血清白蛋白的分離20120622

1、血清白蛋白的分離、純化與鑒定1實驗目的掌握血清白蛋白分離純化的方法；學會用鹽析和離子交換柱層析法分離純化蛋白質的原理與操作；學習檢測蛋白質純度的方法.2原理與操作血清的制備 粗白蛋白的分離 白蛋白的純化 白蛋白純度的檢測 留樣：2，3留樣：4,留樣：13一、豬血清白蛋白的初步分離1.實驗目的掌握血液樣品的正確處理和制備方法,掌握血清白蛋白粗分離的一般方法。42. 實驗內容：采血 ；血清分離；鹽析法分離血清白蛋白 ；除鹽53. 實驗原理血清白蛋白是血漿中含量最豐富的蛋白質，約占總量的60。它是一種水溶性很強的蛋白，結構穩(wěn)定，能結合多種小分子，如脂肪酸，膽紅素，血紅素等，起維持血液的正常滲透壓作用

2、。此外白蛋白還有解毒、參與脂類代謝及血漿中微溶物質的運輸、維持血液酸堿平衡等作用，在醫(yī)學臨床及生物領域應用廣泛 6不同蛋白質的相對分子質量、溶解度以及在一定條件下帶電的情況有所不同，可根據(jù)這些性質的差別，分離及提純各種蛋白質。本實驗先用鹽析法作初步分離。鹽析就是大量中性鹽使蛋白質從溶液中析出的過程。在高濃度的中性鹽影響下，蛋白質分子的水化膜被剝奪,蛋白質分子所帶的電荷被中和破壞了蛋白質溶膠的穩(wěn)定因素，使蛋白質沉淀析出。中性鹽并不破壞蛋白質的分子結構和性質，因此，若除去中性鹽或減低鹽的濃度，蛋白質就會重新溶解。7在半飽和硫酸銨溶液中，血清白蛋白不沉淀，球蛋白沉淀，離心后白蛋白主要在上清液中。由于

3、血清白蛋白的相對分子質量較硫酸銨大得多，故鹽析初步分離的白蛋白可用透析法或凝膠層析法除去硫酸銨。8奈氏反應 奈氏試劑是絡鹽K2HgI4加KOH的溶液，在無機化學定性分析中，用其檢驗氨或銨鹽磚紅色的溶液或沉淀 94. 實驗操作：（1）收集血清：取2 ml血液，4 ，3,000 rpm離心15 min，用移液槍吸取上清（血清）1 ml至10 ml離心管，留0.1 ml （樣1）至1.5 mL離心管，用于測定蛋白質含量和電泳；（2）量筒量取9 ml底液，用移液管逐滴加入，在加的過程中需不斷的搖晃或振蕩，4 靜置2 h；（底液為50 %的飽和硫酸銨溶液）；（3）4 ，3,000 rpm離心15 min

4、，收集上清，留0.5 ml至1.5 ml （樣2）離心管，用于測定蛋白質含量和電泳；（4）用5%的檸檬酸緩沖液調節(jié)pH至4.5（7-9滴，白蛋白的等電點），用量筒確定上清液的體積，計算加入飽和硫酸銨（pH4.5）的體積（0.11V）；10（5）逐滴加入飽和硫酸銨（pH4.5），邊加邊振蕩，4 靜置2 h；（6）4 ，3,000 rpm離心20 min，棄上清，沉淀用0.5 ml pH 7.4的檸檬酸-Na2HPO4緩沖液溶解，留0.1 ml至1.5 ml離心管（樣3） ，用于測定蛋白質含量和電泳；（7）將剩余的0.4 ml蛋白質溶液將透析袋中，放入pH 7.4的檸檬酸-Na2HPO4緩沖液中，

5、攪拌透析過夜至蛋白質溶液中無NH4存在；（透析袋的制備：透析袋中部有不能碰，將兩條用棉線扎緊）；（8）NH4的檢測（奈氏試劑檢測）：取1 ml透析液，加入5滴奈氏試劑，混勻，觀察，如果出現(xiàn)磚紅色沉淀，說明仍有NH4存在，需繼續(xù)透析；11二、血清白蛋白的純化實驗目的：了解離子交換層析的基本原理學會用離子交換法分離純化蛋白質。2. 實驗內容離子交換柱安裝，平衡，加樣，洗脫，樣品收集 123. 實驗原理 離子交換層析是一種用離子交換樹脂作支持劑的層析方法。本實驗采用的DEAE纖維素離子交換劑（中強堿型），可電離基團是二乙基氨基乙基，適用于大分子的分離。13在離子交換層析中，蛋白質對離子交換劑的結合力

6、取決于彼此之間相反電荷基團的靜電吸引，而這又和溶液的pH與鹽離子濃度有關。因此，蛋白質混合物的分離可以由改變溶液中鹽離子濃度和pH來完成，對離子交換劑結合力最小的蛋白質首先從層析柱中洗脫出來。14除硫酸銨后的白蛋白溶液在0.02mol/L pH7.4 醋酸銨緩沖液的條件下，加到二乙氨乙基（DEAE ）一纖維素（陰離子交換纖維素之一）層析柱上，在此pH 時，DEAE 一纖維素帶有正電荷，它能吸附帶負電荷的白蛋白、及球蛋白（血清白蛋白等電點為4 . 9 ，絕大多數(shù)。及球蛋白等電點均小于6 ）。隨著鹽離子濃度的提高，離子交換柱上的球蛋白、球蛋白、白蛋白依次被洗脫下來。154. 實驗方法與步驟（1）裝

7、柱：將層析柱固定，保持垂直位。將浸脹的DEAE-纖維素裝入柱內，至8-10cm高度，平衡過夜（裝柱時應注意均勻，凝膠內不得有氣泡，凝膠床要平整）；（2）準備60100支試管，置于自動收集器上；洗脫液經(jīng)核酸蛋白檢測儀監(jiān)視，調節(jié)流速為 1mL/min，蛋白質檢測器調零；（3）上樣：將透析袋剪開，用移液管轉至凝膠面上，待樣品進入凝膠后再加入少量緩沖液，使樣品完全進入膠內；（4）洗脫：采用連續(xù)梯度洗脫。接上恒流泵，用0.021.0molL醋酸醋酸銨緩沖液（pH7.4）進行梯度洗脫，收集；記錄出現(xiàn)峰值的管號；保存樣品。16三、血清白蛋白純度測定1. 實驗目的學習蛋白質純度檢測方法。2. 實驗內容聚丙烯酰胺凝膠電泳173. 實驗原理PAGE是最常用的定性分析蛋白質的電泳方法，特別是用于蛋白質純度檢測和測定蛋白質分子量。 電泳遷移率與顆粒的電荷、形狀、大小（分子量）有關，如電荷、形狀都一樣，則電泳遷移率只與分子量有關。184.實驗方法與步驟 （1）膠的制備19（2） 樣品的處理： 向標準蛋白質或待測樣品中按比例加入上樣緩沖液，充分溶解后，加蓋（不要密閉），置沸水浴3 min，取出冷至室溫。上樣順序：（1）標準蛋白；（2）樣品準備步驟（3）收集的蛋白質溶液；（3）樣品準備步驟（6）收集的蛋白質溶液；（4）（X）：柱層析出現(xiàn)高峰的管號蛋白質；加樣量：20l.20（3） 電泳：點樣