陳洪惠-2015-6-4修改版(共22頁(yè))

1、學(xué)校代碼：10904 學(xué) 士 學(xué) 位 論 文雙水相萃取(cuq)蚓激酶的初步研究姓 名：陳洪惠學(xué) 號(hào)：201107140402指導(dǎo)教師：王 飛學(xué) 院：生命科學(xué)學(xué)院專 業(yè)：制藥工程完成日期：2015年6月5日 學(xué) 士 學(xué) 位 論 文雙水相萃取蚓激酶的初步(chb)研究姓 名：陳洪惠學(xué) 號(hào)：201107140402指導(dǎo)教師：王 飛學(xué) 院：生命科學(xué)學(xué)院專 業(yè)：制藥工程完成日期：2015年6月5日摘 要為彌補(bǔ)蚓激酶現(xiàn)有(xin yu)提取方法的不足，本實(shí)驗(yàn)采用聚乙二醇-硫酸銨組成的雙水相體系對(duì)蚓激酶進(jìn)行分離純化，并運(yùn)用TAME底物法測(cè)定其效價(jià)。以蚓激酶的效價(jià)為考察(koch)指標(biāo)，探討聚乙二醇的分子量

2、、聚乙二醇的質(zhì)量(zhling)分?jǐn)?shù)、硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)雙水相萃取蚓激酶的影響，并通過(guò)正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化萃取條件。經(jīng)實(shí)驗(yàn)，聚乙二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)蚓激酶的萃取影響最大，在聚乙二醇分子量為6000、聚乙二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%時(shí)組成的雙水相體系，對(duì)所分離得到的蚓激酶效價(jià)較高，提取的蚓激酶活力達(dá)12.23U/mg。結(jié)果表明，該雙水相體系用于蚓激酶分離純化具有良好的選擇性，而且保持了較高的活性。關(guān)鍵詞：雙水相；萃??；蚓激酶；正交試驗(yàn)AbstractIn order to remedy the deficiency of Lumbrokinase extraction method,se

3、paration of Lumbrokinase directly from earthworn homogenate in aqueous two-phase systems(ATPS)of polyethylene glycol-ammonium sulfate was studied.The effects of polyethylene glycol molecular weight,(NH4)2SO4 concentration on the extraction were investigated in terms of titer.Orthogonal experiment wa

4、s used to further analyze and optimize the separation of Lumbrokinase.The results indicated that the control of polyethylene glycol molecular weight had the greatest influence.The polyethylene glycol molecular weight was6000, polyethylene glycol concentration was 16%, 18% sodium sulfate concentratio

5、n of aqueous two-phase system can obtain high Lumbrokinase titer.The separation was successful with the Lumbrokinase activity of 12.23U/mg.Test showed that polyethylene glycol-ammonium sulfate aqueous two-phase system for separation Lumbrokinase from the earthworm provides a new extraction method, r

6、sults showed that the aqueous water phase system used in Lumbrokinase purification has good selectivity, and kept high activity.Key Words:Aqueous two phase; Extraction;Lumbrokinase; Orthogonal experiment目 錄TOC o 1-3 h u HYPERLINK l _Toc31509 第1章 引言(ynyn) 第1章 引言(ynyn) 蚓激酶為中藥地龍中的有效成分。地龍其性寒，味咸，歸肝、脾、膀胱經(jīng)

7、，主要功效為清熱定驚，通絡(luò)，平喘，利尿；臨床用于治療高熱神昏，驚癇抽搐(chuch)，關(guān)節(jié)痹痛，肢體麻木，半身不遂，肺熱喘咳，水腫尿少等疾病1。 蚓激酶(jmi)純品為淡黃色至黃褐色粉末；味腥，有引濕性2；相對(duì)分子質(zhì)量為2104-4104，pI為 3-5，兼具激活纖溶酶原的類尿激酶及直接水解纖維蛋白的纖溶酶活性，不僅能夠溶解血栓，而且還具有抗凝作用3-4，彼此之間具有許多相似的特性：熱穩(wěn)定性，在55以下放置1h，酶活力基本不變；超過(guò)60時(shí)，酶活力迅速下降；當(dāng)溫度達(dá)到70時(shí)，酶已完全失活；酸穩(wěn)定性：其作用的pH范圍較寬，在pH4-11活力變化很小，在pH8-9時(shí)該酶的穩(wěn)定性最好5，pH低于4或高

8、于11時(shí)酶活性明顯下降。蚓激酶具有多方面的藥理作用，比如抗凝作用、纖溶作用、抑制血小板聚集、改善微循環(huán)等。體外藥理試驗(yàn)表明：蚓激酶有很強(qiáng)的纖溶活性，對(duì)蚯蚓纖溶酶與尿激酶進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其有較高的活性。 蚓激酶的分離純化方法有很多，如劉美艷等6采用硫酸銨鹽析、離子交換色譜、凝膠過(guò)濾和制備電泳等分離技術(shù)純化蚯蚓纖溶；王雪英等7經(jīng)勻漿抽提、熱變性、硫酸銨分步沉淀、凝膠過(guò)濾和DEAE-纖維素離子交換柱色譜等純化步驟，得到蚯蚓纖溶酶，但是都存在以下問(wèn)題:分離純化的工業(yè)路線長(zhǎng)，采用的許多步驟較為繁瑣，提取率低，周期長(zhǎng)，不利于工業(yè)化生產(chǎn)8。 雙水相萃取技術(shù)是一種新型的液-液萃取技術(shù)，與傳統(tǒng)的萃取技術(shù)相比，其具

9、有處理能力強(qiáng)、分相時(shí)間短、適合工業(yè)化生產(chǎn)等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的萃取、分離和純化9-12。在無(wú)機(jī)鹽存在下，某些高聚物水溶液可以分成兩相的非有機(jī)溶劑萃取分離法，具有不揮發(fā)、無(wú)毒、快速和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，作為一種新型萃取分離技術(shù)，已得到了許多研究者的關(guān)注13。 本實(shí)驗(yàn)利用雙水相萃取(cuq)技術(shù)，并采用TAME底物法對(duì)蚓激酶的效價(jià)進(jìn)行測(cè)定，簡(jiǎn)化其分離純化(chn hu)過(guò)程，使提取(tq)得到的蚓激酶產(chǎn)率和純度較高。第2章 材料與儀器2.1 材料與試劑 干蚯蚓（購(gòu)自山東淄博） 其他實(shí)驗(yàn)所用材料與試劑見(jiàn)表2-1，均為分析純。表2-1 實(shí)驗(yàn)所用材料與試劑材料與試劑生產(chǎn)廠家批號(hào)無(wú)水甲醇天津市風(fēng)船化學(xué)試

10、劑科技有限公司20141208TAME國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司20130929變色酸國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司20140303三氯乙酸國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司20140917高錳酸鉀徐州試劑總廠20130407無(wú)水亞硫酸鈉國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司20140312PEG2000國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司20140423PEG4000國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司20140605PEG6000國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司20141029磷酸二氫鈉天津市福晨化學(xué)試劑廠20120802磷酸氫二鈉天津市巴斯夫化工有限公司20120922硫酸銨天津市福晨化學(xué)試劑廠20140327濃硫酸萊陽(yáng)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠201

11、405092.2 試劑(shj)的配制 pH=7.0，0.02mol/L磷酸鹽緩沖液的配制：稱取磷酸二氫鈉1.6g，磷酸氫二鈉3.6g，將二者加水溶解(rngji)并稀釋至500ml，備用。 pH=8.0，0.1mol/L磷酸鹽緩沖液的配制(pizh)：稱取磷酸二氫鈉3.9g，磷酸氫二鈉9.0g，將二者加水溶解并稀釋至500ml，備用。 15三氯醋酸液的配制：稱取三氯醋酸15.0g，加水稀釋至100ml，備用。 2高錳酸鉀液的配制：稱取高錳酸鉀2.0g，加水稀釋至100ml，備用。 10無(wú)水亞硫酸鈉液的配制：稱取無(wú)水亞硫酸鈉1.0g，加水稀釋至100ml，現(xiàn)用現(xiàn)配。 0.4變色酸疏酸液的配制：

12、稱取變色酸0.4g，加67硫酸(重量與重量比)至l00ml，現(xiàn)用現(xiàn)配14。2.3 實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)所用儀器見(jiàn)表2-2。表2-2 實(shí)驗(yàn)所用儀器儀器名稱型號(hào)生產(chǎn)廠家小型中藥粉碎機(jī)500A長(zhǎng)沙市楚泰制藥機(jī)械設(shè)備有限公司藥典篩100目新鄉(xiāng)市金牛振動(dòng)設(shè)備廠電子天平BS300L上海有聲衡器有限公司內(nèi)切式勻漿機(jī)HFJ10天津恒奧科技有限公司數(shù)控超聲波清洗器KQ5200DB昆山市超聲儀器有限公司電熱套R(shí)DM1000金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司電熱鼓風(fēng)干燥箱101-2北京市中興偉業(yè)儀器有限公司大容量高速冷凍離心機(jī)H2050R湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)UV4802龍尼柯（上海）儀器有限公司數(shù)顯恒溫水

13、浴鍋HH-4金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司 第3章 實(shí)驗(yàn)(shyn)方法3.1 蚓激酶(jmi)粗提液的制備 稱取適量干蚯蚓(qi yn)，用小型中藥粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過(guò)100目篩，稱取蚯蚓粉末12g，置500ml燒杯中，加0.02mol/L磷酸鹽緩沖液400ml將其溶解，用內(nèi)切式勻漿機(jī)低速勻漿2min，超聲波震蕩10min，超聲結(jié)束后在4000r/min，4下離心20min，取上清液備用15。3.2 雙水相萃取蚓激酶的流程 稱取蚓激酶粗提液20g，置100ml燒杯中，分別加入適量的聚乙二醇和硫酸銨，攪拌溶解，將其轉(zhuǎn)入60ml分液漏斗中，置于鐵架臺(tái)上靜置分層，將上相烘干，研磨過(guò)80目篩，稱取粉末0.

14、5g，用pH=8的磷酸緩沖溶液配成濃度為0.005g/ml的樣品溶液，按照TAME底物法測(cè)定其效價(jià)。 3.3 蚓激酶效價(jià)測(cè)定 3.3.1 甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 甲醇標(biāo)準(zhǔn)液的制備：精密最取甲醇0.102mI，置25ml容最瓶中，加入磷酸鹽緩沖液(0.1mol/L)至刻度，搖均。精密最取此液0.5ml，置25ml容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液(0.1mol/L)稀釋至刻度16。甲醇標(biāo)準(zhǔn)(biozhn)曲線的繪制見(jiàn)表3-1。表3-1 甲醇(ji chn)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制123456PBS（ml）0.300.250.200.150.100.05甲醇液（ml）0.000.050.100.150.200.25TCA

15、（ml）0.200.200.200.200.200.20KMNO4（ml）0.10.10.10.10.10.1振搖1.5min無(wú)水Na2SO3（mL）0.10.10.10.10.10.1變色酸（ml）4.04.04.04.04.04.0置沸水浴中加熱(ji r)25min，取出，冷水浴中降溫10min，測(cè)定574nm波長(zhǎng)處的吸光度17-19，計(jì)算其效價(jià)。3.3.2 蚓激酶樣品效價(jià)測(cè)定樣品的效價(jià)測(cè)定見(jiàn)表3-2。表3-2 樣品效價(jià)測(cè)定123樣品濃度（g/ml）空白5.010-32.510-3TAME（ml）0.10.10.1PBS（ml）0.20.10.1TCA（ml）0.2/樣品液（ml）/0.

16、10.137水浴30min，精密計(jì)時(shí)TCA（ml）/0.20.2KMNO4（ml）0.10.10.1振搖1.5min無(wú)水Na2SO3（mL）0.10.10.1變色酸（ml）4.04.04.0沸水浴加熱25min冷水浴10min574nm處測(cè)定吸光度根據(jù)所測(cè)樣品的吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出甲醇的量，依照(yzho)下列公式計(jì)算供試品中的TAME單位效價(jià)： TAME單位/mg=甲醇微摩爾數(shù)時(shí)間（min）體積（ml）3.4 雙水相萃取(cuq)蚓激酶(jmi)的單因素分析3.4.1 PEG分子量的影響 取100ml燒杯5個(gè)，分別編號(hào)為1、2、3、4、5，加入粗提液20g，分別加入分子量為2000，40

17、00，6000的PEG 4.8g，依次加入硫酸銨5.3g，攪拌溶解后，將其轉(zhuǎn)移至60ml分液漏斗中，置于鐵架臺(tái)上靜置分層，取上相，將其烘干，研磨過(guò)80目篩，取粉末0.5g，用pH=8的磷酸緩沖溶液配成濃度為0.005g/ml的樣品溶液，按照TAME底物法測(cè)定其效價(jià)。3.4.2 PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 保持PEG平均分子質(zhì)量6000和硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)18%不變，改變PEG加入量1.2、3.1、4.8、7.4、9.2g，攪拌溶解，按上法操作測(cè)定效價(jià)。 3.4.3 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 保持PEG分子量為6000，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%不變，依次加入硫酸銨1.8、3.9、5.3、6.7、8.8g，攪拌溶解，

18、同法測(cè)定其效價(jià)。3.5 雙水相萃取(cuq)蚓激酶(jmi)的正交試驗(yàn)(shyn)設(shè)計(jì)為優(yōu)化雙水相萃取的條件，設(shè)定PEG的分子量為M，PEG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為A，硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為C作為實(shí)驗(yàn)考察因素，加入蚓激酶粗提液20g，以蚓激酶的效價(jià)為指標(biāo)做三因素三水平的實(shí)驗(yàn)20-21，見(jiàn)表3-3。表3-3 因素水平表水平PEG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)MPEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)A硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)C1M1（2000）A1（14%）C1（16%）2M2（4000）A2（16%）C2（18%）3M3（6000）A3（18%）C3（20%）3.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照正交試驗(yàn)得到的最優(yōu)工藝條件進(jìn)行雙水相萃取，并進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。結(jié)果與分析4.1甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲

19、線的繪制結(jié)果數(shù)據(jù)處理軟件得到的甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4-1。圖4-1 甲醇(ji chn)標(biāo)準(zhǔn)曲線 由標(biāo)準(zhǔn)(biozhn)曲線可得，回歸方程為A=2.431C0.011，R2=0.993；甲醇(ji chn)濃度在0.021-0.106mol/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。4.2 單因素分析結(jié)果4.2.1 PEG分子量PEG分子量對(duì)雙水相萃取蚓激酶的影響見(jiàn)圖4-2。 圖4-2 PEG分子量對(duì)雙水相萃取蚓激酶的影響 由圖4-2可得，PEG分子量4000時(shí)蚓激酶的效價(jià)最高，分子量在6000是較高，分子量在2000時(shí)的效價(jià)最低，所以確定PEG分子量為4000時(shí)最有利于雙水相萃取。4.2.2 PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù) PE

20、G質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)雙水相萃取蚓激酶的影響見(jiàn)圖4-3。圖4-3 PEG質(zhì)量(zhling)分?jǐn)?shù)對(duì)雙水相萃取(cuq)蚓激酶的影響(yngxing) 由圖4-3可得，PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)在10%22%范圍內(nèi)時(shí)蚓激酶的得率較高，但是綜合考慮成相的體積和吸光度，最終確定PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%時(shí)為最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)。4.2.3 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù) 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)雙水相萃取蚓激酶的影響見(jiàn)圖4-4。圖4-4 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)雙水相那個(gè)萃取蚓激酶的影響 由圖4-4可得，隨著硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增大，蚓激酶的效價(jià)呈現(xiàn)降低-上升-降低的趨勢(shì)，在硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%時(shí)效價(jià)有最大值4.05U/mg。硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)在8%之前不成相，而鹽濃

21、度增加到一定程度后，使蚓激酶的溶解度下降而發(fā)生鹽析作用，所以選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%硫酸銨。4.3 正交試驗(yàn)分析結(jié)果正交試驗(yàn)(shyn)結(jié)果(ji gu)見(jiàn)表4-1。表4-1 正交試驗(yàn)(shyn)表實(shí)驗(yàn)號(hào)PEG分子量PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)TAME(U/mg)1200014%16%8.332200016%18%11.103200018%20%10.134400014%20%9.285400016%16%10.566400018%18%10.627600014%16%9.558600016%20%11.149600018%18%11.02均值19.9079.05310.030均值210.1531

22、0.98710.520均值310.57010.59010.080極差R0.6631.9340.507按照表4-1正交結(jié)果對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行方差分析，見(jiàn)表4-2。表4-2 方差分析結(jié)果偏差平方和自由度均方F值P值M0.77720.3893.8950.204A3.38321.69216.9560.058C0.45220.2262.2640.306誤差0.20020.100 由表4-1和表4-2可知，雙水相萃取蚓激酶的影響因素順序?yàn)椋篜GE質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG分子量硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)，且試驗(yàn)確定了最佳優(yōu)化條件為PEG分子量為6000，PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%。4.4 驗(yàn)證(ynzhng)試驗(yàn)(s

23、hyn)結(jié)果(ji gu)稱取粗提液20g，加入分子量6000的PEG 4.8g（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%），依次加入硫酸銨5.3g（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%），攪拌溶解后，將其轉(zhuǎn)移至60ml分液漏斗中，置于鐵架臺(tái)上靜置分層，將上相烘干，研磨過(guò)80目篩，取粉末0.5g，用pH=8的磷酸緩沖溶液配成濃度為0.005g/ml的樣品溶液，測(cè)定其吸光度并算出其效價(jià)為12.23U/mg。結(jié)論與討論 本文考察了聚乙二醇的分子量、聚乙二醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)聚乙二醇-硫酸銨成相系統(tǒng)萃取蚓激酶的影響(yngxing)，綜合考慮各種因素，初步確定當(dāng)萃取系統(tǒng)中聚乙二醇分子量為6000，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%，硫酸銨質(zhì)量分

24、數(shù)為18%時(shí)，蚓激酶得萃取效率最高，酶活力達(dá)12.23U/mg22，該雙水相體系用于蚓激酶分離純化具有(jyu)良好的選擇性，而且保持了較高的蚓激酶活性。 在聚乙二醇-硫酸銨組成(z chn)的雙水相體系中，當(dāng)聚乙二醇的分子量和硫酸銨的濃度不變時(shí)，雙水相萃取得到的蚓激酶的效價(jià)隨著分子量的增大先后減小，選擇分子量為4000的聚乙二醇；當(dāng)聚乙二醇的分子量和硫酸銨的濃度一定時(shí)，其效價(jià)隨著聚乙二醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，所以最終選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%的聚乙二醇；當(dāng)聚乙二醇的分子量及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)不變時(shí)，其效價(jià)隨硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而有較大的改變，由于高濃度的硫酸銨會(huì)造成鹽析，所以選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為

25、18%的硫酸銨。 蚓激酶的效價(jià)測(cè)定有很多種方法，比如考馬斯亮藍(lán)法，該方法適合所有的蛋白質(zhì)，對(duì)蚓激酶的專一性不高；纖維蛋白平板法，該方法過(guò)程繁瑣，而且所需要的試劑價(jià)格昂貴。實(shí)驗(yàn)中，TAME方法的影響因素有很多： = 1 * GB3 * MERGEFORMAT 顯色劑，實(shí)驗(yàn)中的顯色劑為變色酸，配制的變色酸硫酸溶液，應(yīng)為淡黃色澄清透明溶液，而且應(yīng)在臨用前現(xiàn)配； = 2 * GB3 * MERGEFORMAT 顯色物的穩(wěn)定性，測(cè)定液從冷水浴中取出后，應(yīng)在0-2h時(shí)間間隔內(nèi)盡快測(cè)定； = 3 * GB3 * MERGEFORMAT 高錳酸鉀，操作時(shí)盡量避免高錳酸鉀溶液粘附在試管的口、壁，如果粘附，可以用

26、亞硫酸鈉溶液將粘附的高錳酸鉀溶液蕩洗下來(lái)；亞硫酸鈉溶液必須臨用前配制，以保證亞硫酸鈉溶液的還原能力。 研究證明，蚓激酶的分離純化還可以采用超濾、硫酸銨鹽析和分子篩、離子交換層析、柱層析分離 23-26等方法對(duì)蚓激酶的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，也可以將分離純化的蚓激酶制成凍干粉或者凍干粉針劑27-29。 參考文獻(xiàn)1 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部(y b)）M.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2010.113-114.2 WS1-(X-052)-2001Z-2010,國(guó)家食品(shpn)藥品監(jiān)督管理局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)-蚓激酶(jmi) S.北京: 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局,2010.3 滕文嬌,孫晉

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