抗菌藥物敏感性試驗與耐藥檢測ppt---生物技術(shù)實驗教學中心課件

1、實驗九 抗菌藥物敏感性試驗與耐藥檢測一、實驗目的：1. 掌握紙片擴散法（K-B法）的原理、操作方法、結(jié)果的判讀及臨床意義。2. 了解各種稀釋法抗生素敏感性試驗的原理、操作方法、結(jié)果判讀和臨床意義。3. 掌握紙片擴散法的質(zhì)量控制，了解稀釋法的質(zhì)量控制。二、實驗原理 1. 抗菌藥物敏感性試驗是測定抗生素或其他抗微生物制劑在體外抑制細菌生長的能力。這種能力可以通過稀釋或擴散方法來測定。 1）稀釋法敏感性試驗 為了定量測定抗菌藥物的活性，抗菌藥物與肉湯或瓊脂培養(yǎng)基混合進行稀釋，然后種入試驗細菌，孵育過夜，能抑制細菌生長的最低濃度稱為該制劑的最低抑菌濃度(MIC) ，然后將MIC 與機體血清或體液中可獲

2、得藥物濃度相比較，來確定恰當?shù)呐R床療效。2）紙片擴散法敏感性試驗 將含有一定量抗菌藥物的紙片貼在已接種試驗菌的瓊脂平板上，通過紙片上抗生素的擴散形成不同的藥物濃度梯度，在距離紙片一定距離的范圍內(nèi)試驗菌的生長受到抑制。這種抑制作用與細菌的敏感性及其他因素相關(guān)。 2.抗菌藥物敏感性試驗目的：1）指導臨床醫(yī)師對各類患者選擇最佳抗菌藥物。2）在一定區(qū)域內(nèi)積累對公共衛(wèi)生有關(guān)的重要耐藥的微生物流行病學資料。3.抗菌藥物： 一般指具有殺菌或抑菌活性的藥物，包括各種抗生素、磺胺類、咪唑類、硝基咪唑類、喹諾酮類等化學合成藥物。 抗生素類包括: -內(nèi)酰胺類（青霉素類、頭孢菌素類、頭霉素類、亞胺硫霉素、單環(huán)內(nèi)酰胺類

3、及內(nèi)酰胺酶抑制劑）、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、林可霉素類及四環(huán)素類等。內(nèi)酰胺類：抑制細胞壁合成。青霉素類： 青霉素G、苯唑西林、阿莫西林、氨芐西林頭孢菌素類： 頭孢拉定等；頭孢呋辛 ；頭孢他啶；頭孢吡肟其他： 亞胺培南、氨曲南、頭孢西丁、氨芐西林/舒巴坦 氨基糖苷類： 作用于細菌體內(nèi)的核糖體，抑制細菌的蛋白質(zhì)合成的全過程，并破壞細胞膜的完整性。主要作用于G-桿菌 ，如鏈霉素、卡那霉素等大環(huán)內(nèi)酯類： 通過阻斷轉(zhuǎn)肽作用和mRNA位移而抑制細菌蛋白的合成。主要作用于球菌，如紅霉素、麥迪霉素等喹諾酮類： 通過拮抗細菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶，從而阻斷細菌DNA的復制而產(chǎn)生快速殺菌作用。主要作用于G- 桿菌，如環(huán)丙

4、沙星 、利福平等1）敏感： 由被測細菌引起的感染，除禁忌癥外，可用該抗菌藥物常用推薦劑量通過恰當治療而達到治療目的。2）中介： 被測菌株對該藥物的MIC 接近于血液、組織中通常可達到的濃度，而治療反應(yīng)率可能低于敏感菌株。3）耐藥： 被測菌株不能被該抗生素的常用劑量，在組織內(nèi)或血液中達到的濃度所抑制，提示該菌可能存在特定耐藥機制(如產(chǎn)-內(nèi)酰胺酶) ，而且治療研究表明其臨床療效不可靠。 4.抗菌藥物敏感性試驗結(jié)果判斷：原理： 將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸收瓊脂中水分溶解后不斷向紙片周圍擴散形成遞減的梯度濃度，在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)測試菌的生長被抑制，從

5、而形成無菌生長的透明圈即為抑菌圈。 抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的MIC呈負相關(guān)。 5.紙片擴散法（Kirby-Bauer法） （1）分類： 瓊脂稀釋法、肉湯稀釋法、微量稀釋法（2）原理： 用水解酪蛋白（MH）培養(yǎng)基將抗生素作不同濃度的稀釋，然后接種待測細菌，定量測定抗菌藥物對被測菌的最低抑菌濃度(MIC)或最低殺菌濃度（MBC）。6.稀釋法 （3）微量液體稀釋法原理： 聚乙烯板內(nèi)含有各種稀釋度的抗菌藥物，實驗時每孔加入100l濃度為105 CFU/ml的菌液，蓋上蓋板，37孵育1620h觀察結(jié)果?？椎撞壳逦怀霈F(xiàn)細菌沉淀的最低抗菌藥物濃度即為該抗菌藥物對細菌的

6、最小抑菌濃度，通過CLSI標準判斷其敏感和耐藥。7. E試驗 是一種結(jié)合稀釋法和擴散法原理對微生物藥敏試驗直接定量的技術(shù)。原理： E試條是一條5mm50mm無孔試劑載體，一面固定有一系列預先制備的濃度呈連續(xù)指數(shù)增長稀釋抗菌藥物，另一面有讀數(shù)和判別的刻度。抗菌藥物的梯度可覆蓋有20個MIC對倍稀釋濃度的寬度范圍。將E試條放在細菌接種過的瓊脂平板上，經(jīng)孵育過夜，圍繞試條明顯可見橢圓形抑菌圈，圈的邊緣與試條交點的刻度濃度即為抗菌藥物抑制細菌的最小抑菌濃度，對照CLSI標準判斷其敏感、耐藥、中介。 8.聯(lián)合藥物敏感試驗1）方法很多，其中紙片法最為常用。先將試驗菌均勻涂布于培養(yǎng)基表面，蓋好平皿，放置5分

7、鐘，待平板表面水分吸收后，將兩種含藥紙片貼于平板上，兩紙片中心距離2-4mm左右。然后35 孵育過夜，取出觀察結(jié)果。2）結(jié)果判斷聯(lián)合藥物敏感試驗可出現(xiàn)四種結(jié)果：A.無關(guān)作用： 甲+乙=甲單或乙單B.拮抗作用： 甲+乙甲單或乙單C.相加作用： 甲+乙=甲單+乙單D.協(xié)同作用： 甲+乙甲單+乙單三、實驗操作步驟（一）紙片擴散法：1. M-H平板：直徑為90mm，厚度 4mm。2. 菌懸液制備：無菌挑取菌落于無菌生理鹽水中，校 正濁度至0.5 麥氏。3. 用無菌棉簽浸入細菌懸液中，將棉簽在試管壁上輕 輕擠壓以擠去過多的菌液，用棉簽以連續(xù)劃線的方式均勻涂抹瓊脂平板表面三次（每次轉(zhuǎn)60）使菌液均勻分布，

8、最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周。蓋上平板的蓋子，放置310min。 4.用無菌鑷子將抗菌紙片粘貼于M-H瓊脂的表面，一旦紙片貼上，不能移動；各抗菌紙片中心距離應(yīng)大于 24mm，紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15mm。（濾紙直徑為6.35mm，-20保存，使用前放置室溫平衡。）5. 37孵育1624h6. 量取抑菌環(huán)直徑，根據(jù)CLSI標準，報告細菌對該抗生素敏感(S)、耐藥(R)、中介(I)。 （二）液體微量稀釋法1.菌液稀釋： 將已稀釋好的0.5麥氏的待測菌做200倍稀釋；2.抗生素稀釋： 取無菌離心管11支，每管加入250ul M-H液體培養(yǎng)基，在第1孔內(nèi)加入濃度為5120ug/ml的抗生素250ul，混勻；

9、吸取250ul此液體至第2孔中，混勻；依次倍比稀釋至第11孔.3.每人取無菌聚苯乙烯板條一條，共12孔；第1-11孔每孔加入100ul加抗生素，第12孔加100ulM-H液體，做對照；4.每個孔加入100ul濃度為105菌懸液（大腸或金葡），混勻，膠布封口，37C培養(yǎng)。 5.觀察濁度，凡孔底清晰或不出現(xiàn)細菌沉淀的最低藥物濃度即為該抗生素對被測菌的最低抑菌濃度（MIC）。四、 結(jié)果判斷及臨床意義敏感中介耐藥最小抑菌濃度(MIC) ： 可完全抑制細菌增長的最低藥物濃度。最低殺菌濃度(MBC)： 殺死99.9的供試微生物所需的最低藥物濃度。 如果受試藥物對供試微生物的MBC大于或等于32倍的MIC，可判定耐藥。 五、質(zhì)量控制：每批或每次實驗時應(yīng)根據(jù)測試菌種類分別選用標準菌株在同一試驗條件下進行測定。 如：金黃色葡萄球菌ATCC25923 大腸埃希