反芻動物源性枯草芽孢桿菌的分離與鑒定(共18頁)

1、 青島(qn do)農(nóng)業(yè)大學(xué)畢 業(yè) 論 文 題 目：反芻動物源性枯草芽孢(y bo)桿菌的分離與鑒定姓 名： 學(xué) 院： 動物(dngw)科技學(xué)院 專 業(yè)： 動物醫(yī)學(xué) 班 級： 1001 學(xué) 號： 20105254 指導(dǎo)教師： 溫建新 2014年6月5日反芻動物(fn ch dn w)源性枯草(k co)芽孢桿菌的分離(fnl)與鑒定 動物醫(yī)學(xué)專業(yè) 袁如意 指導(dǎo)教師 溫建新摘要：從健康荷斯坦成年奶牛新鮮糞便中分離純化出1 株疑似芽孢桿菌屬菌株，編號為K。對該菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)及安全性試驗(yàn)等。試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌菌體革蘭氏染色陽性，芽孢染色為綠色，呈長桿狀，芽孢中生，橢圓；能發(fā)酵

2、糖醇，吲哚試驗(yàn)陽性，觸媒試驗(yàn)陽性，能產(chǎn)生淀粉酶，并且可以液化明膠，生化試驗(yàn)結(jié)果表明K菌為枯草芽孢桿菌；該菌對鏈霉素、青霉素、諾氟沙星、四環(huán)素耐藥性強(qiáng)，而對慶大霉素、卡那霉素、環(huán)丙沙星等抗生素表現(xiàn)敏感；動物安全試驗(yàn)表明，灌服濃度為1011cfu/mL菌液的小鼠精神狀態(tài)良好，無死亡現(xiàn)象。本試驗(yàn)為獲得反芻動物的有益菌種及研制反芻動物微生態(tài)制劑奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：反芻動物；枯草芽孢桿菌；分離；鑒定 Isolation and Identification of Bacillus subtilis Strains from RuminantsStudent majoring in veterinary m

3、edicine Yuan Ruyi Tutor Wen Jianxin Abstract： One bacillus strain was isolated and purified from the faeces of healthy Holstein named K. Morphological observation, biochemical tests, chemosensitivity test and security experiment were conducted. Experimental results showed that strain K Gram stain wa

4、s positive, spore staining was green. Its shape was a long rod-shaped bacteria, and spores was oval . Common sugar alcohols could be fermented; Indole test was positive; Catalyst test was positive; It could produce amylase; It also could liquefy gelatin. Susceptibility testing showed that the bacter

5、ia strongly resisted to streptomycin, penicillin, norfloxacin,and tetracycline and that it was sensitive to gentamicin, kanamycin and ciprofloxacin. Animal safety trials showed that Mice fed bacterias 1011cfu/mL were in good condition and no mortality. therefore, the K was identified as Bacillus sub

6、tilis strain. So it provided theoretical basis for developing probiotic preparations.Key words: ruminants; Bacillus Subtilis; isolation; identification 引言(ynyn)枯草(k co)芽孢桿菌是存在于動物腸道中的非致病需氧菌1，可降低腸道內(nèi)氧濃度，產(chǎn)生的枯草菌素、多粘菌素、短桿菌肽等活性物質(zhì)能顯著降低腸道內(nèi)大腸桿菌(d chn n jn)、沙門氏菌的數(shù)量，減少機(jī)體內(nèi)致病菌2，改善了乳酸桿菌等厭氧菌的生長環(huán)境，增加有益菌，以此來保持腸道菌群的平衡

7、，提高動物機(jī)體抗病能力。同時枯草芽孢桿菌具有耐受高溫、耐酸、耐擠壓等特點(diǎn)，在飼料加工和儲存過程中不易失活3-5。枯草芽孢桿菌菌體自身合成-淀粉酶、蛋白酶、 HYPERLINK /doc/6284399.html t _blank 脂肪酶、纖維素酶等酶類，在消化道中與動物體內(nèi)的消化酶類一同發(fā)揮作用，可將淀粉轉(zhuǎn)化為單糖，能提高動物對飼料中營養(yǎng)的消化和吸收率；其還能產(chǎn)生多種營養(yǎng)物質(zhì)如維生素、氨基酸、促生長因子等，參加機(jī)體新陳代謝，利于動物機(jī)體吸收，使動物保持健康狀態(tài)；還具有降解碳水化合物的酶如纖維素酶、葡聚糖酶6-7。枯草芽孢桿菌在養(yǎng)殖業(yè)中發(fā)揮了巨大作用，并且已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。針對雞、豬、水產(chǎn)等已

8、有大量報(bào)道，丁祥力等利用枯草芽孢桿菌WH-5凈化水產(chǎn)養(yǎng)殖廠的水10，魏姍姍等從健康仔豬空腸黏膜分離到23 株對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有拮抗作用的芽孢桿菌11，雖然枯草芽孢桿菌作為微生態(tài)制劑在反芻動物中還沒有廣泛應(yīng)用，但近年來，枯草芽孢桿菌作為微生態(tài)制劑在反芻動物養(yǎng)殖中的研究越來越多。本試驗(yàn)從健康奶牛糞便中分離鑒定枯草芽孢桿菌，以期為進(jìn)一步深入研究枯草芽孢桿菌提供參考，并為枯草芽孢桿菌作為反芻動物微生態(tài)制劑的研制和應(yīng)用提供依據(jù)。1 材料與方法1.1 樣品來源 新鮮的荷斯坦成年牛牛糞便，取自青島某奶牛養(yǎng)殖場。1.2 主要(zhyo)試劑MYP、LB培養(yǎng)基、西蒙氏檸檬酸鹽瓊脂(qingzh)、細(xì)菌

9、(xjn)微量生化鑒定管、三糖鐵瓊脂、革蘭氏染色試劑盒均購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。細(xì)菌微量生化反應(yīng)管、藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司。0.5%沙黃、5%孔雀綠溶液自配。1.3 儀器和設(shè)備SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司LED-2）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（山東龍口市先科儀器公司YY0027-90）、XSP-2C生物顯微鏡。1.4 方法1.4.1 菌株的分離純化取菌液接種于MYP培養(yǎng)基平板上，置于37恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h；挑取疑似枯草芽孢桿菌菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，將分離純化后得到的菌株命名為“菌K”。1.4.2 染色鏡檢染色采用革蘭氏染色法，見文獻(xiàn) 13。 芽孢染色采

10、用孔雀綠沙黃染色法，見文獻(xiàn) 13。1.4.3 生化試驗(yàn)按照常規(guī)試驗(yàn)方法對菌K進(jìn)行糖苷醇發(fā)酵試驗(yàn)、甲基紅（MR）試驗(yàn)、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)（VP試驗(yàn)）、淀粉水解試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、產(chǎn)類淀粉化合物測定試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、TSI試驗(yàn)、過氧化氫酶（觸酶）試驗(yàn)、KOH試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)、明膠液化等試驗(yàn)。1.4.4 16S rDNA的PCR擴(kuò)增和序列分析將菌K接種于5 mL LB肉湯中搖菌10 h，取4mL菌液10000r/min離心2min，參考精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南的方法提取DNA。在參考(cnko)了國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)后19，由華大生物工程有限公司合成了一對(y du)芽孢桿菌屬特異性引物： Primer 1：5-

11、AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3， Primer 2：5-AAGGAGGTGATCCAGCC GCA-3，預(yù)期(yq)擴(kuò)增片段長度為1436 bp。PCR反應(yīng)體系：總體系25L ，DNA模板2L，上下游引物各加1L，10 buffer 2.5L，dNTP2.5L，Taq酶0.5L，ddH2O15.5L。PCR反應(yīng)條件為：94預(yù)變性2min，95變性45s，58退火50s，72延伸1min， 72，10min，共32個循環(huán)， 4保存。PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。測序結(jié)果采用BLAST軟件和GenBank數(shù)據(jù)庫中的國內(nèi)外相關(guān)芽孢桿菌16S rDNA 的序列對比，

12、用Clustal X Method 進(jìn)行同源性比較。1.4.5藥敏試驗(yàn)按照擴(kuò)散法在MYP培養(yǎng)基上進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，見文獻(xiàn) 13 。1.4.6安全性試驗(yàn)選取體重為3040 g的小白鼠10只，每組5只。取菌液濃度約為1011cfu/mL的LB肉湯，對空腹8 h的試驗(yàn)小鼠每天一次經(jīng)口灌胃0.3 mL，同時設(shè)空白營養(yǎng)肉湯對照組。每天觀察和記錄，14 d后結(jié)束試驗(yàn)，剖檢觀察內(nèi)臟及組織器官變化。2 結(jié)果2.1 形態(tài)學(xué)觀察觀察MYP培養(yǎng)基，為干燥型菌落，灰白色，無光澤，表面粗糙。革蘭氏染色陽性，菌體呈長桿狀，芽孢中生，橢圓形，染色為綠色，菌體呈紅色。芽孢 圖2-2革蘭氏染色（1000）。圖2-3 菌K芽孢染色（

13、100）。圖2-1 菌K菌落形態(tài)（1000）。2.2 生化試驗(yàn)(shyn)結(jié)果菌K的生化(shn hu)試驗(yàn)結(jié)果見表2-1。表2-1菌K生化(shn hu)試驗(yàn)結(jié)果菌K菌K菌K葡萄糖+山梨醇+明膠液化試驗(yàn)+蔗糖+MR試驗(yàn)+觸媒試驗(yàn)+乳糖+VP試驗(yàn)-KOH試驗(yàn)-甘醇+淀粉水解+脲酶試驗(yàn)+麥芽糖+產(chǎn)類淀粉化合物測定+TSI試驗(yàn)A/A+；-蜜二糖-吲哚試驗(yàn)+木糖+檸檬酸鹽試驗(yàn)-注：“+”表示陽性，“”表示陰性；TSI（三糖鐵培養(yǎng)基）上反應(yīng)情況：斜面/底面，A：產(chǎn)酸（黃色）；K：產(chǎn)堿（紅色）；+：陽性；-：陰性。 產(chǎn)氣；H2S 根據(jù)伯杰細(xì)菌鑒定手冊14和常見細(xì)菌鑒定手冊15，上述結(jié)果均屬于芽孢桿菌屬的

14、生化特性，證明分離菌為芽孢桿菌屬。212112 圖2-4甘醇、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖發(fā)酵試驗(yàn)陽性，蜜二糖發(fā)酵試驗(yàn)陰性。1. 接種菌K 2.未接菌K對照圖2-5 山梨醇發(fā)酵試驗(yàn)陽性。1. 接種菌K 2.未接菌K對照圖2-6木糖發(fā)酵試驗(yàn)為陽性。1. 接種菌K 2.未接菌K對照2121 圖 2-8 枯草芽孢桿菌VP試驗(yàn)為陰性。1. 接種菌K 2.未接菌K對照圖2-7 接種菌K的培養(yǎng)基呈紅色，MR試驗(yàn)為陽性。1. 接種菌K 2.未接菌K對照碘液消失滴加碘液 圖2-10 5min后，革蘭氏碘液消失，菌K淀粉水解試驗(yàn)為陽性。圖2-9在淀粉培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌K菌落處滴加革蘭氏碘液。1221 圖2-12 接種

15、菌K的培養(yǎng)液滴加碘液后為淡藍(lán)色，產(chǎn)類淀粉化合物測定試驗(yàn)陽性。1. 接種菌K 2.未接菌K對照圖2-11接種菌K的試管戊醇層呈玫瑰紅色，吲哚試驗(yàn)為陽性。1. 接種菌K 2.未接菌K對照2121空白對照 圖2-14 接種菌K的三糖鐵培養(yǎng)基斜面和底面均為黃色，并且產(chǎn)氣。1. 接種菌K 2.未接菌K對照圖2-13 接種菌K的西蒙氏培養(yǎng)基仍為草綠色，檸檬酸鹽試驗(yàn)為陰性。1. 接種菌K 2.未接菌K對照21 圖2-16 KOH試驗(yàn)陰性。無拉絲現(xiàn)象，圖2-15 菌K使過氧化氫分解產(chǎn)生氣泡，觸媒試驗(yàn)陽性。1. 接種菌K 2.未接菌K對照21213 圖2-18 接種菌K的明膠20時為液體，明膠液化試驗(yàn)為陽性。1

16、. 接種菌K 2.未接菌K對照圖2-17 接種菌K的尿素酶發(fā)酵管呈淺粉紅色，脲酶試驗(yàn)陽性。1. 接種菌K 2.未接菌K對照 3.陽性對照2.3 PCR鑒定(jindng)結(jié)果對菌K進(jìn)行(jnxng)16S rDNA的PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示在1500bp左右(zuyu)有特異性條帶（如圖2-29）。 M 1 22000bp1000bp750bp500bp250bp100bp 圖 2-29 菌K的PCR擴(kuò)增結(jié)果 注：M：DL Marker 2000；1：陽性(yngxng)對照；2：菌K將分離(fnl)的菌株K的PCR產(chǎn)物送北京華大生物(shngw)公司測序，測序結(jié)果與其他從GenBa

17、nk下載的芽孢桿菌屬的相關(guān)序列進(jìn)行同源性比較。結(jié)果顯示菌株K的核酸序列與Bacillus subtilis strain CICC 10023 (GU980947.1)的同源性最高，達(dá)到了99.9 %，因此該菌株被鑒定為枯草芽孢桿菌。2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果對菌K進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，得到菌株對多種抗生素的藥敏結(jié)果，如圖2-19，圖2-20，圖2-21，圖2-22，圖2-23，圖2-24，圖2-25，并判斷菌K的耐藥性，如表2-2。 圖2-20 7、80對菌K有抑制作用，6、9、10對菌K無抑制作用。圖2-19 1、2、3、4、5、7對菌K有抑制作用，6對菌K無抑制作用。 圖2-21 11、12、13、

18、14、15、16、17對菌K均有抑制作用。圖2-22 18、19、20、21、23、 eq oac(,1)、 eq oac(,2)對菌K均有抑制作用。 圖2-23 eq oac(,4)、 eq oac(,7)、 eq oac(,8)、 eq oac(,9)對菌K有抑制作用， eq oac(,3)、 eq oac(,5)、 eq oac(,6)對菌K無抑制作用。圖2-24 eq oac(,11)、 eq oac(,12)、 eq oac(,13)、 eq oac(,14)對菌K有抑制作用， eq oac(,10)對菌K無抑制作用。圖2-25 eq oac(,15)、 eq oac(,16)、 e

19、q oac(,17)、 eq oac(,18)、 eq oac(,19)對菌K均有抑制作用。注：在“圖2-19，圖2-20，圖2-21，圖2-22，圖2-23，圖2-24，圖2-25”中，1乳酸(r sun)環(huán)丙沙星，2鹽酸環(huán)丙沙星 ，3甲磺酸培氟沙星 ，4硫氰酸紅霉素，5乙酰甲喹，6甲硝唑，7氟苯尼考， 8鹽酸(yn sun)多西環(huán)素，9鹽酸(yn sun)林可，10克林霉素，11延胡索酸泰妙菌素，12粘菌素，13頭孢他啶，14頭孢克肟，15頭孢噻肟鈉，16頭孢曲松鈉，17硫酸阿米卡星，18硫酸鏈霉素，19單硫卡，20安普霉素，21慶大霉素，23硫酸TMP， eq oac(,1)克拉霉素，

20、eq oac(,2)鏈霉素， eq oac(,3)潔霉素， eq oac(,4)氟苯尼考， eq oac(,5)青霉素， eq oac(,6)萬古霉素， eq oac(,7)新霉素， eq oac(,8)丁胺卡那霉素， eq oac(,9)復(fù)方新諾明， eq oac(,10)桿菌肽， eq oac(,11)強(qiáng)力霉素， eq oac(,12)慶大霉素， eq oac(,13)紅霉素， eq oac(,14)多粘菌素B， eq oac(,15)阿奇霉素， eq oac(,16)諾氟沙星， eq oac(,17)麥迪霉素， eq oac(,18)四環(huán)素， eq oac(,19)先鋒霉素。表2-2 枯

21、草芽孢桿菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果抗菌藥物名稱紙片含藥量（ug/片）抑菌圈直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)（mm）枯草芽孢桿菌試驗(yàn)結(jié)果RIS乳酸環(huán)丙沙星51516-202127mmS鹽酸環(huán)丙沙星51516-202126mmS氟苯尼考301213-171822mmS克林霉素21415-20217.8mmR多粘菌素30089-111219mmS頭孢噻肟鈉301415-222327mmS頭孢曲松鈉301314-202130mmS硫酸阿米卡星301415-161719.8mmS慶大霉素101213-141521mmS克拉霉素151314-22238.9mmR鏈霉素101112-14150R青霉素10IU28290R萬古霉素3015

22、1619.5mmS新霉素301314-171819mmS丁胺卡那霉素101112-131423mmS復(fù)方新諾明3.752425-31327.2mmR桿菌肽1089-121316mmS紅霉素151314-222314mmI多粘菌素B30089-111218.2mmS阿奇霉素301314-171818mmS諾氟沙星101213-16170R四環(huán)素301415-18190R先鋒霉素301415-171817.2mmI注：R耐藥、I中敏、S敏感(mngn)由表看出(kn ch)，枯草芽孢桿菌對克林霉素、克拉(kl)霉素、鏈霉素、青霉素、復(fù)方新諾明、諾氟沙星、四環(huán)素等有一定的耐藥性，其中對鏈霉素、青霉素

23、、諾氟沙星、四環(huán)素耐藥性較強(qiáng)，而對慶大霉素、卡那霉素、環(huán)丙沙星等幾種抗生素表現(xiàn)敏感。2.5 安全性試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)14 d的灌服觀察，小鼠生長狀況良好，無死亡現(xiàn)象將小鼠剖檢后內(nèi)臟組織器官無異常變化（如圖2-26，2-27，2-28），說明枯草芽孢桿菌對小鼠無毒性。 圖2-27灌服菌液的小鼠剖檢后腹腔內(nèi)臟器胃、腸、肝、腎、脾無異常變化。圖2-26 灌服菌液的小鼠剖檢后胸腔內(nèi)臟器心臟、肺無異常變化。 圖2-28 灌服LB肉湯的小鼠內(nèi)臟器官對照。3 討論(toln) 3.1 生物學(xué)特性(txng)分析本試驗(yàn)(shyn)通過對疑似芽孢桿菌的菌落進(jìn)行形態(tài)觀察、革蘭染色、芽孢染色和生化試驗(yàn)等傳統(tǒng)鑒定，證明該菌屬

24、于芽孢桿菌屬。通過分離的菌株K進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增，得到特異性條帶，測序結(jié)果和同源性分析表明，該菌鑒定結(jié)果為枯草芽孢桿菌。證明我們從奶牛糞便中分離到的菌K為枯草芽孢桿菌，此前，張紅英等16從人工飼養(yǎng)的健康三黃肉雞的盲腸和大腸中分離出的枯草芽孢桿菌。目前，牛用微生態(tài)制劑魚龍混雜，動物專屬性不強(qiáng)，常常將人、豬、禽的菌種用于牛，結(jié)果效果不明顯，我們從反芻動物的新鮮糞便分離到一株枯草芽孢桿菌為開辟反芻動物專用產(chǎn)品做一嘗試。3.2 耐藥性分析為了進(jìn)一步為研制牛專用微生態(tài)制劑奠定基礎(chǔ)，我們分別對此菌的藥敏特性進(jìn)行試驗(yàn)研究。通過對枯草芽孢桿菌40種抗生素的藥敏耐藥性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)此菌藥敏譜和耐藥譜清

25、楚，可以看出枯草芽孢桿菌對常用抗生素敏感，如環(huán)丙沙星、氟苯尼考、紅霉素、阿奇霉素等。這提示我們在臨床上使用枯草芽孢桿菌做微生態(tài)制劑時，應(yīng)注意其與抗菌藥物的配伍禁忌，以防止由于細(xì)菌對抗菌藥物的敏感作用而影響枯草芽孢桿菌作為添加劑的活性和功效。3.3 安全性分析枯草芽孢桿菌在大多數(shù)動物腸道內(nèi)被認(rèn)為是過路菌17，但在牛糞中分離到該菌，說明該菌對反芻動物的消化吸收有一定作用。為了驗(yàn)證枯草芽孢桿菌作為微生態(tài)試劑的安全性，利用該菌做了安全性試驗(yàn)，用濃度約為1011cfu/mL菌液灌服空腹8h的小鼠，兩周后小鼠沒有死亡，剖檢觀察小鼠腹腔和胸腔的器官也無病變，說明我們分離得到的枯草芽孢桿菌有較高的安全特性，為

26、此菌作為微生態(tài)制劑的研究提供了有利的依據(jù)18。4 結(jié)論本試驗(yàn)從健康奶牛糞便中分離純化出1株枯草芽孢桿菌，命名為K，為反芻動物專用微生態(tài)制劑的研究奠定良好基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)： 1 Singh V P，Sharma J，Babu S，et al.Role of probiotics in health and disease：a review J.J Pak Med Assoc，2013，63（2）：253-257.2 Jirillo E，Jirillo F,Magrone，T.Healthy effects exerted by prebiotics，probiotics，and symbiotic

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