新編文檔-第十章DNA復制醫(yī)學課件ppt-精品文檔

1、第 三 篇 基 因 信 息 的 傳 遞Watson and CrickM. Wilkins Rosalind FranklinDNARNA復制 中心法則（The central dogma）復制逆轉錄轉錄翻譯蛋白質F. Crick第 十 章 DNA 生 物 合 成(復制)DNA Biosynthesis (Replication)學習目標掌握：DNA復制的基本規(guī)律掌握：DNA復制有關的酶和蛋白質因子理解：原核和真核DNA復制的過程及二者間差異掌握：逆轉錄的過程及意義理解：DNA突變的分子類型及DNA損傷修復方式了解：DNA的其他復制方式復制(replication)是指遺傳物質的傳代，以母鏈D

2、NA為模板合成子鏈DNA的過程。復制親代DNA子代DNA第一節(jié) 復制的基本規(guī)律Basic Rules of DNA Replication復制的方式半保留復制(semi-conservative replication)雙向復制(bidirectional replication)半不連續(xù)復制(semi-discontinuous replication) 一、半保留復制是DNA復制的基本特征 DNA生物合成時，母鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為模板(template)按堿基配對規(guī)律，合成與模板互補的子鏈。子代細胞的DNA，一股單鏈從親代完整地接受過來，另一股單鏈則完全從新合成。兩個子細胞的D

3、NA都和親代DNA堿基序列一致。這種復制方式稱為半保留復制。半保留復制的概念:AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母鏈DNA 復制過程中形成的復制叉子代DNA 子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式: 全保留式 半保留式 混合式 半保留復制的實驗依據(jù)N15-DNA的細菌培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液 第一代繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液 第二代梯度離心結果N14-DNAN15-DNA 對

4、照（二）半保留復制的意義按半保留復制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。(一)原核生物細胞：有一個固定的復制起始點 (origin)oriterA B C二、DNA復制從起始點向兩個方向延伸形成雙向復制53oriorioriori535533553復制子3(二)真核生物：多起始點，雙向復制復制叉3535解鏈方向353355半不連續(xù)復制產生的原因？三、DNA一股子鏈復制的方向與解鏈方向相反導致半不連續(xù)復制順著解鏈方向生成的子鏈，復制是連續(xù)進行的，這股鏈稱為領頭鏈。另一股鏈因為復制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)

5、復制的鏈稱為隨從鏈。復制中的不連續(xù)片段稱為岡崎片段(okazaki fragment)。 領頭鏈連續(xù)合成而隨從鏈不連續(xù)合成，就是復制的半不連續(xù)性。 第二節(jié) DNA復制的酶學和拓撲學變化一、DNA復制的化學反應，(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi 參與DNA復制的物質 底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP聚合酶(polymerase): 依賴DNA的DNA聚合酶，簡寫 為 DNA-pol模板(template) : 解開成單鏈的DNA母鏈引物(primer): 提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合 其他的酶和蛋白質因子二、 DNA

6、聚合酶催化脫氧核苷酸間聚合全稱：依賴DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)簡稱：DNA-pol活性：1、53 的聚合活性2、核酸外切酶活性5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5外切酶活性 5 3外切酶活性?能切除突變的 DNA片段。能辨認錯配的堿基對，并將其水解。 核酸外切酶活性 原核生物的DNA聚合酶 I II III3 5 核酸外切酶活性 + + +5 3 核酸外切酶活性 + - -聚合速度（bp/min）10

7、00-120024001500060000持續(xù)合成能力3-2001500500000功能校對，切除引物，修補空隙修復復制，DNA-pol（109kD）一條多肽鏈，二級結構以螺旋為主功能：對復制中的錯誤進行校讀，對復制和修復中出現(xiàn)的空隙進行填補。DNA-pol Arthur KornbergA. Kornberg & R. Kornberg323個氨基酸小片段5 核酸外切酶大片段/Klenow fragment 604 amino acids(氨基酸)DNA 聚合酶 5 核酸外切酶N 端C 端木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是實驗室合成DNA，進行分子生物學研究中常用的工具酶。 功能是

8、原核生物復制延長中真正起催化作用的酶。 DNA-pol (250kD)真核生物的DNA聚合酶DNA-pol 起始引發(fā)，有引物酶活性。延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性參與低保真度的復制 。在復制過程中起校讀、修復和填補缺口的作用。在線粒體DNA復制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 不同生物體各種DNA聚合酶具有共同的特點1、以dNTP為原料2、合成DNA 新鏈具有模板 依賴性，嚴格遵循堿基配對規(guī)律。3、新鏈的延長只可沿5 3方向進行 。催化核苷酸以3， 5磷酸二酯鍵相互連接 4、DNA 新鏈生成需引物的3OH末端延伸DNA鏈，而不能從頭合成DNA鏈 三

9、、復制中的分子解鏈伴有DNA 分子拓撲學變化DNA分子的堿基埋在雙螺旋內部，只有把DNA解成單鏈，它才能起模板作用。 解螺旋酶(helicase)利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈。引物酶(primase) 合成一段RNA，提供3-OH作為復制的引物。單鏈DNA結合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 在復制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護單鏈的完整。 解螺旋酶SSB防止DNA纏繞，打結。10 8 局部解鏈后（二）DNA拓撲異構酶改變DNA超螺旋狀態(tài)、理順DNA鏈解鏈過程中DNA的纏繞、打結拓撲異構酶作用特點既能水解 、又能

10、連接磷酸二酯鍵拓撲異構酶切斷雙鏈中的一股，并封閉切口，不需要水解ATP拓撲異構酶 切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過切口旋轉使超螺旋松弛。利用ATP供能，連接斷端， DNA分子進入負超螺旋狀態(tài)。拓撲酶的作用方式：連接DNA鏈3-OH末端和相鄰DNA鏈5-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。四、DNA連接酶連接DNA雙鏈中的單鏈缺口HO5335DNA連接酶ATPADP5353T4 DNA連接酶大腸桿菌DNA連接酶DNA連接酶在復制中起最后連接缺口的作用。在DNA修復、重組及剪接中也起縫合缺口作用?；蚬こ讨羞B接目的基因和載體功能DNA生物合成過程The Proc

11、ess of DNA Replication第 三 節(jié)（一）復制起始：DNA解鏈形成引發(fā)體需要解決兩個問題：1. DNA解開成單鏈，提供模板。2. 形成引發(fā)體，合成引物，提供3-OH末端。一、原核生物的DNA生物合成E.coli復制起始點 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 245 串聯(lián)重復序列 反向重復序列53531. DNA解鏈2. 形成引發(fā)體 Dna A Dna B、 D

12、na CDNA拓撲異構酶引物酶SSB3535含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復制起始區(qū)域的復合結構稱為引發(fā)體。 3535引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。 引物3 HO5引物酶3. 合成引物(二) 復制的延伸 子鏈延伸方向：5 3在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐個加入，不斷形成磷酸二酯鍵的過程領頭鏈的合成領頭鏈的合成隨從鏈的合成隨從鏈的合成隨從鏈模板DNA的折疊環(huán)繞階段一階段二階段三階段四復制過程簡圖（三）復制的終止過程：切除引物、填補空缺、連接切口555RNA酶OHP5DNA-pol dNTP55PATP ADP+Pi55DNA連接酶哺乳動物的細胞周期DNA

13、合成期G1G2SM二、真核生物的DNA生物合成 細胞能否分裂，決定于進入S期及M期這兩個關鍵點。G1S及G2M的調節(jié)，與蛋白激酶活性有關。 蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復制因子而實施調控作用。 3. 增殖細胞核抗原(PCNA)在復制起始和延長中起關鍵作用。1. 多起始點，多復制子、復制的時序性 2.復制的起始需要DNA-pol（引物酶活性）和pol（解螺旋酶活性）參與。還需拓撲酶和復制因子(replication factor, RF)。 （一）真核生物復制的起始與原核基本相似3553領頭鏈3535親代DNA隨從鏈引物核小體1、引物和岡崎片斷比原核生物短2、核小體的解聚與重新裝配3、酶催化

14、速率比原核慢，但由于是多復制子復制，總體速度并不慢（二）真核生物復制的延長發(fā)生DNA聚合酶/轉換（三）端粒酶參與解決染色體末端復制問題切除引物的兩種機制53355335+5333355端粒(telomere) 指真核生物染色體線性DNA分子末端的結構。端粒的功能：維持染色體的穩(wěn)定性維持DNA復制的完整性端粒的結構特點：由末端單鏈DNA序列和蛋白質構成。末端DNA序列是多次重復的富含G、T堿基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG端粒酶(telomerase)端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR)端粒酶協(xié)同蛋白(human telomerase associat

15、ed protein 1, hTP1)端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT) 組成 端粒酶催化端區(qū)TG鏈的合成 5TTTTGGGGTT TTG-OH 3 CAAAACCCCAAAA 端粒酶 G C G A 3A A 5 結合、聚合、雜交 5TTTTGGGGTTTT Gggg t t t t g 3 CAAAACCCCAAAAC G A G A 3 5 TTTT 移位 G G G g G g G g 5TTTT t t t t g 3 CAAAACCCCAAAAC G A G A 3 5 終止 5TTTTGGGGTTTTG g

16、g g t t t t g g g g t t t t g-OH 35TTTTGGGG TTTTG g g g t t t t g g g g t t t t g-OH 33 5TTTTGGGG TTTTG g g g t t t t g g g g t t 3 HO- g g g g t t DNA pol5TTTTGGGG TTTTG g g g t t t t g g g g t t 3AAAACCCCAAAACCCC AAAA g g g g t t1. 遵守嚴格的堿基配對規(guī)律；2. 聚合酶在復制延長時對堿基的選擇功能；3. 復制出錯時DNA-pol的及時校讀功能。DNA復制的保真性：

17、逆轉錄和其他復制方式第四節(jié)逆轉錄酶(reverse transcriptase) 逆轉錄(reverse transcription) RNADNA 逆轉錄酶一、逆轉錄病毒和逆轉錄酶 TeminBaltimorePeyton Rous 1966 Nobel prize winner for his discovery of tumour inducing viruses（1911）1970, Temin and BaltimoreThe Nobel Prize in Physiology or Medicine 1975Rous逆轉錄病毒細胞內的逆轉錄現(xiàn)象RNA 模板逆轉錄酶DNA-RNA 雜

18、化雙鏈RNA酶H單鏈DNA逆轉錄酶雙鏈DNA(cDNA)逆轉錄酶 A AA A T T T TAAAASI核酸酶 DNA聚合酶堿水解 T T T T分子生物學研究可應用逆轉錄酶，作為獲取基因工程目的基因的重要方法之一，此法稱為cDNA法。 以mRNA為模板，經逆轉錄合成的與mRNA堿基序列互補的DNA鏈。 試管內合成cDNAcDNA complementary DNA二、逆轉錄研究的意義 逆轉錄酶和逆轉錄現(xiàn)象，是分子生物學研究中的重大發(fā)現(xiàn)。 逆轉錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物，RNA同樣兼有遺傳信息傳代與表達功能。對逆轉錄病毒的研究，拓寬了20世紀初已注意到的病毒致癌理論。 滾環(huán)復制(rollin

19、g circle replication)三、滾環(huán)復制和D環(huán)復制 是某些低等生物的復制形式，如X174和M13噬菌體等。3-OH5-P55533335滾環(huán)復制55335dNTPDNA-pol D環(huán)復制(D-loop replication) 是線粒體DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)的復制形式。 DNA損傷（突變）與修復DNA Damage (Mutation) & Repair第五節(jié)DNA突變具體指個別dNMP殘基以至片段DNA在構成、復制或表型功能的異常變化，也稱為DNA損傷(DNA damage)。從分子水平來看，突變就是DNA分子上堿基的改變。 （一）突變是進化

20、、分化的分子基礎（二）只有基因型改變的突變形成DNA的多態(tài)性（三）致死性的突變可導致個體、細胞的死亡 （四）突變是某些疾病的發(fā)病基礎一、突變在生物界普遍存在(一) 物理因素：輻射 UV嘧啶二聚體二、多種化學或物理因素可誘發(fā)突變(二) 化學因素：化學誘變劑(一) 錯配 Hbs：Glu Val,鐮形紅細胞貧血三、引起突變的分子改變類型有多種鐮形紅細胞貧血病人Hb (HbS) 亞基N-val his leu thr pro val glu C 肽鏈CAC GTG基因正常成人Hb (HbA)亞基N-val his leu thr pro glu glu C 肽鏈CTC GAG基因（二）插入、缺失0-Thalassemia(地中海貧血)0 ThalassemiaLepore血紅蛋白癥（三）重組或重排?？梢疬z傳、腫瘤等疾病框移突變是指三聯(lián)體密碼的閱讀方式改變，造成蛋白質氨基酸排列順序發(fā)生改變。 缺失或插入都可導致框移突變谷 酪 蛋 絲5 G C A G U A C A U G U C 丙 纈 組 纈正常5 G A G