心血管實(shí)驗(yàn)病理學(xué)方法簡介課件

1、心血管實(shí)驗(yàn)病理學(xué)方法簡介主要內(nèi)容實(shí)驗(yàn)病理學(xué)的特點(diǎn)常用病理學(xué)技術(shù)與方法模式動(dòng)物的病理學(xué)評(píng)價(jià)1.0 實(shí)驗(yàn)病理學(xué)的特點(diǎn)實(shí)驗(yàn)病理的多樣性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人的差異病理學(xué)評(píng)價(jià)的特點(diǎn)1.1 實(shí)驗(yàn)病理的多樣性疾病機(jī)制研究治療藥物研究植入器械研究動(dòng)物種屬不一樣動(dòng)物數(shù)量不一樣研究重點(diǎn)不一樣1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人的差異解剖結(jié)構(gòu)差異動(dòng)物自發(fā)疾病病理反應(yīng)差異疾病易感性的差異1.3 病理學(xué)評(píng)價(jià)的特點(diǎn)不同于檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)需要研究者參與實(shí)驗(yàn)過程病理學(xué)是描述性的、解釋性的科學(xué)主觀性較強(qiáng)、必須有科學(xué)的評(píng)價(jià)方法2.0 常用病理學(xué)技術(shù)與方法常規(guī)組織學(xué)技術(shù)免疫組織化學(xué)電子顯微鏡形態(tài)定量與圖像分析2.1 常規(guī)組織學(xué)技術(shù)固定與包埋類別冰凍切片要點(diǎn)常用染

2、色方法2.1.1 常用固定劑交聯(lián)性固定劑（甲醛、戊二醛，多聚甲醛）非交聯(lián)性固定劑（酒精、甲醇、丙酮、鋨酸）單一固定劑（ 10% 福爾馬林）復(fù)方固定劑（P-L-P 固定劑）常規(guī)固定（一般形態(tài)）特殊固定劑（糖原、脂質(zhì)、嗜鉻固定）有利抗原保存固定（短時(shí)固定、PLP固定）2.1.1 固定時(shí)間固定時(shí)間（2-3mm厚、4-6h）灌注固定（10-20min）+后固定（4-6h）固定液10倍于組織或器官大?。ㄈ萜鲉栴}）“固定不足”問題（自溶、切片透明染色不良，腦及脂肪組織固定中易出現(xiàn)）“過固定”問題（抗原修復(fù)困難、福爾馬林結(jié)晶）2.1.1 包埋方法OCT包埋（冰凍切片） 抗原、GFP的保存，冰晶與組織形態(tài)石蠟

3、包埋（常規(guī)切片） 抗原性包被、GFP破壞、組織形態(tài)保存樹脂包埋（電鏡超薄切片） 超薄切片、亞細(xì)胞分辨、抗原性包被塑料包埋（超硬切片或磨片） 特殊材料制片、細(xì)胞形態(tài)與抗原性破壞2.1.2 冰凍切片優(yōu)點(diǎn)：脂質(zhì)和抗原性得到良好保存 不需抗原修復(fù) 某些抗原會(huì)因固定包埋失活用途：快速病理診斷 脂肪染色 一抗試劑的要求 多重免疫染色（熒光共定位） 精確定位和定量 2.1.2 脂肪染色H.E.Oil Red OMouse model of Atherosclerosis免疫熒光與共定位C3d Heart transplant三維重建VincuninThree-dimensional structure of

4、 the t-tubular system in a living rat ventricular myocyte, reconstructed from a stack of images of dextran-linked fluorescein fluorescence within the t-tubules. Bar5 m. Circ Res. 1999;84:2662752.1.2 冰凍切片的應(yīng)用限制缺點(diǎn)：切片質(zhì)量不及石蠟切片 抗原易移位、擴(kuò)散 自發(fā)熒光 特殊的切片和保存要求冰晶：細(xì)胞內(nèi)、外水份凍融所產(chǎn)生的對(duì)細(xì)胞膜和組織結(jié)構(gòu)破壞。冰晶的多少與組織的水分含量和凍融的次數(shù)成正比。冰凍切

5、片制作程序 1（常規(guī)研究用）小塊新鮮組織（5 mm)，直接液氮凍結(jié)、或OCT包埋后液氮凍結(jié)塑料袋或盒包裝，80保存冰凍切片（510um）風(fēng)干過夜，或至少1小時(shí)（電風(fēng)扇，室溫）冷丙酮或甲醇固定1015分鐘再風(fēng)干（電風(fēng)扇，室溫）常規(guī)染色、或密封后30冰箱保存冰凍切片制作程序 2（優(yōu)化研究用）小塊新鮮組織（5 mm)，4%多聚甲醛或PLP固定液固定4小時(shí)梯度蔗糖替代 10蔗糖/0.01M PBS 4hrsovernight （15蔗糖/0.01M PBS 4hrsovernight） 20蔗糖/0.01M PBS 4hrsovernight吸干水分、OCT包埋、液氮凍結(jié)塑料袋或盒包裝，80保存冰凍切

6、片（510um）風(fēng)干過夜（電風(fēng)扇，室溫）常規(guī)染色、或密封后30冰箱保存2.2.2 冰凍包埋的注意事項(xiàng)盡早凍存，避免自溶和抗原移位。組織宜小、薄，保證凍存效果。濾紙吸去水份，清除脂肪自制包埋盒（鋁箔）、冰凍專用塑料盒排除氣泡，撫正組織激光打印標(biāo)簽或記號(hào)筆標(biāo)記扶正組織，確定包埋面，快速凍結(jié)冰凍切片流程和用具2.1.3 常用的組織學(xué)染色H.Evan GiesonElastica van Gieson (ETVG)Masson trichromeElastic Masson Goldner modifiedPicrosirius red Movat pentachromePTAHOil Red OH.

7、E Masson 三色染色Elastica-van Gieson 染色天狼星紅染色天狼星紅染色一種敏感的膠原顯示方法利用膠原的折光特性不同而區(qū)分不同組分 I型膠原（黃紅色） III型膠原（綠色） IV型膠原（無折光）偏振光顯微鏡 線性偏振（暗背景） 環(huán)形偏振（亮背景）PTAHMovat五色套染黑色=彈力纖維 細(xì)胞核黃色=膠原纖維磚紅=肌纖維藍(lán)色=粘液鮮紅=纖維素、 紅細(xì)胞、2.2 免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫組織化學(xué)染色的特點(diǎn)抗體稀釋度計(jì)算鼠對(duì)鼠（MOM） 方法BrdU標(biāo)記與染色質(zhì)控與標(biāo)準(zhǔn)化2.2.1 免疫組織化學(xué)的特點(diǎn)較敏感的方法，且敏感度逐步提高定位優(yōu)勢，可達(dá)亞細(xì)胞水平共定位反映分子的空間關(guān)系追蹤

8、分子的動(dòng)態(tài)變化（功能免疫組化）實(shí)驗(yàn)原則 選擇合適的方法、獲得最好的結(jié)果明視野顯微鏡，便于形態(tài)學(xué)分析適合低倍率的組織學(xué)分析無熒光衰減，可永久保存顯色底物致癌性和毒性2.2.1 酶標(biāo)免疫組化的優(yōu)勢與注意點(diǎn)2.2.2 抗體稀釋度的計(jì)算 抗原抗體反應(yīng)的濃度依賴性2.2.2 抗體稀釋度的計(jì)算非特異與特異性結(jié)合的不同特點(diǎn)2.2.2 抗體稀釋度的計(jì)算影響因素抗原密度制樣對(duì)抗原影響抗體親和力染色方法的敏感度廠家建議稀釋度摸索試驗(yàn)1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600一般法則一抗工作濃度 15 mg/ml.二抗工作濃度 510 mg/ml.計(jì)算公式 X=(A

9、*B)/CA，最終工作液容量B，工作液抗體濃度C，原液抗體濃度X，需要的原液容量 2.2.3 MOM方法（二抗非特異結(jié)合問題）2.2.3 MOM方法（解決辦法）2.2.4 BrdU 標(biāo)記和染色技術(shù)特點(diǎn)Cell proliferation activity Non-radiative method標(biāo)記流程Intraperitoneal injection of BrdU 12 h before sacrifice; FixationDNA denaturalization in HClBlocking with normal serum.Incubation with anti-BrdU ant

10、ibodyHRP conjugated secondary antibodiesVisualization with DAB or fluorescentMouse intestineMouse model of atherosclerosis2.2.4 BrdU 標(biāo)記和染色2.2.5 質(zhì)控與標(biāo)準(zhǔn)化全流程的質(zhì)控（從取材固定開始）使用合格的和標(biāo)準(zhǔn)化的試劑和器材嚴(yán)格按染色規(guī)程操作設(shè)立試劑和組織對(duì)照人員的培訓(xùn)，做到染色結(jié)果的正確判讀。2.3 電子顯微鏡技術(shù)電鏡原理樣品制備特點(diǎn)電鏡應(yīng)用實(shí)例特殊的電鏡技術(shù)應(yīng)用策略與差錯(cuò)的預(yù)防透射電鏡掃描電鏡2.3.1 電鏡工作原理2.3.2 電鏡制樣特點(diǎn)光鏡透射電鏡掃描

11、電鏡1次固定（甲醛/多聚甲醛）2次固定前固定（多聚甲醛、戊二醛）、后固定（鋨酸）1次固定（戊二醛）脫水脫水脫水透明（二甲苯）浸透（丙酮/環(huán)氧樹脂）替代（醋酸異戊酯）包埋（石蠟）包埋（環(huán)氧樹脂）/切片（210 um）半薄切片（2 um）/超薄切片（50 80 nm）/臨界點(diǎn)干燥（CO2）染色（生物染料）染色（鉛、鈾）真空噴鍍切片銅網(wǎng)樣品托2.3.3 電鏡應(yīng)用實(shí)例血管的腔面結(jié)構(gòu)血管支架內(nèi)皮化組織工程化（體外內(nèi)皮化）支架人工血管材質(zhì)及表面特性材料損傷與反應(yīng)（血液相容性）心肌細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)與心房肽顆粒心肌細(xì)胞再生（干細(xì)胞分化研究）心肌細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)性病毒性心肌炎心肌缺血再灌注損傷動(dòng)脈粥樣硬化與單核巨噬細(xì)

12、胞鐵標(biāo)記2.3.4 特殊的電鏡技術(shù)/血管鑄型2.3.4 特殊的電鏡技術(shù)血管內(nèi)皮細(xì)胞硝酸銀染色2.3.4 特殊的電鏡技術(shù)免疫金與納米金標(biāo)記比較2.3.4 特殊的電鏡技術(shù)/免疫金標(biāo)記Dystrophin2.3.4 特殊的電鏡技術(shù)免疫金標(biāo)記（雙標(biāo)，10 nm，20 nm）2.3.4 特殊的電鏡技術(shù)/納米金標(biāo)記納米金顆粒與免疫球蛋白Fab片段結(jié)合而成。探針較小、穿透力強(qiáng)，易獲得陽性結(jié)果銀增強(qiáng)和金調(diào)色的應(yīng)用使信噪比大大增強(qiáng)。分辨率大大提高Anti collagen IV Anti connexin 262.3.4 特殊的電鏡技術(shù)免疫金標(biāo)記電鏡的特點(diǎn)高分辨率（納米級(jí)）特異抗原亞細(xì)胞水平的定位 半定量及動(dòng)態(tài)

13、變化分析可雙標(biāo)或多重標(biāo)記2.3.4 特殊的電鏡技術(shù)/免疫金標(biāo)記樣品處理的矛盾超微形態(tài)的保存抗原性的保存改善或解決辦法低濃度戊二醛或多聚甲醛避免鋨酸后固定縮短脫水時(shí)間低溫聚合蝕刻（NaOH 或 H2O2）2.3.5 電鏡實(shí)驗(yàn)策略不能脫離光鏡層次；定性作用大于定量作用；電鏡半定量/評(píng)分時(shí)，注意方法的通用性，并盡量減少組別；電鏡觀察的局限性，避免以偏概全；注意送檢樣品的要求，保鮮、防凍。2.3.5 電鏡實(shí)驗(yàn)策略心肌缺血再灌注損傷的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)2.3.5 電鏡實(shí)驗(yàn)策略冰晶的影響與細(xì)菌污染2.4 形態(tài)定量學(xué)體視學(xué)方法計(jì)算機(jī)輔助圖像分析免疫組織化學(xué)定量2.4.1 體視學(xué)方法（Stereology）特點(diǎn)傳統(tǒng)、有

14、效的方法由二維結(jié)構(gòu)信息定量推論三維結(jié)構(gòu)信息基本方法點(diǎn)計(jì)數(shù)交點(diǎn)計(jì)數(shù)截面計(jì)數(shù)切線計(jì)數(shù)橫穿點(diǎn)計(jì)數(shù)截面面積周長測量平均截距測算截面平均卡規(guī)直徑測算切片厚度測試參數(shù)類別密度參數(shù)尺寸參數(shù)形狀參數(shù)分布參數(shù)結(jié)構(gòu)成分總量2.4.2 計(jì)算機(jī)輔助圖像分析特點(diǎn)高效簡便常用軟件Image Pro PlusNIH Image Scion ImagePhotoshop2.4.3 免疫組織化學(xué)定量可測參數(shù)染色分布（面積測量）陽性細(xì)胞的比率（計(jì)數(shù)測量）染色強(qiáng)度（光密度測量）實(shí)現(xiàn)方式 計(jì)算機(jī)輔助的圖像分析實(shí)際價(jià)值半定量（不如 Western Blot）不能替代生化定量2.4.3 免疫組織化學(xué)定量精確定量的前提抗原濃度與免疫組化產(chǎn)

15、物濃度直線或近似直線相關(guān)。要求最優(yōu)的酶濃度和顯色時(shí)間。可重復(fù)性。要求標(biāo)準(zhǔn)化染色流程。要求在同一批動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、同一批次試劑內(nèi)定量。其它要求：不要襯染，多重標(biāo)記時(shí)不要選用不易定量的非光譜終產(chǎn)物色（棕色、紫色）2.4.3 免疫組織化學(xué)定量（eNOS染色光密度定量實(shí)例）關(guān)鍵步驟心肌細(xì)胞選區(qū)測量選區(qū)光密度無心肌細(xì)胞選區(qū)以無心肌細(xì)胞區(qū)光密度（背景）校正心肌細(xì)胞區(qū)光密度方法優(yōu)勢解決組織或組織染色的非均質(zhì)性具有較高的室間和室內(nèi)可信度（可重復(fù)性）3.0 模式動(dòng)物的病理學(xué)評(píng)價(jià)急性心肌缺血/再灌注慢性心肌缺血病毒性心肌炎心肌肥厚動(dòng)脈粥樣硬化肺動(dòng)脈高壓心血管植入器材3.1 急性心肌梗死的病理學(xué)評(píng)價(jià)心肌梗死的顯示四唑類染

16、料 TTC 或 NBT 存活心?。ㄓ忻摎涿福┘t色 壞死心?。o脫氫酶）不著色用于顯示嚴(yán)重的不可逆的心肌損傷脫氫酶的丟失緩慢，結(jié)果要再灌注數(shù)小時(shí)后才顯示缺血危險(xiǎn)區(qū)的顯示依文氏藍(lán)（Evens Blue）或臺(tái)盼藍(lán)（ Trypan Blue ）直接冠脈灌注 非缺血區(qū) 染色 缺血區(qū)域 不染色用于顯示心肌缺血并可能發(fā)生壞死的組織總量3.1 急性心肌梗死的病理學(xué)評(píng)價(jià)顯示實(shí)例 1（豬）前降支阻斷1h再灌注3hRi 缺血危險(xiǎn)區(qū)NE 壞死區(qū)紅四氮唑依文氏藍(lán)3.1 急性心肌梗死的病理學(xué)評(píng)價(jià)顯示實(shí)例 2（大鼠）25 min LAD occlusion + 2 h reperfusion例1例23.1 急性心肌梗死的病

17、理學(xué)評(píng)價(jià)原始參數(shù)缺血危險(xiǎn)區(qū) Area of Risk (AR)壞死區(qū) Area of Necrosis (AN)計(jì)算方法 各層病變面積之和/各層心壁斷面之和梗死灶大小 壞死區(qū)占全心的百分比壞死區(qū)占左室的百分比壞死區(qū)占缺血危險(xiǎn)區(qū)的百分比3.1 急性心肌梗死的病理學(xué)評(píng)價(jià)小動(dòng)物心臟的切取法切取方法冷凍法（20C）瓊脂包埋法直接切取法石蠟包埋組織切片法組織片厚度 1 mm 至 2 mm多切面評(píng)價(jià) 心尖至基底部等距離橫斷心臟，共5至6個(gè)切面單切面評(píng)價(jià) 心尖與結(jié)扎點(diǎn)的中點(diǎn)橫斷面，或左室中點(diǎn)橫斷面3.1 陳舊性心梗的病理學(xué)評(píng)價(jià)周長測量法代替面積測量法3.2 慢性心肌缺血的組織學(xué)評(píng)價(jià)形態(tài)定量指標(biāo)心肌纖維化側(cè)支

18、循環(huán)（左圖）新生血管密度細(xì)胞增殖標(biāo)志物心肌超微結(jié)構(gòu)變化3.3 病毒性心肌炎的病理學(xué)評(píng)價(jià)主要項(xiàng)目心肌損傷的病理學(xué)評(píng)分病毒蛋白免疫組織化學(xué)檢測病毒核酸的原位檢測細(xì)胞損傷或病毒入侵的電鏡觀察3.3 病毒性心肌炎的病理學(xué)評(píng)價(jià)心肌損傷的分級(jí)或評(píng)分0 = 無炎癥; 1 = 1至5個(gè)單個(gè)核細(xì)胞浸潤灶，但病灶面積不足切片面積的5%; 2 = 大于5個(gè)單個(gè)核細(xì)胞浸潤灶，但病灶面積介于切片面積的5%至 20%; 3 = 彌漫單個(gè)核細(xì)胞浸潤，但病灶面積超過切片面積的 20%，但不伴心肌壞死;4 = 彌漫單個(gè)核細(xì)胞浸潤，伴心肌壞死。3.4 心肌肥厚的病理學(xué)評(píng)價(jià)主要項(xiàng)目心臟重量/左室重量心肌細(xì)胞大小（橫斷面面積）心肌纖維化程度3.5 心肌肥厚的病理學(xué)評(píng)價(jià)心肌細(xì)胞大小的測量參數(shù)細(xì)