎng)皿中形成一薄層，待愈傷或胚狀體

17、形成后再轉移到分化或發(fā)育培養(yǎng)基上。2）固體(gt)平板培養(yǎng)。3）看護培養(yǎng)：花藥上放濾紙，濾紙上放花粉。4）微室懸滴培養(yǎng)：制備花粉懸滴，即每個皿滴幾滴花粉液，將皿倒置培養(yǎng)，便于觀察。5）條件培養(yǎng)：培養(yǎng)花藥（幾天）沸水殺死研碎離心取上清加入培養(yǎng)基接種花粉。提取液中有促進發(fā)育因子。花粉培養(yǎng)的植板率：形成愈傷/胚狀體的花粉數占培養(yǎng)的花粉總數的百分比（%），即為。四. 小孢子單倍體誘導的分子機制研究目的：克隆特異/相關基因，進行遺傳操作和控制。油菜、小麥、煙草等，已鑒定、分離出一些基因。初步結果：一些為花粉萌發(fā)和受精所必須的花粉特異性基因的下調表達與孤雄生殖的誘導有關，所以關閉或抑制這些基因的表達應是遺

18、傳操作的目標。五. 花培中存在的問題1 禾本科的白化苗現象禾本科花藥和花粉培養(yǎng)中白化苗達1030%，甚至更高。影響白化苗形成的因素：1）基因型和花粉(hufn)發(fā)育時期；2）高溫、高濃度2,4-D、分化培養(yǎng)不及時(jsh)：增加白化苗。3）低溫處理：隨植物而異，水稻長時間低溫處理增加白化苗，大麥(dmi)相反。白化苗產生機理：不清楚。質體基因組變異、花粉染色體畸變、花粉有絲分裂中質體不能分化并降解，均可能誘發(fā)白化苗。預防對策：花藥預處理、調整激素種類和配比、及時進行分化培養(yǎng)等，誘導胚狀體發(fā)生是關鍵。5.2 普遍問題1）誘導率較低且不穩(wěn)定：2）得到混倍體：有單倍體、二倍體、四倍體等。由于單倍體生長弱，易被掩蓋和淘汰。3）單倍體加倍并不總是能產生純合體，加倍的雙單倍體有時出現后代分離。第三節(jié) 單倍體及其應用單倍體(haploid)：指具有配子染色體數的個體或組織，即體細胞染色體數為n。1）一倍單倍體：源于二倍體（2X）；2）多倍單倍體：源于多倍體（4 X、6X）。雙單倍體 (Double Haploid, DH）：由單倍體加倍后形成，也稱DH系、DH群體。 1. 單倍體的起源及其遺傳(ychun)行為 1