NightOWL在活體生物發(fā)光成像中的原理和應(yīng)用教學(xué)教材

1、age PAGE 8 of NUMPAGES 8NightOWL LB 983在活體生物發(fā)光成像中的應(yīng)用第一部分 儀器介紹德國(guó)Berthold Technologies公司生產(chǎn)的NightOWL LB 983是作為一種開(kāi)放性實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)構(gòu)架的活體生物發(fā)光和熒光成像系統(tǒng)，它不僅是一臺(tái)儀器，更通過(guò)其開(kāi)放性設(shè)計(jì)思路，多種實(shí)驗(yàn)預(yù)留端口及針對(duì)性實(shí)驗(yàn)配件的組合應(yīng)用，使儀器超越了普通封閉式儀器應(yīng)用上局限性，給科研人員帶來(lái)更大的使用價(jià)值。該儀器秉承生物發(fā)光與熒光檢測(cè)并重的設(shè)計(jì)理念，在生物發(fā)光檢測(cè)上具有最高的靈敏度，對(duì)于局部檢測(cè)能獲得良好的圖像。具體表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：精確的定量研究該系統(tǒng)采用多種計(jì)數(shù)方式供選擇

2、，儀器量化檢測(cè)到的光強(qiáng)度，同時(shí)反映出細(xì)胞的數(shù)量，在相同的深度情況下，腫瘤細(xì)胞數(shù)與發(fā)光值成線性關(guān)系。極高的靈敏度小鼠皮下總計(jì)1000個(gè) 細(xì)胞或每mm 20個(gè)細(xì)胞可以很容易地被檢測(cè)到，探測(cè)極限是一叢150 250個(gè)細(xì)胞。在微孔細(xì)胞板中少到10 個(gè)細(xì)胞可以檢測(cè)到。當(dāng)然，由于發(fā)光源在老鼠體內(nèi)深度的不同可看到的最少細(xì)胞數(shù)是不同的。 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)與體外實(shí)驗(yàn)的一致性通過(guò)活體成像技術(shù)測(cè)得的結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果高度一致。靈活的視野選擇可自動(dòng)化升降、對(duì)焦的相機(jī)，相機(jī)位置根據(jù)樣本的厚度、檢測(cè)部位的數(shù)據(jù)自動(dòng)校對(duì)、定位。樣本位置保持固定檢測(cè)視野大小可實(shí)現(xiàn)3.5 x 3.5 cm 26 x 26 cm相機(jī)的工作距離(相機(jī)與樣

3、本之間的距離) 35750 mm，更準(zhǔn)確接收光子信號(hào)樣本拍照更符合照相習(xí)慣工作距離750 mm工作距離35 mm可選擇升級(jí)到3D成像通過(guò)在成像動(dòng)物的左右兩側(cè)放置鏡子，獲得三維深度信息?？梢詼y(cè)量光源的長(zhǎng)、寬和深度，從而計(jì)算體積（ r2 = 0.89）。 麻醉小鼠單獨(dú)控制開(kāi)關(guān)，避免了麻醉氣體的泄露 暗箱具有法蘭接口使儀器內(nèi)部可以通入液體、氣體等物質(zhì)，成為暗箱內(nèi)外通路。如圖：利用法蘭向暗室內(nèi)通入溫度恒定的循環(huán)水，可以檢測(cè)魚(yú)類(lèi)等。 第二部分 應(yīng)用介紹腫瘤學(xué)長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)檢測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)，并可建立相應(yīng)的動(dòng)物模型進(jìn)行抗腫瘤藥物的篩選（下圖是長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)檢測(cè)MIA-PaCa-2 腫瘤的生長(zhǎng)曲線）。上海市科委2007年便

4、支持了上海市腫瘤研究所建立3-5種發(fā)光腫瘤模型，用于藥物的篩選。腫瘤轉(zhuǎn)移由于活體成像技術(shù)直觀、靈敏度高的特點(diǎn)，該技術(shù)將成為研究腫瘤轉(zhuǎn)移的有力手段。下左圖是前列腺癌PC3骨轉(zhuǎn)移的成像，下右圖是RENCA 腫瘤的肺轉(zhuǎn)移成像。中山醫(yī)院肝癌所的科研人員正在積極應(yīng)用該技術(shù)用于肝癌轉(zhuǎn)移的機(jī)理研究。 基因治療研究關(guān)于基因治療應(yīng)用該技術(shù)可以從兩個(gè)方面來(lái)考慮，標(biāo)記病毒或腫瘤細(xì)胞。交通大學(xué)第一人民醫(yī)院的專(zhuān)家應(yīng)用熒光素酶基因標(biāo)記的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤成像，來(lái)觀察基因治療的治療效果。他們把熒光素酶基因標(biāo)記的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤注射到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的玻璃體下。左側(cè)小鼠，熒光素用量2mg，右側(cè)小鼠熒光素用量300ug，細(xì)胞數(shù)2*105，接

5、種后2個(gè)星期檢測(cè)，成像時(shí)間2分鐘。 受體活性的研究通過(guò)雌激素受體標(biāo)記的報(bào)告基因小鼠，觀察無(wú)雌激素食品對(duì)小鼠雌激素受體表達(dá)的影響。CD46是rAd35 的受體，野生型的小鼠沒(méi)有CD46，所以構(gòu)建了CD46轉(zhuǎn)基因（MYII）小鼠。 CD46轉(zhuǎn)基因（MYII）小鼠對(duì)于評(píng)價(jià)rAd35 vectors的潛力和安全性是一個(gè)有意義的動(dòng)物模型。 注射1*1011 vp rAd35后分別成像。流行病學(xué)多種病毒，腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒、乙肝病毒等都可被熒光素酶標(biāo)記，用于觀察病毒對(duì)機(jī)體的侵染過(guò)程。下圖是溶瘤病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的感染和復(fù)制?？梢杂脴?biāo)記好的革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌侵染活體動(dòng)物, 觀測(cè)其在動(dòng)物體內(nèi)的繁殖部位

6、、數(shù)量變化及對(duì)外界因素的反應(yīng)。藥物研究藥物誘導(dǎo)的IL-1基因表達(dá)上海南方模式動(dòng)物中心的科研人員用熒光素酶基因標(biāo)記IL-1 基因 ，形成轉(zhuǎn)基因小鼠，IL-1 基因與熒光素酶基因平行表達(dá)。通過(guò)構(gòu)建這樣的平臺(tái)，來(lái)篩選對(duì)炎癥有關(guān)的治療藥物，將是中醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用活體動(dòng)物光學(xué)成像技術(shù)的先驅(qū)，將極大的促進(jìn)中醫(yī)藥研究方法學(xué)的發(fā)展。我們會(huì)根據(jù)市場(chǎng)的需要開(kāi)發(fā)一批轉(zhuǎn)基因小鼠用來(lái)促進(jìn)活體成像技術(shù)與藥物開(kāi)發(fā)的應(yīng)用，促進(jìn)功能基因組學(xué)的發(fā)展。 藥物篩選（標(biāo)記PPARs基因的轉(zhuǎn)基因小鼠的藥物篩選）為研究目的基因是在何時(shí)、何種刺激下表達(dá)，將熒光素酶基因插入目的基因啟動(dòng)子的下游，并穩(wěn)定整合于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染色體中，形成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。利

7、用其表達(dá)產(chǎn)生的熒光素酶與底物作用產(chǎn)生生物發(fā)光，反應(yīng)目的基因的表達(dá)情況，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的研究?？商峁┌谢蛟隗w內(nèi)的實(shí)時(shí)表達(dá)和對(duì)候選藥物的準(zhǔn)確反應(yīng)，還可以用來(lái)評(píng)估候選藥物和其它化合物的毒性。為藥物在疾病中的作用機(jī)制及效用提供研究方法。NF-B基因表達(dá)與抗炎藥物篩選腹腔注射thioacetamide（硫代乙酰胺），造成小鼠的肝炎模型。pNF-B-Luc (firefly luciferase基因) 和pRL-SV40 (Renilla reniformis luciferase基因)通過(guò)基于流體力學(xué)的過(guò)程，經(jīng)尾部靜脈注射到小鼠肝臟。通過(guò)觀察pNF-B-Luc (firefly luciferas

8、e基因) 和pRL-SV40 (Renilla reniformis luciferase基因)表達(dá)的比值來(lái)觀察過(guò)氧化氫酶及其衍生物對(duì)NF-B基因表達(dá)的影響。 熒光素酶基因標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞在肺中的黏附交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院的科研人員，通過(guò)小鼠尾部靜脈打入熒光素酶標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞2*106個(gè)，1 小時(shí)以后觀察到肺中的黏附。附錄：生物發(fā)光的成像原理活體動(dòng)物生物發(fā)光，是將Fluc基因整合到細(xì)胞染色體DNA上以表達(dá)熒光素酶，當(dāng)外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素(luciferin)，即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。這種酶在ATP及氧氣的存在條件下，催化熒光素的氧化反應(yīng)才可以發(fā)光，因此只有在活細(xì)胞內(nèi)才會(huì)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，并且光的強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目線性相關(guān)。細(xì)胞、病毒和活體動(dòng)物都可被熒光素酶基因標(biāo)記。對(duì)于細(xì)菌，lux操縱子由編碼熒光素酶的基因和編碼熒光素酶底物合成酶的基因組成，帶有這種操縱子的細(xì)菌會(huì)持續(xù)發(fā)光，不需要外源性底物。觀測(cè)前需要注射熒光素酶的底物熒光素，為約280道爾頓的小分子。熒光素脂溶性非常好, 很容易透過(guò)血腦屏障。注射一次熒光素能保持小鼠體內(nèi)熒光素酶標(biāo)記的細(xì)胞發(fā)光30-45分鐘。每次熒光素酶催化反應(yīng)只產(chǎn)生一個(gè)光子，這是肉眼無(wú)法觀察到的，應(yīng)用一個(gè)高度靈敏的制冷CCD相機(jī)及特別設(shè)計(jì)的成像暗箱和成像軟件，可觀測(cè)并記錄到這些光子。光在哺乳動(dòng)物組織內(nèi)傳播時(shí)會(huì)被散射和吸收，光子遇到細(xì)胞