DB33_T 2247-2020鴨坦布蘇病毒RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法(高清正版）

1、ICS 65.020.30B 43DB33浙江省地方標(biāo)準(zhǔn)DB33/T 22472020鴨坦布蘇病毒 RT-PCR 和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測(cè)方法Method of RT-PCR and the real-time RT-PCR for the detection of duck tembusu virus disease2020 - 03 - 03 發(fā)布2020 - 04 - 03 實(shí)施浙江省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā) 布DB33/T 22472020I前 言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.1-2009給出的規(guī)則編寫。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省畜牧獸醫(yī)和飼料標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起

2、草單位：浙江省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：云濤、徐輝、周彩琴、張存、趙靈燕、余斌、吳赟竑、張傳亮、吳雪軍、黃曉兵、馮肖肖、華炯鋼、呂見濤、張娟敏、鮑偉華。DB33/T 22472020 PAGE 6鴨坦布蘇病毒 RT-PCR 和實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 檢測(cè)方法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了鴨坦布蘇病毒的反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的實(shí)驗(yàn)條件、操作步驟和結(jié)果判定等要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于鴨坦布蘇病毒核酸的檢測(cè)。術(shù)語和定義2.1鴨坦布蘇病毒（Duck Tembusu Virus，DTMUV）屬于黃病毒科、黃病毒屬、蚊媒病毒類、Ntay

3、a病毒群，可引起鴨、鵝產(chǎn)蛋下降，雛鴨、雛鵝發(fā)病死亡。實(shí)驗(yàn)條件主要儀器設(shè)備PCR 儀。熒光定量 PCR 儀。微量移液器。組織勻漿器。電泳儀。電泳槽。水浴鍋。紫外凝膠成像系統(tǒng)。高速臺(tái)式低溫離心機(jī)。生物安全柜。試劑0.01M 磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L，pH7.4 PBS）：稱取 8.0 g NaCl、0.2 g KCl、2.9 g Na2HPO412H2O、0.2 g KH2PO4，將上述試劑溶于 800 mL 去離子水中，充分?jǐn)嚢枞芙?，滴加濃鹽酸將 pH 調(diào)節(jié)至 7.4，然后加去離子水定容至 1 L，高溫滅菌 30 min，室溫保存。氯仿。異丙醇。焦炭酸二乙酯（DEPC）處理的滅菌去離子

4、水：用 DEPC 50 L，加超純水至 100 mL，室溫過夜， 121高壓滅菌 15 min，分裝到 1.5 mL DEPC 處理過的離心管，凍存?zhèn)溆谩?5%乙醇：取新開啟的無水乙醇 75 mL，加 DEPC 水至 100 mL，混勻，-20預(yù)冷。溴化乙錠 （EB）：取 1.0 g 溴化乙錠，加去離子水，定容至 100 mL。充分溶解后的溴乙錠溶液轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，室溫避光保存，其工作濃度為 0.5 g /mL。1TAE 緩沖液：取 242 g 羥基甲基氨基甲烷（Tris）、37.2 g 二水乙二銨四乙酸二鈉、57.1 mL 冰乙酸，加去離子水定容至 1 L，配置成 50TAE 電泳緩沖液；量

5、取 20 mL 的 50TAE 電泳緩沖液，加入去離子水定容至 1 L，室溫保存。1%瓊脂糖凝膠：稱取 1.0 g 瓊脂糖，加入 1TAE 電泳緩沖液 100 mL，輕輕混勻后加熱，使瓊脂糖完全熔化。待瓊脂糖膠冷至 5060時(shí)，加 EB 溶液（終濃度 0.5 g/mL）或 5 L 核酸染料，搖勻后倒入制膠板中，厚度為 3 mm5 mm，室溫凝固后取下電泳梳子，備用。DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物 Marker：DL 2000。10加樣緩沖液：稱取 25 g 聚蔗糖、0.1 g 溴酚藍(lán)、0.1 g 二甲苯青，加入滅菌雙蒸水定容至100 mL。商品化的一步法實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 反應(yīng)試劑盒。One

6、Step Prime Script RT-PCR Kit（Perfect Real Time，TAKARA)，含有 RT-PCR 緩沖液，酶混合物，dNTP 混合物，無 RNA 酶的水等。M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶。RNA 酶抑制劑。TaqDNA 聚合酶。dNTPs。引物：RT-PCR 擴(kuò)增引物,見表 1；實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 引物和探針，見表 2。表1 RT-PCR 擴(kuò)增引物引物名稱引物序列DTMUV引物P15- GCAACCAGGCAAAGAGGTCATA -3DTMUV引物P25- AAGTGAGCCTCATCCATAATGAACA -3表2 實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 引物和探針引物名

7、稱引物序列(5-3)DTMUV 引物 P3AAGTCAGGCCAGGGAATCCDTMUV 引物 P4CATGCACCCAGATTTGTTAACCDTMUV探針FAM-CCGTCATCCAACATC-MGB操作步驟與結(jié)果判定樣品采集與處理組織器官用無菌鑷子和剪刀采集患病或病死禽類各種組織與器官（肝臟、卵巢、腦、脾臟、胸腺等）， 裝入一次性塑料袋或其它滅菌容器，編號(hào)。取待檢組織樣品適量（0.1g），按1:5 倍（W/W）加入無菌 0.1M PH 7.4 PBS，于滅菌并烘干的研缽或組織勻漿器中充分研磨，反復(fù)凍融2次后，4 ，3000 r/min 離心5 min，取上清1 mL轉(zhuǎn)至無菌的 1.5

8、mL離心管中液，編號(hào)備用。抗凝血、血清抗凝血用無菌注射器直接吸取全血，加入含抗凝劑（除肝素外）的抗凝管中，充分混勻，編號(hào)備用。血清用無菌注射器直接吸取全血，自然凝固，3000 r/min 離心5 min，取上清液。咽拭子、肛拭子用無菌棉簽刮取家禽的咽部或泄殖腔粘膜，放入含0.1 M PH 7.4 PBS的離心管內(nèi)。3000 r/min 離心5 min，取上清液，編號(hào)備用。樣品保存制備樣品在冷藏條件不宜超過4 h，長(zhǎng)期保存應(yīng)放入-70保存。RNA 提取設(shè)立陽性、陰性樣品對(duì)照，陽性對(duì)照為滅活的鴨坦布蘇病毒感染 SPF 雞胚尿囊液或者感染禽的組織，陰性對(duì)照為正常 SPF 雞胚尿囊液或者正常禽組織。按

9、下列步驟完成 RNA 提取，也可采用商品化 RNA 試劑盒提?。簶悠诽幚砗煤?，在樣品處理區(qū)，取 n+2 個(gè) 1.5 mL DEPC 處理過的滅菌離心管，其中 n 為待檢樣品數(shù)、1 個(gè)陽性對(duì)照管和 1 個(gè)陰性對(duì)照管，對(duì)每個(gè)管進(jìn)行編號(hào)標(biāo)記；取 250 L 勻漿液，加入 750 L RNA 提取試劑 Trizol 置入一個(gè) 1.5 mL 離心管，震蕩數(shù)次， 靜置 5 min；加入 200 L 預(yù)冷的氯仿，震蕩混勻，室溫靜置 5 min，412 000 r/min 離心 15 min；吸取上層水相至一新離心管中，加入等體積異丙醇，混勻，室溫靜置 15 min，4 12 000 r/min 離心 15

10、min，離心后在離心管邊和底部可見有膠樣 RNA 沉淀，棄上清；吸棄上清，加入 500 L 75%乙醇，小心顛倒以漂洗沉淀及管壁，清洗 2 次，4 12 000 r/min 離心 5 min；吸棄上清，沉淀置室溫條件下干燥后，加入 20 L DEPC 處理水溶解；提取的 RNA 應(yīng)在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增；若需長(zhǎng)期保存，需置于-70冰箱保存。RT-PCR 反應(yīng)一步法 RT-PCRRT-PCR 反應(yīng)體系設(shè)立陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，按順序加入表3中的成分。表3 一步法 RT-PCR 反應(yīng)體系試劑體積2一步法RT-PCR緩沖液12.5 LDTMUV引物P1（20 mol/L）0.5 LDT

11、MUV引物P2（20 mol/L）0.5 L表3（續(xù)）試劑體積RNA提取液2.0 L酶混合液1.0 LDEPC水8.5 L反應(yīng)條件反轉(zhuǎn)錄：50 30 min；預(yù)變性：94 2 min；擴(kuò)增：94 30 s，56 30 s，72 30 s， 共30個(gè)循環(huán)。72 延伸10 min。兩步法 RT-PCR反轉(zhuǎn)錄取5 L RNA提取液, 加1 L DTMUV引物P2，70水浴5 min；冰浴2 min，繼續(xù)加入表4中的成分， 37 水浴1 h，合成cDNA，取出直接進(jìn)行PCR或置-20保存。表4 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系試劑體積5反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液4 L0.1 mol/L DTT2 L2.5 mmol/L dNTP

12、s2 LM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶0.5 LRNA酶抑制劑0.5 LDEPC水5 LPCR 反應(yīng)體系先加入去離子滅菌水，然后再按照順序逐一加入表5中成分，每一次都應(yīng)加入到液面以下。全部加完后，混勻，瞬時(shí)離心，使液體沉降到PCR管底。表5 PCR 反應(yīng)體系試 劑體 積反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1.25 LDTMUV引物P1（20 mol/L）0.5 LDTMUV引物P2（20 mol/L）0.5 L10PCR Buffer2.5 L2.5 mmol/L dNTPs2 LTaqDNA聚合酶0.25 L滅菌去離子水18 L反應(yīng)條件預(yù)變性：94 3 min；擴(kuò)增：94 30 s，56 30 s，72 30 s，循環(huán)30次；7

13、2延伸10 min。電泳反應(yīng)結(jié)束后，分別取5 L各檢測(cè)樣品及陽性和陰性對(duì)照樣品RT-PCR產(chǎn)物并與0.5 L加樣緩沖液（10 Loading buffer）混合，然后加入到1.0 %瓊脂糖凝膠板的加樣孔中，隨后加DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；以5 V/cm 的電壓進(jìn)行電泳，30 min后在紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果、拍照、記錄。結(jié)果判定陽性對(duì)照擴(kuò)增出 567 bp 目的條帶，且陰性對(duì)照無相應(yīng)目的條帶，判定試驗(yàn)成立，否則試驗(yàn)無效。被檢測(cè)樣品擴(kuò)增出567 bp目的條帶，判定為陽性；未擴(kuò)增出567 bp目的條帶，判定為陰性。實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR反應(yīng)體系設(shè)立陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，按順序加入表6中的成分。全部加完

14、后，輕輕吹打混勻，500 r/min 離心 30s，使液體沉降到PCR管底。表6 熒光定量 RT-PCR 體系試劑體積濃度2One Step RT-PCR Buffer10 L1TAKARA ExTaq HS(5U/l)0.4 L2UPrime Script RT EnzymeMix0.4 L/10M DTMUV引物P30.4 L0.2 M10M DTMUV引物P40.4 L0.2 M50ROX Reference Dye0.4 L110M DTMUV探針0.8 L0.4 MRNA提取液2 L/滅菌去離子水5.2 L/反應(yīng)條件反轉(zhuǎn)錄：42 5min；預(yù)變性：95 10 s；擴(kuò)增：95變性5 s；58延伸31 s，共40個(gè)循環(huán)，58 延伸時(shí)采集熒光信號(hào)。熒光素的設(shè)定Report Dye設(shè)定為FAM，Quencher Dye 設(shè)定為MGB或 none。結(jié)果判定閾值設(shè)定直接讀取檢測(cè)結(jié)果。閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器