HPV疫苗的制備

1、HPV疫苗的制備及作用效果HPV是一類能夠感染皮膚和粘膜的DNA病毒。高危型HPV是宮頸癌以及癌前病變 的要致病因子，99.7%的宮頸癌組織都檢測(cè)出高危型HPV。針對(duì)HPV感染，人類自身所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答主要分為體液免疫和細(xì)胞免疫。體液免疫 主要表現(xiàn)為HPV刺激機(jī)體B細(xì)胞產(chǎn)生抗HPV L1、L2蛋白的抗體，但是由于產(chǎn)生抗體 的量特別少，所以很難檢測(cè)到這些特異性抗體，阻礙了人們對(duì)體液免疫的相關(guān)研究。細(xì)胞免 疫主要表現(xiàn)為T細(xì)胞受HPV刺激后通過釋放淋巴因子來殺死感染病毒的細(xì)胞1, 2。目前預(yù)防和治療HPV相關(guān)癌癥最有效的方法是研制其特異性的HPV疫苗，誘導(dǎo)機(jī)體 產(chǎn)生中和抗體，激發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)，以達(dá)

2、到預(yù)防HPV相關(guān)癌癥發(fā)生和傳播的目的，既可 以降低宮頸癌的發(fā)病率，也可降低與HPV感染有關(guān)的其它癌癥的發(fā)病率。人類乳頭瘤病毒（HPV）是一種無包膜的雙鏈閉環(huán)小分子DNA病毒，屬乳頭多瘤空病毒 科乳頭瘤病毒屬。其基因約8kb，只有1條DNA鏈可作為轉(zhuǎn)錄模板，含8個(gè)開放閱讀框（open reading frames， ORFs），分 3 個(gè)基因區(qū)，即早期區(qū)（early region， E 區(qū)）、晚期區(qū)（late region， L區(qū)）與非編碼區(qū)（uncoding region， UCR） 或上游調(diào)控區(qū)（URR）。E區(qū)編碼 E1，E2, E4, E5，E6，E7等早期蛋白，參與病毒DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄

3、、翻譯調(diào)控和轉(zhuǎn)化等功 能；L區(qū)編碼主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2； UCR區(qū)含有HPV基因組復(fù)制起點(diǎn)和HPV 表達(dá)所必需的調(diào)控元件。由HPV產(chǎn)生的兩種癌蛋白是E6和E7,可以抑制細(xì)胞周期負(fù)調(diào) 節(jié)因子的活性，并可以在腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá)。而晚期基因則編碼衣殼的結(jié)構(gòu)蛋白，其中主 要衣殼蛋白L1結(jié)構(gòu)保守，是HPV衣殼的主要成分，約占衣殼蛋白的80%以上，因此成為 理想的預(yù)防免疫靶位?；贖PV的致病機(jī)制和天然的免疫原性，HPV疫苗研究聚焦于L1、E2、 E5、E6 和 E7。目前HPV的疫苗主要分為預(yù)防性疫苗和治療性疫苗。預(yù)防性疫苗主要誘導(dǎo)機(jī)體體液免疫 反應(yīng)，產(chǎn)生的中和性抗體在HPV進(jìn)入機(jī)體前即能

4、與病毒的抗原結(jié)合，從而防止HPV的感染。 治療性疫苗主要引起機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)，產(chǎn)生的活化效應(yīng)性T細(xì)胞能識(shí)別和攻擊HPV感 染的細(xì)胞，其中也包括HPV引起的惡性腫瘤細(xì)胞。（一）HPV預(yù)防性疫苗預(yù)防性疫苗的制備依據(jù)及過程預(yù)防性疫苗一般以HPV主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2為靶抗原3,其作用在于 誘發(fā)肌體產(chǎn)生特異性的中和抗體和有效的局部免疫反應(yīng)以阻止HPV的長(zhǎng)期感染和再感 染。HPV的衣殼蛋白在真核以及原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)時(shí)，能自我裝配或形成病毒樣顆粒 （virus-like particles, VLPs）,其結(jié)構(gòu)和抗原表位與天然的病毒顆粒十分相似，將其置入機(jī)體后 可刺激產(chǎn)生中和抗體IgG和I

5、gA4，達(dá)到預(yù)防相應(yīng)型別HPV的感染，而且不包括病毒 DNA，安全性好，能有效地保護(hù)人類和動(dòng)物免受乳頭瘤病毒的感染以及產(chǎn)生相關(guān)腫瘤的可 能性5,6。VLPs顆粒直徑為50-55nm，分子量為55-60kDa，VLPs是由純化的L1蛋白裝配 形成HPV的空衣殼。VLPs的最小結(jié)構(gòu)單元是L1蛋白單體，L1蛋白主要是由8條反向 平行的0折疊肽鏈段構(gòu)成的，它們之間是由無規(guī)則的環(huán)形區(qū)（loop）連接在一起的，每個(gè)環(huán) 形區(qū)大約有1030個(gè)氨基酸（aa），這些區(qū)域絕大部分延伸到五聚體和病毒顆粒的外表面， 是抗原表位的所在區(qū)域7-9；不同型別HPV環(huán)形區(qū)的序列和空間結(jié)構(gòu)是不同的，所以HPV 具有高度的型別特異

6、性。因此，目前對(duì)于HPV抗原表位的研究主要集中在L1蛋白的環(huán) 形區(qū)上10。國(guó)內(nèi)外有多家機(jī)構(gòu)在進(jìn)行HPV疫苗的研究及其制備，大部分都是以L1和（或）L2 蛋白為靶標(biāo)進(jìn)行制備的（單獨(dú)表達(dá)L1或者聯(lián)合表達(dá)L1+L2,獲得病毒樣顆粒（VLP）。一般 步驟都是針對(duì)HPV L1和（或）L2蛋白的核酸序列為基礎(chǔ)，對(duì)其進(jìn)行改造優(yōu)化（例如密碼子優(yōu)化，刪除部分序列，替換某個(gè)/些堿基，連接其他基因等），擴(kuò)增或者合成優(yōu)化后的序列， 然后將其克隆到表達(dá)載體上，并在原核系統(tǒng)（例如大腸桿菌）或者真核系統(tǒng)（例如昆蟲細(xì)胞， 酵母，哺乳動(dòng)物細(xì)胞等）進(jìn)行表達(dá)，再將表達(dá)的單個(gè)蛋白或者融合蛋白分離純化，添加佐劑 后制成疫苗，通過將制成

7、的疫苗免疫小鼠或者其他動(dòng)物對(duì)其免疫原性進(jìn)行評(píng)價(jià)，效果較好的 進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)。已經(jīng)被批準(zhǔn)上市的預(yù)防性疫苗目前已經(jīng)被批準(zhǔn)上市的預(yù)防性HPV疫苗有兩種，它們分別是英國(guó)葛蘭素（GlaxoSmithKline， GSK）公司的雙價(jià)疫苗 “Cervarix” 和美國(guó)默克（Merck & Co., Inc.）公 司生產(chǎn)的四價(jià)疫苗“Gardasil”（商品名）11。隨著這兩種疫苗的上市，人們對(duì)宮頸癌疫苗 的研究主要集中在HPV VLPs疫苗上。2006年，“Gardasil”被批準(zhǔn)上市，這是第一個(gè)商品 化的宮頸癌預(yù)防性疫苗，它是由兩個(gè)高危型 HPV16、18和兩個(gè)低危型HPV6、11的 L1-VLPs組成的重組

8、混合型疫苗，它們使用釀酒酵母體系產(chǎn)生 VLPs，佐劑為氫氧化鋁（225ug）。2007年，英國(guó)葛蘭素公司的“Cervarix”（商品名）疫苗上市12，它是HPV16、 18的L1-VLPs組成的重組混合型疫苗，利用重組桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞（粉紋夜蛾）產(chǎn) 生VLPs，佐劑為傳統(tǒng)鋁鹽（500ug）加上AS04（50ug）13, 14。這兩種疫苗都是預(yù)防性的， 不是治療性的，主要接種于未發(fā)生HPV感染的人群，用來預(yù)防HPV感染以及相關(guān)疾病的 發(fā)生。這兩種疫苗的抗原都是HPV主要衣殼蛋白的L1。臨床試驗(yàn)結(jié)果證明，上述疫苗均具 有良好的耐受性，且沒有嚴(yán)重的不良反應(yīng)，抗體效價(jià)比自然感染HPV的患者高50

9、倍。此外， 最近 Merck公司又研發(fā)出了 Gardasil九價(jià)預(yù)防性疫苗（HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58）。 Gardasil已在117個(gè)國(guó)家或地區(qū)被批準(zhǔn)使用，全球33個(gè)國(guó)家多中心的聯(lián)合試驗(yàn)結(jié)果表明， 疫苗對(duì)宮頸癌、癌前病變以及其他生殖道疾病的預(yù)防作用可達(dá)99%100%； Cervarix疫苗 對(duì)HPV16和HPV18所致CIN 11、111的保護(hù)效力達(dá)到100%； Merck公司的九價(jià)疫苗已經(jīng) 于2015年進(jìn)入三期臨床試驗(yàn)。二價(jià)疫苗針對(duì)HPV16、18產(chǎn)生的保護(hù)性抗體均可維持100% 的血清陽性至少8.4年15；四價(jià)疫苗針對(duì)HPV16產(chǎn)生的保護(hù)性抗體能維持98.8

10、%的血清 陽性至少5年口。其他處于研究階段的預(yù)防性疫苗（部分）Xie等17在桿狀病毒昆蟲細(xì)胞中表達(dá)純化了 HPV 16,18,58 LI VLPs，對(duì)各型VLPs進(jìn) 行了純度、形態(tài)學(xué)及免疫原性的研究，特別是HPV58L1 VLPs誘發(fā)長(zhǎng)期中和抗體活性及協(xié) 同A1（0H）3佐劑的相關(guān)研究。在此基礎(chǔ)上，表達(dá)及純化了以HPV16L1 VLPs為載體的嵌合各 種HPV 16 L2保守表位的雜合蛋白，并對(duì)影響雜合L1組裝能力及其誘發(fā)中和抗體活性的 因素進(jìn)行了研究。HPV LI VLPs免疫小鼠測(cè)定ED50，將HPV 16,18,58 LI VLPs單獨(dú)或混合 免疫小鼠誘發(fā)了較高滴度的針對(duì)組成型別的中和抗

11、體，表明HPV16,18,58 LI VLPs免疫原性 很強(qiáng)。韓國(guó)的金洪珍等18通過優(yōu)化16型和18型的HPV序列，構(gòu)建至pUCminvsMCS載體 及YEG-MCS酵母表達(dá)載體，以釀酒酵母為宿主菌進(jìn)行表達(dá)，通過肝素層析和陽離子交換層 析進(jìn)行表達(dá)蛋白的純化并進(jìn)行濃縮。純化得到的蛋白添加佐劑后免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)組合佐劑增 加了免疫刺激效果，總IgG效價(jià)增高。該藥物疫苗組合物可比常規(guī)疫苗（包括CervarixTM 及GardasilTM）誘導(dǎo)更強(qiáng)的針對(duì)HPV的免疫應(yīng)答，因而具有優(yōu)良的宮頸癌預(yù)防功效。此外， 該藥物疫苗組合物由于用作免疫佐劑的脫?；姆嵌拘訪OS幾乎無細(xì)胞毒性而具有優(yōu)良 安全性。該藥物

12、疫苗組合物比施用CervarixTM及GardasilTM顯著提高與Th1型免疫應(yīng)答 （細(xì)胞免疫）相關(guān)的干擾素-Y、IgG2a及IgG2b水平，以及與Th2型免疫應(yīng)答（體液免疫） 相關(guān)的IgG1水平。總體來說，本藥物疫苗組合物可誘導(dǎo)均優(yōu)于CervarixTM及GardasilTM 的針對(duì)HPV的Th1型免疫應(yīng)答（細(xì)胞免疫）及Th2型免疫應(yīng)答（體液免疫）。廈門大學(xué)的李少偉等19對(duì)全長(zhǎng)HPV31L1基因依照大腸桿菌密碼子偏嗜性進(jìn)行優(yōu)化（片段全長(zhǎng)為1515bp,終止密碼子為TAA）,由上海博亞公司合成該基因，酶切后與非融合 表達(dá)載體pTO-T7連接，轉(zhuǎn)入ER2566大腸桿菌，用50L的發(fā)酵罐進(jìn)行大規(guī)

13、模培養(yǎng)，用IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，之后分離純化（HPV31Ctag-L1的陽離子交換色譜）L1蛋白，對(duì)得到的蛋 白通過Western和質(zhì)譜進(jìn)行鑒定，用CENTRASETTE5切向流系統(tǒng)對(duì)L1蛋白進(jìn)行組裝，對(duì) HPV31L1病毒樣顆粒進(jìn)行透射電鏡觀察和動(dòng)態(tài)光散射檢測(cè)。將制得的該病毒樣顆粒稀釋至 0.1mg/ml，然后加入等體積的完全弗氏佐劑等體積的不完全弗氏佐劑，免疫小鼠/兔子后進(jìn) 行免疫保護(hù)性的評(píng)價(jià)。發(fā)現(xiàn)通過該方法獲得的HPV31-L1病毒樣顆粒具有良好的免疫原性， 可在動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)高滴度的中和抗體，從而可用作預(yù)防HPV31感染的疫苗。馬潤(rùn)林等20克隆了 HPV16 L1衣殼蛋白基因，進(jìn)行修飾

14、（堿基替代）后在大腸桿菌中表 達(dá)（表達(dá)質(zhì)粒為pGEX-6-1，表達(dá)菌株為BL21），分離，經(jīng)親和色譜純化重組HPV16L1蛋 白五聚體（該五聚體與HPV16 L1蛋白的VLP具有相同的免疫原性和抗原性），將所得重組 HPV16 L1蛋白五聚體與輔料（佐劑包括呂鹽/3-O-去?；瘑瘟姿犷愔?脂質(zhì)A衍生物，賦型 劑包括生理水以及其它藥物上可接受的賦型劑，穩(wěn)定劑包括基于磷酸鹽的生理緩沖液）混合 制劑，得到16型重組人乳頭瘤病毒疫苗。具體步驟為將純化的HPV16 L1的五聚體與100mM NaCl的標(biāo)準(zhǔn)磷酸緩沖液混合（pH7.2），加入150ug氫氧化鋁，調(diào)整五聚體濃度至10業(yè)/支， 制成疫苗。動(dòng)物安

15、全性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重組HPV16疫苗對(duì)供試動(dòng)物未發(fā)現(xiàn)任何可觀測(cè)到的急性毒 性和異常毒性，全部毒性檢測(cè)指標(biāo)為陰性。動(dòng)物有效性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)組HPV16疫苗能誘導(dǎo)供試 動(dòng)物產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗體保護(hù)反應(yīng)，抗體有效中濃度ED0在0.4-2.0微克，抗原的免疫原性及抗 體的滴度水平很高。（二）HPV治療性疫苗在感染HPV所引起的的惡性腫瘤細(xì)胞中，病毒DNA整合到宿主細(xì)胞DNA中，結(jié)果導(dǎo) 致E6、E7基因異常過量表達(dá)而使細(xì)胞無限增殖，并最終向惡性轉(zhuǎn)化；同時(shí)，晚期蛋白L1、 L2基因會(huì)斷裂丟失，使其不能表達(dá)或僅有部分蛋白被低水平表達(dá)而難以檢測(cè)到，因此預(yù)防 性疫苗對(duì)已經(jīng)感染HPV并引起癌前病變的的患者沒有保護(hù)能力，不能使他們被

16、治愈。研究 表明，HPV感染引發(fā)的癌前病變以及癌癥的發(fā)生主要是由HPV E6、E7的協(xié)同作用所致， 因此針對(duì)E6、E7為靶抗原的HPV治療性疫苗成為研究的重點(diǎn)21, 22,23, 24。治療性疫苗的制備主要依據(jù)由于HPV E6/E7蛋白具有致癌性，將這兩種蛋白直接應(yīng)用于治療宮頸癌時(shí)會(huì)存在疫苗的 安全隱患，通常對(duì)關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行突變以降低致癌性。通過對(duì)HPVE6蛋白和E7蛋白結(jié)構(gòu)功能 和突變體的深入研究，可以有靶向性地對(duì)E6和E7基因進(jìn)行突變和改造，消除E6蛋白和E7 蛋白的致癌能力和轉(zhuǎn)化活性，從而降低了將HPV E6/E7蛋白應(yīng)用于治療性疫苗開發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)， 保證安全性。對(duì)HPV E6/E7基因進(jìn)行突

17、變，使其失去致癌性，同時(shí)保留免疫原性是研制宮頸 癌治療性疫苗的主要手段之一25。治療性疫苗的種類及制備HPV治療性疫苗的類型主要有：多肽/蛋白質(zhì)疫苗26、活病毒載體疫苗、DNA疫苗、 RNA疫苗27。目前尚無有效的HPV治療性疫苗問世。但重組蛋白疫苗、多肽疫苗已進(jìn) 入二期臨床試驗(yàn)，并顯示出良好的前景。蛋白疫苗：多肽/蛋白疫苗是采用腫瘤特異性的多肽片段或抗原蛋白作為疫苗直接免疫 機(jī)體，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗原特異性的CTL反應(yīng)來殺傷腫瘤細(xì)胞。Chen等首先證實(shí)，HPV16 E7 免疫動(dòng)物可獲得特異性CD8陽性淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤排斥反應(yīng)。Bermudez Humaran等28 通過乳酸乳球菌生產(chǎn)HPV16

18、 E7蛋白。多肽疫苗：多肽疫苗的作用原理與蛋白疫苗類似Liu等構(gòu)建了一種新型的疫苗E7蛋 白CTL表位4462和熱休克蛋白（Hsp70 ）的融合多肽疫苗29，使用rAAV作為載 體，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中顯示出良好的腫瘤保護(hù)作用，轉(zhuǎn)染效率高，且使用rAAV可使作用延至l5年， 避免反復(fù)使用及由此產(chǎn)生的中和抗體?；钶d體疫苗：活載體疫苗是將腫瘤特異性抗原蛋白的基因插入活載體（細(xì)菌或病毒等）， 高效表達(dá)抗原從而刺激抗原特異性的免疫反應(yīng)?；钶d體疫苗免疫原性高，作為抗原載體的免 疫刺激效果好。但是，活載體可能有潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)，尤其是對(duì)于免疫功能不全的患者。常 用疫苗的載體主要有病毒（牛痘病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒和a

19、病毒等），細(xì)菌等。Li等30 采用天壇牛痘株構(gòu)建了表達(dá)HPV16和18 E6/E7蛋白的重組牛痘病毒疫苗rVVJ 16/18 E7E6, 在對(duì)小鼠和恒河猴的研究中，該疫苗均顯示細(xì)胞免疫反應(yīng)，而且對(duì)小鼠的腫瘤移植保護(hù)實(shí)驗(yàn) 也顯示出一定的效果。田厚等31，將HPV16型早期蛋白E7、E6編碼區(qū)基因融合，并將 E7、E6編碼區(qū)基因進(jìn)行改造修飾去除其轉(zhuǎn)化活性，保留抗原性，再根據(jù)哺乳細(xì)胞使用密碼 子的偏嗜性設(shè)計(jì)其相應(yīng)的優(yōu)勢(shì)密碼子核酸序列交給公司合成。將合成的經(jīng)密碼子優(yōu)化過的 E7E6融合基因插入到腺病毒重組載體質(zhì)粒pCD316中，與Ad5病毒載體骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293 細(xì)胞，經(jīng)純化并進(jìn)行E7E6融合基因及蛋白的鑒定，篩選出表達(dá)人乳頭瘤病毒HPV16型E7E6 融合蛋白的重組腺病毒rAd5HPV16SmE7E6，擴(kuò)增重組病毒，經(jīng)動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)，表明所制 備出的重組腺病毒rAd5HPV16SmE7E6具有免疫活性，其能夠誘發(fā)免疫動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)HPV16E7 的特異性T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)有明顯抑制作用。DNA疫苗：Smahel等使用修飾了的HPV16E7基因DNA疫苗進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)32，在E7 基因Rb結(jié)合點(diǎn)加入3個(gè)突變位點(diǎn)GGG，實(shí)驗(yàn)對(duì)比4種疫苗的作用：E7、ETGGG及2種融合 基因L16c E