Menke體外產(chǎn)氣法講課講稿

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。Menke體外產(chǎn)氣法-Menke體外產(chǎn)氣法（Syringe系統(tǒng)）管子（一）基礎(chǔ)知識體外產(chǎn)氣法主要理念通過體外產(chǎn)氣裝置模擬瘤胃發(fā)酵體外產(chǎn)氣系統(tǒng)組成體外產(chǎn)氣裝置：產(chǎn)氣管（相當(dāng)于獨(dú)立的瘤胃）、恒溫水浴搖床（模擬瘤胃溫度和蠕動速度）；微生物培養(yǎng)液：由瘤胃液與人工唾液按1:2的體積比混合，攪拌均勻而成影響實驗成敗的主要因素實驗過程中產(chǎn)氣裝置的溫度，整個操作過程的厭氧狀態(tài)、微生物活力是影響實驗成敗的關(guān)鍵（二）試驗前準(zhǔn)備試配產(chǎn)氣管=1*GB3更換注入口處老化的塑膠管；=2*GB3試配外管和內(nèi)塞，要求推拉自如又不過松（

2、現(xiàn)已將可匹配的外管和內(nèi)塞統(tǒng)一編號，依號裝配即可）。稱量樣品=1*GB3產(chǎn)氣管編號；=2*GB3用自制的帶長柄的稱量紙，準(zhǔn)確稱取待測樣品約200mg（DM），置于體外產(chǎn)氣管底部，注意不要讓樣品進(jìn)入產(chǎn)氣管注入口和沾染30ml以上管壁；=3*GB3樣品稱取完畢后，管塞上均勻涂抹凡士林，將管塞塞回對映的外管，扣好夾子。配制原液正式實驗前一天，配制好人工唾液中的微量元素溶液（A液）、緩沖液（B液）、常量元素溶液（C液）和刃天青溶液（D液）（可過量配制，常溫下存放，配制方法見附表1）。其它=1*GB3調(diào)試恒溫水浴搖床的溫度至390.5，搖動速度510轉(zhuǎn)/min，如果使用兩個恒溫水浴搖床要求兩者溫度和搖動速

3、度盡量一致，另外還需要將一多聯(lián)水浴鍋溫度調(diào)至390.5（以實際量取溫度為準(zhǔn)）；=2*GB3準(zhǔn)備二層、四層、六層紗布各2-4塊（紗布可重復(fù)使用）；=3*GB3貯備兩瓶熱水，準(zhǔn)備收集瓶（收集和過濾瘤胃液用）、水桶、溫度計，以備次日取瘤胃液用。（三）正式試驗配制人工唾液=1*GB3將恒溫水浴搖床、多聯(lián)水浴鍋打開后；=2*GB3計算人工唾液需要量：體外培養(yǎng)時每根產(chǎn)氣管內(nèi)微生物培養(yǎng)液的體積是30ml（10ml瘤胃液和20ml人工唾液），依據(jù)試驗設(shè)計的產(chǎn)氣管數(shù)計算人工唾液和瘤胃液的需要量（預(yù)留20%，以備操作手法不當(dāng)造成浪費(fèi)）；=3*GB3配制還原劑（E液，見附表1）；=4*GB3按附表2的順序和比例將配

4、制好的各原液混合后，置入水浴搖床或水浴鍋內(nèi)，通入CO2氣體（氣流不易過大），使人工唾液由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t色，最終為無色。采集與處理瘤胃液為方便讀取12h產(chǎn)氣量，瘤胃液最好在7:30前取回。所取瘤胃液為早飼前2h瘤胃液。=1*GB3到牧場后，將熱水倒入水桶，調(diào)節(jié)水溫度至390.5，用于瘤胃液保溫（應(yīng)經(jīng)常用熱水調(diào)節(jié)）；=2*GB3用真空泵抽取三只湖羊的瘤胃液，混合，倒入收集瓶（注意蓋上瓶蓋，以防氧氣對微生物的影響）；=3*GB3回到實驗室后，將收集瓶置于水浴鍋內(nèi)，四層紗布過濾（應(yīng)盡量快，以保持微生物的活力），獲得的濾液用CO2氣體飽和；=4*GB3用量筒量取所需量的無色人工唾液和瘤胃液混合，不間斷地

5、通入CO2氣體。吸取微生物培養(yǎng)液用空的產(chǎn)氣管吸取微生物培養(yǎng)液30ml，通過三通管推入已經(jīng)裝有樣品的產(chǎn)氣管。記錄初始微生物培養(yǎng)液量排氣過程：將注入口處夾子打開的同時，用手下拉管塞，以防樣品沖入塑膠管；搖晃產(chǎn)氣管使樣品與瘤胃液混合后，旋轉(zhuǎn)管塞，排出管內(nèi)空氣；讀數(shù)：將產(chǎn)氣管豎直，注入口向下，讀取刻度。排氣后的產(chǎn)氣管應(yīng)隨機(jī)置于恒溫水浴搖床內(nèi)培養(yǎng)（搖床在操作過程中處于搖動狀態(tài)，以免溫度上升）。空白對照和標(biāo)準(zhǔn)對照實驗過程中要有至少3個空白對照和3個標(biāo)準(zhǔn)干草對照（樣多時，對照一定要多，尤其是空白對照）。空白對照不加樣品直接加入30ml微生物培養(yǎng)液，標(biāo)準(zhǔn)干草對照以200mg（DM）干草（優(yōu)質(zhì)的過80目篩的羊草

6、）為底物，加入30ml微生物培養(yǎng)液。為了消除操作順序和恒溫水浴搖床條件的差異，要求空白對照和標(biāo)準(zhǔn)對照平均分布于試驗前期、中期和后期，放置于水浴搖床的不同位置。整個過程要盡量快，特別是吸培養(yǎng)液和排氣，最好不要超過15min記錄產(chǎn)氣量培養(yǎng)2、4、6、9、12、24、36、48、72、96h時（試驗樣品為粗料，一般培養(yǎng)到72h或96h；精料一般培養(yǎng)到24h或48h即可終止培養(yǎng)，若要計算產(chǎn)氣常數(shù)，一般要72h），記錄產(chǎn)氣管的刻度讀數(shù)（讀數(shù)時輕搖產(chǎn)氣管，旋動管塞后讀數(shù)，讀數(shù)時，以管塞刻度的中部為準(zhǔn)）。如果產(chǎn)氣量過多，下一時間點(diǎn)產(chǎn)氣量可能超出刻度范圍，則需放氣，其操作與排氣相同。產(chǎn)氣量計算（管子）式中，G

7、Pt為樣品在t時刻的產(chǎn)氣量（ml）；Vt為樣品發(fā)酵t小時后，產(chǎn)氣管刻度讀數(shù)（ml）；V0為樣品在開始培養(yǎng)時產(chǎn)氣管刻度讀數(shù)（ml）；W為樣品干物質(zhì)重（mg）；GP空白為空白對照在t時刻的產(chǎn)氣量，其計算方式與GPt一致。重復(fù)試驗要求體外產(chǎn)氣試驗至少培養(yǎng)兩次，兩次標(biāo)準(zhǔn)干草產(chǎn)氣量相對偏差小于10%（若標(biāo)準(zhǔn)干草產(chǎn)氣量與實驗室積累的平均值29.5相差太大，應(yīng)考慮重作，檢查動物狀況）。(四)樣品采集測定項目取樣時間取樣部位取樣量重復(fù)數(shù)處理保存溫度VFA實際需要上清液1ml-加入0.2ml8.2%偏磷酸，20000g離心10min4NH3-N24或48h混合液5ml-20MCP24或48h混合液24ml-20

8、附表1：人工唾液原液配制表A、微量元素溶液：CaCl2.2H2O13.2g;MnCl2.4H2O10.0g;CoCl2.6H2O1.0g;FeCl3.6H2O8.0g;加蒸餾水至100mlB、緩沖液：NH4HCO34.0g;NaHCO335.0g;加蒸餾水至1000mlC、常量元素溶液：Na2HPO4.12H2O9.45gKH2PO46.2gMgSO4.7H2O0.6g加蒸餾水至1000mlD、0.1%刃天青溶液：100mg刃天青溶解于100ml蒸餾水E、還原劑溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）：1MNaOH4.0mlNa2S9.H2O625mg加蒸餾水95ml附表2：人工唾液配制表（1000ml）順序原液體積

9、（ml）1蒸餾水520.22微量元素溶液（A液）0.13緩沖液（B液）208.14常量元素溶液（C液）208.150.1%刃天青溶液（D液）1.06還原劑溶液（E液）62.4嘌呤法測定體外微生物蛋白產(chǎn)量標(biāo)準(zhǔn)曲線制備樣品處理5、15、25、35、45、55mg酵母90-95水浴1h加入2ml0.6MHClO48ml發(fā)酵液420000g20min沉淀2.104ml0.6MHClO4加入冷卻加入6ml28.5mMNH4H2PO490-95水浴15min冷卻43000g10min上清液1.6ml加入6ml0.2MNH4H2PO4用85%磷酸調(diào)整溶液pH為23溶液3.8ml加入0.2ml0.4MAgNO

10、35避光、過夜43000g10min沉淀4.5mlpH=2的蒸餾水沖洗43000g10min沉淀加入5ml0.5MHCl90-95水浴30min43000g10min上清液0.5MHCl稀釋40倍0.5MHCl作參比260nm下比色（一）操作流程圖（二）試劑配制及具體操作1、試驗試劑A0.2M磷酸二氫銨23g磷酸二氫銨溶解于700ml蒸餾水，定容至1000mlBpH=2的蒸餾水在蒸餾水中加少許硫酸至pH=2C0.4M硝酸銀準(zhǔn)確稱取1.6987g硝酸銀，溶解于15ml蒸餾水中，待完全溶解后定容至25ml。溶液需用棕色瓶存放，避光保存，并外覆不透光的黑紙D0.5M鹽酸用蒸餾水稀釋10ml鹽酸（37

11、%）至240mlE28.5mM磷酸二氫銨用蒸餾水稀釋100ml0.2M磷酸二氫銨至700mlF85%磷酸G0.6M高氯酸用蒸餾水稀釋10ml高氯酸（70%，12M）至200ml2、測定步驟A酵母RNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:分別稱取5、15、25、35、45、55mg酵母RNA于10ml離心管中，并加入2ml0.6MHClO4，于90-95水浴1小時，冷卻；再分別加入6ml28.5mMNH4H2PO4，于90-95水浴15min，冷卻后在3000g，4條件下離心10min；取1.6ml上清液，向上清夜中加入6ml0.2MNH4H2PO4溶液，并用85%磷酸調(diào)整溶液pH為23（一般需85%磷酸25l）；

12、取調(diào)整pH值后的溶液3.8ml，并向其中加入0.2ml0.4MAgNO3，混合，于5條件下避光、過夜；過夜后于3000g，4條件下離心10min，棄上清液；用4.5mlpH=2的蒸餾水沖洗沉淀；再于3000g，4條件下離心10min，棄上清液；向沉淀中加入5ml0.5MHCl溶液，混勻，在90-95條件下水浴30min后，以3000g離心10min；上清液用0.5MHCl稀釋40倍后，以0.5MHCl溶液作參比，在260nm下比色，根據(jù)光密度值作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。B培養(yǎng)液中微生物蛋白質(zhì)的測定:取8ml均勻發(fā)酵液于3個10ml離心管，在20000g，4條件下離心20min；棄上清液后加入2.104ml

13、0.6MHClO4，于9095水浴1小時，冷卻；按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟-操作；以0.5MHCl溶液作參比，在260nm下比色，根據(jù)光密度值和標(biāo)準(zhǔn)曲線求出RNA測定值；根據(jù)下面公式計算微生物蛋白氮產(chǎn)量：微生物蛋白氮（mg/ml）=RNA測定值（mg/ml）RNA含氮量稀釋倍數(shù)細(xì)菌氮中RNA含氮量其中，RNA含氮量為17.83%，細(xì)菌氮中RNA含氮量為10%。浙江大學(xué)奶業(yè)科學(xué)研究所比色法測定培養(yǎng)液氨態(tài)氮濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線制備樣品處理0.4ml標(biāo)準(zhǔn)系列溶液加入=1*GB35ml發(fā)酵液3500-4000rpm10min2ml上清液8ml0.2MHCl加入取0.4ml混合液=2*GB3加入2mlE液搖勻、靜置

14、10min0號管液作參比700nm下比色搖勻2mlD液保存液工作液（一）操作流程圖（二）試劑配制及具體操作1試驗試劑A0.2M鹽酸溶液將18ml濃鹽酸用蒸餾水稀釋到1000mlB14%水楊酸鈉溶液稱取14g水楊酸鈉，用蒸餾水溶解，定容至100mlC0.3M氫氧化鈉溶液1.2g氫氧化鈉用蒸餾水溶解并定容至100mlDD液稱取0.08g亞硝基鐵氰化鈉溶解于100ml14%水楊酸鈉溶液中EE液量取2ml次氯酸鈉溶液（商品名安替福明，含活性氯5.2%），混于100ml0.3M氫氧化鈉溶液中搖勻2測定步驟A、氨氮標(biāo)準(zhǔn)系列溶液制備準(zhǔn)確稱量0.382g氯化銨，用0.2M鹽酸溶解，并定容到100ml，作為保存

15、液，在冰箱中可存放數(shù)月。取保存液10ml，用蒸餾水稀釋定容至100ml，為工作液。含氮量為10mg/100ml。取工作液0、1、2、4、6ml置于5個編號的50ml容量瓶內(nèi)，接著分別加入蒸餾水10、9、8、6、/4ml，使之都成為10ml，再用0.2M鹽酸定容。這就是每100ml中含氮量為0、0.2、0.4、0.8、1.2mg的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。B、比色與計算準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液0.4ml分置于5個10ml試管內(nèi)，各管中再依次加入D液和E液2ml，搖勻，靜置10分鐘后比色。波長700nm，0.5cm的比色皿，用不含氮的0號管液作空白對照。記錄各消光值。用消光值作自變量，溶液含氮量作從變量導(dǎo)出回歸方

16、程式。樣品處理：取5ml瘤胃培養(yǎng)液在3500-4000轉(zhuǎn)/分下，離心10分鐘，量取2ml上清液（若含氮量較高，可取1ml上清液再加1ml蒸餾水），置于15ml試管內(nèi)，再加入8ml0.2M鹽酸至10ml搖勻（稀釋倍數(shù)為5或10）。比色操作同：準(zhǔn)確量取各溶液0.4ml置于10ml試管內(nèi)，各管內(nèi)再依次加入D液和E液2ml，搖勻，靜置10分鐘后比色。波長700nm，0.5cm的比色皿，用不含氮的0號管液作空白對照。記錄各消光值。把測得的消光值代入回歸公式，計算的結(jié)果乘以樣品稀釋的倍數(shù)就是原樣中氨氮的含量。浙江大學(xué)奶業(yè)科學(xué)研究所體外發(fā)酵產(chǎn)物中揮發(fā)性脂肪酸濃度的測定單標(biāo)測定乙、丙、丁酸各自保留時間混標(biāo)制備

17、標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品中乙、丙、丁酸濃度測定（一）操作流程圖（二）試劑配制及具體操作1混標(biāo)制備按表1或表2中梯度，配制6個梯度的混合標(biāo)樣，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。表1乙酸、丙酸和丁酸混合標(biāo)樣的配制（umol/ml）123456乙酸10204080160320丙酸12481632丁酸12481632表2乙酸、丙酸和丁酸混合標(biāo)樣的配制（ul/ml）123456乙酸0.5711.1432.2854.5709.14018.280丙酸0.0750.1490.2990.5981.1962.390丁酸0.0920.1840.3670.7351.4702.9392上機(jī)測定色譜柱HP-INNOWAX（19091N-133）毛細(xì)

18、管柱，30m0.25mm0.25m氣化室溫度200檢測室溫度220柱溫采用程序升溫，80持續(xù)1min后，以15/min升溫至170后維持1.5min載氣及流速載氣為高純氮，壓力為100kpa，總流量63.8ml/min，柱流量1.19ml/min，分流比50，吹掃流量3ml/min，循環(huán)流量30ml/min檢測室氣體流速H2流量40ml/min，空氣流量400ml/min進(jìn)樣量2l浙江大學(xué)奶業(yè)科學(xué)研究所發(fā)酵氣體中甲烷含量的測定（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線建立用10l的微量注射器分別抽取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0l的甲烷標(biāo)準(zhǔn)氣，上機(jī)，根據(jù)甲烷的濃度和其峰面積的關(guān)系，確定甲烷的標(biāo)準(zhǔn)曲線。由于

19、在測定發(fā)酵氣體時取樣量是20l，故設(shè)定1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0l的甲烷標(biāo)準(zhǔn)氣的濃度分別為5、10、15、20、25、30%。（二）上機(jī)條件色譜柱HP-INNOWAX（19091N-133）毛細(xì)管柱，30m0.25mm0.25m氣化室溫度100檢測室溫度120柱溫80載氣及流速載氣為高純氮，壓力為179.5kpa，總流量46.2ml/min，柱流量2.7ml/min，分流比15，吹掃流量3ml/min，循環(huán)流量30ml/min檢測室氣體流速H2流量40ml/min，空氣流量400ml/min進(jìn)樣量20l浙江大學(xué)奶業(yè)科學(xué)研究所壓力讀取式體外產(chǎn)氣法（RPT系統(tǒng)）產(chǎn)氣瓶（一）基礎(chǔ)

20、知識體外產(chǎn)氣法主要理念通過體外產(chǎn)氣裝置模擬瘤胃發(fā)酵體外產(chǎn)氣系統(tǒng)組成體外產(chǎn)氣裝置：產(chǎn)氣瓶（相當(dāng)于獨(dú)立的瘤胃）、恒溫培養(yǎng)箱（模擬瘤胃溫度）；微生物培養(yǎng)液：1:9的瘤胃液與人工唾液；壓力傳感器；PC影響實驗成敗的主要因素實驗過程中產(chǎn)氣裝置的溫度，整個操作過程的厭氧狀態(tài)、微生物活力是影響實驗成敗的關(guān)鍵（二）操作流程圖（三）試劑配制及具體操作微生樣品39培養(yǎng)=1*GB3加入90ml人工唾液=2*GB3加入10ml瘤胃液2、4、6、9、12h讀取瓶內(nèi)氣體壓力微量進(jìn)樣器吸取20l氣體測定CH4，放氣24或48h讀取瓶內(nèi)氣體壓力微量進(jìn)樣器吸收20l氣體測定CH4，放氣=1*GB3=2*GB31ml上清液VFA

21、3個1ml混合液5ml混合液30ml混合液加入0.2ml8.2%偏磷酸420000g10min4保存物NH3-NMCP-80保存-20保存-20保存1、試驗前準(zhǔn)備稱量樣品=1*GB3產(chǎn)氣瓶編號（因為產(chǎn)氣量的計算涉及瓶子體積，所以盡量保留原產(chǎn)氣瓶編號，使用新瓶時要量取瓶子體積）；=2*GB3加入磁力棒；=3*GB3準(zhǔn)確稱取待測樣品一般約750mg（DM，適用0.5-1.5mgDM），置于體外產(chǎn)氣瓶底部。配制人工唾液=1*GB3計算人工唾液需要量：體外培養(yǎng)時每個產(chǎn)氣瓶內(nèi)人工唾液的量為90ml，瘤胃液10ml，依據(jù)試驗設(shè)計的產(chǎn)氣瓶數(shù)計算人工唾液和瘤胃液的需要量（預(yù)留20%，以備操作手法不當(dāng)造成浪費(fèi)）

22、；=2*GB3配制人工唾液中的微量元素溶液（A液）、緩沖液（B液）、常量元素溶液（C液）、刃天青溶液（D液）（可過量配制，常溫下存放）和還原劑（E液，現(xiàn)用現(xiàn)配，見附表1）。=3*GB3按附表2的順序和比例將配制好的各原液混合后，置入水浴搖床或水浴鍋內(nèi)，通入CO2氣體（氣流不易過大），使人工唾液由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t色，最終為無色。分裝人工唾液不間斷地將CO2通入人工唾液瓶，用100ml注射器或產(chǎn)氣管吸取人工唾液90ml，注入稱有樣品的產(chǎn)氣瓶，并用CO2飽和（可通過三通管完成兩路CO2的同時輸入）。蓋緊橡膠塞后，390.5恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)過夜（對于青貯類等含酸較多的樣品，一定要過夜，而且在正式培養(yǎng)前將里面

23、所產(chǎn)氣體排空，不計入產(chǎn)氣量）。其它=1*GB3準(zhǔn)備二層、四層、六層紗布各2-4塊（紗布可重復(fù)使用）；=2*GB3貯備兩瓶熱水，準(zhǔn)備收集瓶（收集和過濾瘤胃液用）、水桶、溫度計，以備次日取瘤胃液用。2、正式試驗采集與處理瘤胃液為方便讀取12h產(chǎn)氣量，瘤胃液最好在7:30前取回。所取瘤胃液為早飼前2h瘤胃液。=1*GB3到牧場后，將熱水倒入水桶，調(diào)節(jié)水溫度至390.5，用于瘤胃液保溫（應(yīng)時經(jīng)常熱水調(diào)節(jié)）；=2*GB3用真空泵抽取三只湖羊的瘤胃液，混合，倒入收集瓶，蓋好蓋子；=3*GB3回到實驗室后，將收集瓶置于水浴鍋內(nèi)，依次用二層、四層和六層紗布過濾（應(yīng)盡量快，以保持微生物的活力），獲得的濾液不間斷

24、地通入CO2氣體；=4*GB3將密封的產(chǎn)氣瓶從恒溫箱中取出，用6.5號針頭將產(chǎn)氣瓶中多余氣體放盡；=5*GB3用20ml注射器吸取瘤胃液10ml，通過另一16號針頭注入產(chǎn)氣瓶，將兩根針頭取下，產(chǎn)氣瓶置于390.5恒溫箱中培養(yǎng)?？瞻讓φ蘸蜆?biāo)準(zhǔn)對照實驗過程中要有至少3個空白對照和3個標(biāo)準(zhǔn)干草對照。空白對照不加樣品只有90ml人工唾液和10ml瘤胃液，標(biāo)準(zhǔn)對照以750mg（DM）干草（優(yōu)質(zhì)的過80目篩的羊草）為底物，加入90ml人工唾液和10ml瘤胃液。為了消除操作順序和恒溫培養(yǎng)箱條件的差異，要求空白對照和標(biāo)準(zhǔn)對照平均分布于試驗前期、中期和后期，放置于培養(yǎng)箱的不同位置。記錄產(chǎn)氣量培養(yǎng)2、4、6、9、

25、12、24、36、48h時，如果條件允許可延長培養(yǎng)時間，培養(yǎng)粗料時，至少96h或更長（有人培養(yǎng)一周），用壓力傳感器讀取產(chǎn)氣瓶內(nèi)壓力（輕拿、輕放），并放氣。要求：使用壓力傳感器前，熟練軟件的操作（有模擬程序可供練習(xí)）產(chǎn)氣量計算（瓶子）式中，GPt為樣品在t時間段的產(chǎn)氣量（ml）；Pt為t時間段讀取的壓力（mPa）；V0為瓶子體積；101.3為標(biāo)準(zhǔn)大氣壓（mPa）；W為樣品干物質(zhì)重。產(chǎn)氣過程的總積累產(chǎn)氣量為各時間段產(chǎn)氣量之和。瘤胃發(fā)酵樣品制備=1*GB3培養(yǎng)中途取樣時，要求取樣同時，向產(chǎn)氣瓶內(nèi)通入CO2，并于39水浴中操作;=2*GB3取混合液（發(fā)酵液及固體殘渣）時要求在控溫磁力攪拌機(jī)上操作。重復(fù)

26、試驗要求體外產(chǎn)氣試驗至少培養(yǎng)兩次，兩次標(biāo)準(zhǔn)干草產(chǎn)氣量相對偏差小于10%。附表1：人工唾液原液配制表A、微量元素溶液：CaCl2.2H2O13.2g;MnCl2.4H2O10.0g;CoCl2.6H2O1.0g;FeCl3.6H2O8.0g;加蒸餾水至100mlB、緩沖液：NH4HCO34.0g;NaHCO335.0g;加蒸餾水至1000mlC、常量元素溶液：Na2HPO4.12H2O9.45gKH2PO46.2gMgSO4.7H2O0.6g加蒸餾水至1000mlD、0.1%刃天青溶液：100mg刃天青溶解于100ml蒸餾水E、還原劑溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）：CysteineHCl625mg蒸餾水95m

27、l1MNaOH4.0mlNa2S9.H2O625mg附表2：人工唾液配制表（1000ml）順序原液體積（ml）1蒸餾水520.22緩沖液（B液）208.13常量元素溶液（C液）208.14微量元素溶液（A液）0.150.1%刃天青溶液（D液）1.06還原劑溶液（E液）62.4瘤胃液脂肪酸測定1ml樣品85水浴30min=1*GB3加入0.67ml5MNaOH=2*GB3加入一滴飽和甲基橙指示劑=3*GB3充滿N2冷卻=1*GB3加入0.67ml5.1MHCl=2*GB3加入1ml2mg/mlC17：0=3*GB3充滿2.5ml氯仿/甲醇渦旋2min2000g10min下層溶液過硫酸鈉干燥柱收集

28、下層氯仿N2吹干1.0ml正己烷懸浮2000rpm10min-20凍存上機(jī)測定（一）操作流程圖（二）試劑配制及具體操作1、樣品處理=1*GB3.取1ml樣品于帶蓋的水解管，加入0.67ml5MNaOH和一滴飽和甲基橙指示劑后，充滿N2；=2*GB3.85水浴30min，冷卻至室溫后，加入0.67ml5.1MHCl,使溶液pH低于2（溶液由橙色變?yōu)榧t色），如果不確定，可以用pH計檢測；=3*GB3.加入1ml2mg/ml的內(nèi)標(biāo)C17：0；=4*GB3.加入2.5ml氯仿/甲醇（2:1,v/v）后，渦旋2min；=5*GB3.將樣品在2000g下離心10min；=6*GB3.移去上層甲醇/水層，輕

29、輕撥開中間雜質(zhì)層，將下層溶液無損失轉(zhuǎn)移；=7*GB3.通過含硫酸鈉的干燥柱將下層氯仿濾入另一玻璃容量管；=8*GB3.用氮?dú)鈱悠反蹈桑?9*GB3.用1.0ml正己烷懸浮后，簡單渦旋；=10*GB3.2000rpm下離心10min，樣品-20冷凍保存。2、上機(jī)條件色譜柱HP-INNOWAX（19091N-133）毛細(xì)管柱，30m0.25mm0.25m氣化室溫度260檢測室溫度270柱溫采用程序升溫，140持續(xù)5min后，以4/min升溫至240后維持20min載氣及流速載氣為高純氮，壓力為100kpa，總流量87.9ml/min，柱流量0.84ml/min，線速度：25.6cm/sec，分流

30、比100，吹掃流量3ml/min，循環(huán)流量30ml/min檢測室氣體流速H2流量40ml/min，空氣流量400ml/min進(jìn)樣量產(chǎn)氣管，2l；產(chǎn)氣瓶4l浙江大學(xué)奶業(yè)科學(xué)研究所Real-timePCR測定瘤胃微生物數(shù)量一、樣品采集Invitro實驗終止時，若分析混合微生物，可取1ml混合培養(yǎng)液于1.5ml滅菌離心管(也可直接用滅菌過的含0.3g0.1mm和0.1g0.5mm鋯珠的2ml螺口管)-80度保存待用。若要分別分析固、液相微生物時，將混合培養(yǎng)液過40um尼龍袋，濾液于4度500g離心10，上清用于液體微生物DNA提取。尼龍袋于39度滅菌水中沖洗至澄清用吸水紙吸干水份，-80度保存用于固

31、相微生物DNA的提取。InSacco方法與此相似。二、總DNA的提取1試驗材料：1.5mLEP管、螺口管、鋯珠、1mL、200uL、20ul槍頭（均需滅菌）、渦旋器、高速離心機(jī)等。2所需試劑：NaOH、Tris堿、EDTA二鈉、NaCl、Tris飽和酚、氯仿、異戊醇、冷乙醇。3.溶液配制方法：試劑方法A10MNaOH稱取40gNaOH，加到100mL水中。無需除菌。B5MNaCl稱取29.22gNaCl，加水溶解定容至100mL。C1M，pH8.0Tris-HCl稱取12.114gTris堿，加80mL水，用濃鹽酸調(diào)pH至8.0，加水定容至100mL。D0.5M，pH8.0EDTA將18.61

32、gEDTA-Na.加入80mL水中，在磁力攪拌器上劇烈攪拌。用10N的NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0，加水定容至100mL。ETE緩沖液（10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.0）吸取1mL1M的Tris-HCl和0.2mL0.5M的EDTA，加水定容至100mL。FTN150(10mMTris-HCl;150mMNaCl，pH8.0)1ml1M的Tris-HCl和3ml5MNaCl,加水定容至100ml。GTris飽和酚(pH8.0)購買H24：1的氯仿異戊醇240mL氯仿+10mL異戊醇I無水乙醇-20度保存。J70%乙醇70mL無水乙醇加30mL水-20度保存。4提取步驟：

33、液相微生物：冰上解凍樣品后于4度20000g離心5min，棄上清液。加入1mLTN150懸浮沉淀，再加150L的Tris飽和酚，Bead-beater勻漿（4600g，2min），冰上兩分鐘冷卻，重復(fù)三次。固相微生物：稱取0.35g固體培養(yǎng)物于2ml螺口管，再稱0.3g0.1mm和0.1g0.5mm滅菌過的鋯珠。加入1mLTN150，150L的Tris飽和酚，Bead-beater勻漿（4600g，2min），冰上冷卻兩分鐘，重復(fù)三次。以下步驟相同(2)加入150L氯仿異戊醇，渦旋混勻。20000g離心5min，上清液轉(zhuǎn)至已1.5mLEP管中。(3)加入150L氯仿異戊醇和150LTris飽和

34、酚，渦旋混勻1min，10000g離心1min，上清液轉(zhuǎn)至1.5mLEP管中。(4)重復(fù)上述步驟直至水相和有機(jī)相之間的界面清晰為止(一般需3-5次)。上清液轉(zhuǎn)至1.5mLEP管中。(5)加入300L氯仿異戊醇，渦旋混勻1min。10000g離心1min，準(zhǔn)確量取上清液轉(zhuǎn)至1.5mLEP管中。(6)加入2倍上清體積的冷無水乙醇及1/10倍上清體積的5MNaCl，渦旋混勻，-20C沉淀DNA2小時（或30min以上）。10000g離心10min，棄上清。(7)加入500L70冷乙醇洗滌沉淀，10000g離心5min，棄上清，重復(fù)三次，風(fēng)干沉淀。(8)加入50-100LTE緩沖液溶解DNA。提取的D

35、NA部分用于紫外分光光度計測OD值，其余-20C保存。(9)DNA質(zhì)量檢測：紫外分光光度計測OD值濃度計算：DNA（ngul）OD26050稀釋倍數(shù)純度：OD260OD280為1.8-2.0，若低于此值，則可能有蛋白污染。完整性：取5L+1uL上樣緩沖液作0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(DNA與上樣緩沖液比例為5：1)。三、Real-timePCR操作步驟(ABI7500)：1.稀釋DNA模板至0.5或1ng/ul。2.按所測微生物種類及樣品數(shù)量計算出所需試劑量：(由于我們現(xiàn)階段用的還是相對于總菌的定量，每一樣品所測菌都要求對應(yīng)一個總菌，所以同一樣品最好在同一塊板上同時測出所有菌，一方面可以減少試

36、劑用量，另一方面也可以減少板與板之間的差異。每一樣品設(shè)三個復(fù)孔)。舉例：測包括總菌在內(nèi)的5種菌時，一個96孔板可以測的樣品數(shù)為：3復(fù)孔*5種菌*6個樣+5種菌陰性對照=95孔，或3復(fù)孔*6種菌*5個樣+6種菌陰性對照=96孔，最大限度地利用96孔板)。以TaKaRa(DRR041A)SYBRPremixExTaq試劑盒為例：試劑使用量ulN+1個反應(yīng)X種菌SYBRPremixExTaq(2)1010.410.4(N+1)需X*(N+1)個混合液，除引物不同，其余都相同，冰上操作。(*ABI7500需用ROXII校正)ROXII(50)*0.4上游引物(10uM)0.40.4(N+1)下游引物(

37、10uM)0.40.4(N+1)水6.86.8(N+1)=18*(N+1),分裝為N個孔，每孔18ul模板(0.5或1ng/ul)2總體積20分裝完之后，小心撕開real-timePCR專用光學(xué)透明膜覆蓋于96孔板上，用刮板將膜刮緊密封在96孔板上，以防液體蒸發(fā)。稍作離心。3.反應(yīng)程序按如下程序進(jìn)行：四、ABI7500型熒光定量PCR儀操作指南1.開機(jī)(1).確認(rèn)電腦與主機(jī)的數(shù)據(jù)通訊線(灰色USB連線)連接正確。(2).確認(rèn)電腦處于外接電源供電狀態(tài)。(3).啟動電腦，進(jìn)入Windows操作系統(tǒng)。(4).待桌面圖標(biāo)出現(xiàn)后，打開ABI7500主機(jī)的電源。(5).待主機(jī)的電源指示燈點(diǎn)亮后，啟動750

38、0SystemSoftware應(yīng)用軟件。2.實時定量的軟件運(yùn)行(1).新建文件菜單CreatenewDocument，Assay選擇AbsoluteQuantification(實時定量模式)，下一步(2).選擇adddetector,或者添加已有的detector到右邊欄，完成，打開一個空白的96孔板文件。.選擇命名孔，雙擊或右擊鼠標(biāo)，打開WellInspector窗口。(3).首次使用軟件，或者探針（Detector）沒有設(shè)置好，請點(diǎn)擊AddDetector按鈕，打開DetectorManager窗口。如果Detector列表中沒有合適的探針，點(diǎn)擊按鈕FileNew，新建探針：設(shè)定探針的名

39、稱(建議使用所研究基因符號加標(biāo)記熒光，如GAPDH_FAM、ACTIN_VIC等)、報告基團(tuán)(FAM或者VIC)、淬滅基團(tuán)(TaqMan探針選TAMRA；MGB探針選None)、顏色(任意指定)等。設(shè)置完成后點(diǎn)擊OK，該探針即出現(xiàn)在探針列表中。重復(fù)此過程，設(shè)立其他的探針。(4).在DetectorManager窗口，從探針列表中點(diǎn)擊選擇所需探針，按住Ctrl鍵可以選擇多個探針，再點(diǎn)擊AddtoPlateDocument按鈕。最后點(diǎn)擊Done關(guān)閉DetectorManager窗口。此時WellInspector窗口仍然是打開的。(5).填樣品表在96孔表中選定有樣品的一個或多個孔，在WellIn

40、spector頁面的SampleName欄中填入樣品名稱；在探針列表的Use項下的方框中，打鉤選擇要用的一個或多個探針；在Task欄中選擇指定樣品類領(lǐng)：陰性對照選NTC；未知樣品選Unknown；標(biāo)準(zhǔn)品選Standard。對于Standard，還要在Quantity欄中輸入DNA拷貝數(shù)。注意：只有在這里輸入拷貝數(shù)后，軟件才能自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。建議標(biāo)準(zhǔn)品的濃度在5點(diǎn)以上。建議每個樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)品)都按照統(tǒng)計學(xué)要求作一定數(shù)量的復(fù)管。(6).參比熒光(PassiveReference)選ROX；如果使用的試劑中不含有參比熒光，請選None。完成后點(diǎn)擊右上角的X按鈕，關(guān)閉WellInspector窗口

41、。(7).循環(huán)參數(shù)切換到Instrument頁面，設(shè)定及修改PCR熱循環(huán)程序：在ABI公司默認(rèn)的程序中，50C2min是UNG酶起作用的步驟，UNG酶可以預(yù)防PCR產(chǎn)物(其中以U代替T)對定量PCR的污染；95C10min的作用是激活金牌Taq酶，同時滅活UNG酶；40個循環(huán)的95C15sec和60C1min是定量PCR的循環(huán)步驟。7000默認(rèn)在最后一步，也就是60C1min復(fù)性和延伸時收集熒光信號。如果使用ABI公司的定量PCR試劑，上述參數(shù)不需要調(diào)整，直接運(yùn)行PCR循環(huán)就可以了。在使用其他廠家試劑的情況下，如果其中沒有UNG酶，請刪除50C2min步驟；如果使用的不是金牌Taq酶而是其他普

42、通的Taq酶，請刪除95C10min步驟。如用的是TaKaRa試劑盒，刪除50C2min步驟，95C10min改為95C5秒。(8).循環(huán)參數(shù)的修改方法刪除：按住Shift鍵并在相應(yīng)的Stage或Step中點(diǎn)擊，使該步驟被選中變黑，再按Del鍵即可刪除。插入：在需要插入?yún)?shù)的位置點(diǎn)擊，出現(xiàn)粗黑豎線后，分別點(diǎn)擊AddHold、AddCycle或AddStep按鈕添加保溫、循環(huán)或循環(huán)中的一個步驟。修改溫度和時間：拖動鼠標(biāo)，選中需要修改的溫度或時間數(shù)字，輸入新的數(shù)值即可。(9).其他設(shè)置：反應(yīng)體積：定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體積是50L；使用96孔板可以用20uL，依所用試劑而定。融解曲線試驗：點(diǎn)擊Add

43、DissociationStage，儀器即在定量PCR循環(huán)完成后繼續(xù)做融解曲線試驗。如果是采用SYBRGreenI染料方法進(jìn)行定量研究，建議進(jìn)行融解曲線試驗，以判定PCR反應(yīng)特異與否。單峰表示單一的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，多峰表示PCR擴(kuò)增有雜帶。注意：只有SYBRGreenI染料方法才需要進(jìn)行融解曲線試驗，TaqMan探針和MGB探針法都不需要。(10).Save按鈕保存文件設(shè)置。確認(rèn)96孔板或全部樣品管在主機(jī)內(nèi)放置妥當(dāng)后，點(diǎn)擊Start按鈕，開始PCR循環(huán)。屏幕上動態(tài)顯示PCR進(jìn)程和剩余時間。(11).監(jiān)控進(jìn)程切換到Results頁面的AmpPlot子頁面，可以實時顯示PCR曲線隨著循環(huán)增加而逐步

44、增長的實際情況。可在Detector中選相應(yīng)的目標(biāo)觀察。如果選All，則同時顯示所有探針的反應(yīng)進(jìn)程。(12).程序結(jié)束后，點(diǎn)擊AnalysisSettings中的AutoCt,再點(diǎn)菜單上方向或的綠色箭頭分析結(jié)果，保存結(jié)果(可以保存為.sds格式，也可以保存為.sdt格式，作為以后同類實驗的模板，節(jié)省軟件設(shè)置時間)。退出程序，關(guān)閉ABI7500主機(jī)電源。3.實時定量的數(shù)據(jù)分析(1).數(shù)據(jù)分析切換到Result頁面，進(jìn)入擴(kuò)增曲線(AmplificationPlot)子頁面，查看軟件已經(jīng)自動分析好的實驗結(jié)果。注意：此時的數(shù)據(jù)是軟件根據(jù)默認(rèn)值（基線起點(diǎn)為3，終點(diǎn)為15）得到的初步結(jié)果，還需要根據(jù)本次實

45、驗的具體情況，精細(xì)調(diào)節(jié)Baseline（基線）的起止點(diǎn)后，重新分析，以得到更精確的數(shù)據(jù)。(2).基線的起點(diǎn)和終點(diǎn)確定原則基線(Baseline)是指PCR開始時信號很低、接近背景且比較平穩(wěn)的那個階段。起點(diǎn)要避開開始幾個循環(huán)由于高溫導(dǎo)致的信號增高，設(shè)在信號已經(jīng)降到背景高度且能維持平穩(wěn)的地方，一般在3到6個循環(huán)之間；終點(diǎn)要避免覆蓋信號已經(jīng)開始有明顯增長的地方，一般在本組數(shù)據(jù)中最小的CT值前再3個循環(huán)處。另外，起點(diǎn)與終點(diǎn)之間最好能間隔8個循環(huán)以上，以滿足統(tǒng)計基線標(biāo)準(zhǔn)偏差的數(shù)學(xué)要求。調(diào)整好起止點(diǎn)以后，再點(diǎn)擊Analyze按鈕，軟件即自動計算新的閾值和CT值，并更新實驗報告。注意：此時擴(kuò)增曲線頁面上顯示

46、的閾值數(shù)字并不更新，但是這不影響后臺數(shù)據(jù)運(yùn)算的準(zhǔn)確。(3).線性圖譜在默認(rèn)的設(shè)置中，PCR擴(kuò)增曲線圖譜的縱坐標(biāo)代表經(jīng)過ROX和空白校正后的相對熒光信號強(qiáng)度，橫坐標(biāo)代表PCR循環(huán)次數(shù)（從1到40）；縱坐標(biāo)以對數(shù)表示，橫坐標(biāo)以線性表示。如果要看完全線性的S形圖譜，請雙擊縱坐標(biāo)軸線，打開坐標(biāo)設(shè)置窗口，將縱坐標(biāo)改成線性形式。(4).原始數(shù)據(jù)切換到Component子頁面，察看原始數(shù)據(jù)。正常的SYBR信號強(qiáng)度，中間呈S形增長；ROX信號是水平穩(wěn)定的，不隨PCR進(jìn)程而改變，因為ROX是以固定濃度加入到PCR試劑中的，它本身并不參與PCR擴(kuò)增。(5).原始數(shù)據(jù)切換到Spectra子頁面，也可以察看原始數(shù)據(jù)。

47、Spectra與Component這兩個頁面的區(qū)別是：Component顯示的是信號強(qiáng)度隨時間(即PCR循環(huán)次數(shù))的變化，是縱向的；而Spectra顯示的是每個PCR循環(huán)點(diǎn)上信號強(qiáng)度在不同波長上的分布，也就是在4個濾色片上的分布，是橫向的。(6).標(biāo)準(zhǔn)曲線切換到StandardCurve子頁面，察看標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意：只有在Setup時輸入標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)后，軟件才能自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。(7).實驗報告切換到Report子頁面，察看實驗報告。確認(rèn)無誤后，保存結(jié)果。也可以從File菜單中選擇Export，再選擇數(shù)據(jù)類型，輸出各種類型的數(shù)據(jù)，包括CT值、相對信號強(qiáng)度、原始數(shù)據(jù)、融解曲線數(shù)據(jù)和實驗結(jié)果等。輸

48、出的數(shù)據(jù)可以用Excel打開，并可在Excel中重新生成擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線等圖譜。(8).結(jié)果計算：總菌的三個Ct值算平均值，再用其他菌的Ct按如下公式計算：target(%bacterial16SrDNA)=2-(Cttarget-Cttotalbacteria)變性梯度凝膠電泳（DGGE）操作規(guī)程一樣品總DNA的提取1試驗前準(zhǔn)備材料離心管、螺口管、鋯珠、各式槍頭（均需滅菌）、移液槍、渦旋器、低溫離心機(jī)、Bead-beater、玻璃器材、一次性塑料手套試劑Tris、EDTA、TE飽和酚、TE緩沖液、乙酸鈉、氯仿、異戊醇、無水乙醇、NaCl2試劑配制A0.5M，pH8.0EDTA將186.1g

49、EDTA-Na2H2O加入800mL水中，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用10N的NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0，加水定容至1LB1M，pH8.0Tris-HCl稱取121.1gTris，加800mL水，加濃鹽酸42mL調(diào)pH至8.0。待溶液冷至室溫后，方可最后調(diào)定pH值。加水定容至1LC3M，pH5.2NaAc稱取40.827gNaAc溶于90mL水中，用冰乙酸調(diào)至pH5.2后補(bǔ)加水至100mLD氯仿/異戊醇（V/V=24/1）量取氯仿240mL，加入異戊醇10mL，棕色瓶保存?zhèn)溆肊TE緩沖液吸取1mL1M的Tris-HCl和0.2mL0.5M的EDTA，加水定容至100mLFTN150緩沖液稱

50、取0.8766g的NaCl，加入1mL1M的Tris-HCl，加水定容至100mLG70冰乙醇量取無水乙醇70mL，加入30mL水，-20保存?zhèn)溆?操作步驟取出在-20下凍存的樣品，室溫解凍。10000g離心5min。棄上清液。沉淀加人1mLTN150緩沖液懸浮，轉(zhuǎn)移至已加入鋯珠（0.1mm、0.3g）的滅菌螺口管中，再加150L的TE飽和酚，Bead-beater勻漿（5000g，3min），冰上冷卻。加入150L氯仿異戊醇，渦旋混勻。10000g離心5min，上清液轉(zhuǎn)至新管中。加入150L氯仿異戊醇，和150LTE飽和酚，渦旋混勻1min，10000g離心1min，上清液轉(zhuǎn)至新管中。重復(fù)上

51、述步驟至水相和有機(jī)相之間的界面清晰為止。加入300L氯仿異戊醇，渦旋混勻1min。10000g離心1min，上清液轉(zhuǎn)至新管中。加冷無水乙醇1mL，和50L3MNaAc（pH5.2），渦旋混勻，-20C沉淀DNA（30min）10000g離心10min，棄上清。加入500L70冷乙醇洗滌沉淀，10000g離心5min，棄上清，風(fēng)干沉淀。加入50-100LTE緩沖液溶解DNA，-20C保存提取的DNA。4注意事項酚是致癌物質(zhì)，實驗操作應(yīng)配帶手套，且不要將該溶液灑在桌面上或地面上。試驗中使用了揮發(fā)性有毒物質(zhì)，操作應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。試驗過程中樣品應(yīng)放置冰面上，所有離心操作在4C下進(jìn)行。二瓊脂糖凝膠電泳

52、檢測DNA1試驗前準(zhǔn)備材料瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)（電泳儀、電泳槽等）、微波爐、凝膠成像系統(tǒng)、錐形瓶、移液槍、槍頭試劑Tris、EDTA、硼酸、Goldviewer染色液、DNAMarker（一般DL2000）、瓊脂糖、6上樣緩沖液、雙蒸水2試劑配制A5TBE電泳緩沖液（pH8.3）Tris54.0g，硼酸27.5g，0.5MEDTA溶液（pH8.0）20mL，加水定容至1L。使用時稀釋為0.5TBE，4保存?zhèn)溆?操作步驟1.2瓊脂糖凝膠的制備將制膠槽、樣品梳等清洗干凈、晾干，梳子插入制膠槽中。稱取0.6g瓊脂糖置于小錐形瓶中，加入50mL0.5TBE電泳緩沖液。在微波爐中加熱溶化至完全溶解成為無顆

53、粒狀的瓊脂糖凝膠液。待冷卻至60-65C，加入3LGoldviewer染色液。搖勻，輕輕倒入制膠槽中，使之形成均勻的膠面，盡量避免產(chǎn)生氣泡。待凝固（30min左右）后，拔掉樣品梳，將制膠槽置于電泳槽中，倒入適量0.5TBE電泳緩沖液，以完全浸沒膠面0.2cm左右為宜。上樣將樣品DNA與6上樣緩沖液以5：1比例混勻，用移液槍上樣。每個樣品槽的進(jìn)樣量不宜過多，以免溢出后串樣。并記錄上樣順序和進(jìn)樣量。電泳接通電泳儀和電泳槽的電源（注意進(jìn)樣孔應(yīng)在負(fù)極），電壓100V，電泳30min左右。觀察和拍照電泳結(jié)束后，將凝膠在成像系統(tǒng)下成像，拍照，保存。三細(xì)菌16SrDNA片段擴(kuò)增1試驗前準(zhǔn)備材料PCR管、各式

54、槍頭（均需滅菌）、移液槍、鑷子、冰盒、一次性手套試劑PCR反應(yīng)相關(guān)試劑：Taq酶、10PCRBuffer、Mg2+、dNTPs、引物U（U968-GC）、引物L(fēng)（L1401）、ddH2O2試驗步驟依次在PCR管中加入下列試劑（50L體系、冰上操作）單管量（L）N個（N=反應(yīng)數(shù)1）ddH2O37.7537.75N10Buffer（含Mg2+）55NdNTPs（各2.5mM）44N引物U（10M）11N引物L(fēng)（10M）11N模板DNA（1-10ng）1依次加入稍離心后，加Taq酶（5UL）0.25L混勻，稍離心用鑷子蓋好PCR管蓋將PCR管放入PCR儀中，設(shè)置熱循環(huán)程序。如下：945min9430s56.51min30個Cycles721min725min4保存3電泳檢測反應(yīng)結(jié)束，取5L作1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，細(xì)菌16SrDNA的V6-V8區(qū)的PCR產(chǎn)物片段大小在470bp左右。4注意事項PCR各種試劑置冰上融化（Taq酶先存放在-20），操作應(yīng)在冰上進(jìn)行。PCR反應(yīng)應(yīng)在一個沒有DNA污染的