間接ELISA法測定抗人血清白蛋白效價(共5頁)

1、 PAGE - 7 - 間接(jin ji)ELISA法測定抗人血清(xuqng)白蛋白效價 作者(zuzh)：ZP（成都醫(yī)學(xué)院檢驗醫(yī)學(xué)院09級醫(yī)學(xué)檢驗本科二班，610500）【摘要】 目的 通過運用間接ELISA法，來測定抗人血清白蛋白的效價。方法 用抗原、酪蛋白分別包被、封閉微孔板，再加入待檢血清、一抗、二抗 ， 建立間接包被模式酶聯(lián)免疫法。 經(jīng)方陣滴定確定抗原和酶標(biāo)抗體的最適濃度后，測定抗體效價。結(jié)果 在包被的人ALB濃度為0.1ug/ml，二抗1：20000的稀釋倍數(shù)時，測出的抗人ALB的效價范圍為1：51200。結(jié)論 運用間接ELISA法，在檢測抗人ALB的靈敏度高，優(yōu)化了反應(yīng)條件，

2、可用于初步抗人ALB的檢測?！娟P(guān)鍵詞】 間接ELISA；抗人血清白蛋白；效價；羊抗人ALB、兔抗羊IgG-HRP 間接ELISA法，是目前最常用的方法，因其靈敏度高，操作簡便而被運用廣泛。此方法是測定抗體最常用的方法，屬于非競爭結(jié)合試驗。其原理是將抗原連接到固相載體上，樣品中待測抗體與之結(jié)合成固相抗原-受檢抗體復(fù)合物，再用酶標(biāo)二抗與固相免疫復(fù)合物中的抗體結(jié)合，形成固相抗原-受檢抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物，測定加底物后的顯色程度，確定待測抗體含量。此次試驗就是用間接ELISA測定未知的抗人ALB的效價。1、主要試劑、儀器、材料及主要溶液的配制1.1主要試劑：人ALB標(biāo)準(zhǔn)品（250mg/支）；一抗(羊抗

3、人ALB，效價 1:70 1ml/瓶，批號：201106 貯存于420，有效期：2年)；二抗(兔抗羊IgG-HRP，購自武漢博士德生物工程有限公司)；顯色劑：A液、B液，ME002 可溶性TMB顯色液；終止液（2M H2SO4）；包被液：0.05M PH9.6碳酸鹽緩沖液；洗滌液0.05%TWEEN-PBS；PBS緩沖液0.1M PH7.4；封閉液1%酪蛋白-PBST.1.2儀器：洗板機（BIO-RAD MODEL1575）、孵箱（上海-恒科學(xué)儀器有限公司 型號：DHP-9272）、SM-3自動化酶免疫分析儀（北京天石醫(yī)療用品制作所）1.3材料：96孔酶標(biāo)板 、一次性塑料試管 、加樣槍（上海求

4、精生化試劑儀器有限公司）1.4主要溶液的配制：1)、0.05Mol/L PH96的碳酸鹽緩沖液（包被稀釋液）：準(zhǔn)確稱取1.6g碳酸鈉，2.9g碳酸氫鈉于燒杯中加水適量使溶解，用去離子水定溶于1L的容量瓶中，同時調(diào)節(jié)PH值至9.6；2)、PH7.4 PBS緩沖液: 準(zhǔn)確稱取氯化鈉 8g，氯化鉀0.2g，十二水和磷酸氫二鈉3.58g，磷酸二氫鉀0.2g于燒杯中，用去離子水定溶于1L的容量瓶中，同時調(diào)節(jié)PH值至7.4；3)、封閉液1%酪蛋白-PBS-T：準(zhǔn)確稱取3g酪蛋白于以潔凈燒杯中，再加入300ml PBS溶液和150ul Tween20 。將燒杯置于電爐上邊攪拌邊加熱，直至酪蛋白完全溶解；4)

5、、洗滌液0.05%TWEEN-PBS：向1000 ml PH7.4 PBS緩沖液中加入500l Tween20。PBS-T既是洗板液也是溶解封閉劑酪蛋白（1%）的溶解試劑，配方為PBS+Tween20.2、方法(fngf)2.1微孔(wi kn)板制備：將96孔板劃分為四個區(qū)域，每個區(qū)域4行6列。在1至4區(qū)的每微孔中分別(fnbi)加入100ul濃度為10g/ml、1g/ml 、0.1g/ml、0.01g/ml的包被抗原，用標(biāo)簽紙封板后，于4下過夜。取出微孔板于洗板機中洗滌3次，拍干后，每孔加入300ul 1%酪蛋白-PBS-T封閉液,，用標(biāo)簽紙封板后，4過夜。2.2標(biāo)本及酶標(biāo)二抗的加入：從冰

6、箱中取出微孔板并于洗板機中洗滌3次，拍干后，向每一區(qū)域前5列微孔板中分別加入100l濃度為1:100,1:400,1:1600，1:6400,1:12800的標(biāo)本-羊抗人ALB，最后一列加入100l PBS/ 孔，封板后于37攝氏度烘箱中孵育。1小時后取出微孔板，洗滌5次，拍干后向每一區(qū)域一至四行微孔板中分別加入100l濃度1:1000,1:4000,1:16000，1:64000酶標(biāo)抗體兔抗羊-HRP，37孵育30分鐘。滴加一抗、二抗的布局如表1所示。羊抗人Alb血清羊抗人Alb血清兔抗羊-HRP1:1001:4001:16001:64001:12800PBS兔抗羊-HRP1:1001:40

7、01:16001:64001:12800PBS1:1000人ALB:10g/ml1:1000人ALB:1g/ml1:4001:4001:16001:16001:640001:64000羊抗人Alb血清羊抗人Alb血清兔抗羊-HRP1:1001:4001:16001:64001:12800PBS兔抗羊-HRP1:1001:4001:16001:64001:12800PBS1:1000人ALB:0.1g/ml1:1000人ALB:0.01g/ml1:4001:4001:16001:16001:640001:64000 表12.3顯色及OD值的測定：取出微孔板洗滌5次，拍干后每孔加入各50l顯色液A

8、,B液，于37攝氏度烘箱中孵育15至20分鐘后向每孔加入100l終止液。在SM-3自動化酶免疫分析儀上，于雙波長450nm（參比波長630nm）處，測各孔OD值。2.4血清(xuqng)效價的測定：根據(jù)(gnj)全班8個96孔板中篩選出包被抗原在0.01g/ml和0.1g/ml，二抗?jié)舛仍?：10000和1:20000的條件下，得出稍微有梯度的數(shù)據(jù)，然后根據(jù)以上數(shù)據(jù)設(shè)計(shj)如下確定實驗。包被抗原濃度分別為0.1g/ml、0.01g/ml包被酶標(biāo)板，封閉后，將待測血清按1：100、1:200、1:102400倍比稀釋后分別加入到1至11號的各酶標(biāo)孔中，最后第12孔加入PBS做空白對照，酶標(biāo)

9、二抗的加入濃度以1：10000，1：20000加入，（如表2所示），其他步驟同上2.12.3所述。 一抗二抗1:1001:2001:4001：8001:16001:32001:64001:128001:256001:512001:102400PBS1:10000人ALB:0.1g/ml1:200001:10000人ALB:0.01ug/ml1:20000 表23、結(jié)果3.1 酶標(biāo)抗體工作濃度的結(jié)果 預(yù)實驗檢測人ALB的最適濃度和兔抗羊-HRP最適比例，測得的光密度（OD值）： 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12ABCDEFGH1.9632.2532.0002.1382.195

10、1.8231.6091.8441.7911.9921.8671.3801.9251.7351.8512.0412.0911.7961.8351.9131.8431.6571.6441.5681.6191.8211.5961.3281.3771.1201.6931.5211.7441.0931.5150.9090.7860.6140.6100.5130.4270.0690.8201.0100.4300.3130.2540.6121.7651.5221.6581.7501.8711.7291.4261.6961.6402.0640.1381.5141.6761.9021.8061.7861.675

11、0.7431.4811.3781.3141.4391.7821.3681.2991.5031.4971.3921.5411.3560.4331.2471.3531.2701.3490.6391.1051.6061.2841.3401.5240.4060.3930.5290.2720.1761.1191.390 表3實驗結(jié)果顯示：本次預(yù)實驗中，4種不同包被抗原濃度組的結(jié)果均出現(xiàn)了不同程度跳躍，未出現(xiàn)正確的梯度變化，且背景太高，背景過高導(dǎo)致所有組均無法進(jìn)行線性分析，所以預(yù)實驗失敗。根據(jù)(gnj)全班8個96孔板中篩選出包被抗原在0.01g/ml和0.1g/ml，二抗?jié)舛仍?：10000和1:200

12、00的條件下，得出稍微有梯度(t d)的數(shù)據(jù)。 3.2待測血清(xuqng)效價的確定實驗結(jié)果 檢測人ALB的最適濃度和兔抗羊IgG-HRP最適比例，測得的光密度（OD值）： 一抗二抗1:1001:2001:4001：8001:16001:32001:64001:128001:256001:512001:102400PBSA1.2671.3311.3411.3821.0991.4010.7620.9850.7610.7360.2760.080B1.0140.8740.7950.7680.6040.5260.3830.3990.3360.1480.2810.086C1.6611.8861.327

13、1.3701.1021.0731.3580.9601.4760.5261.7751.362D0.9830.8740.8381.0210.7500.6221.1450.0910.7600.5870.8500.573 表4 本次確定實驗在包被抗原為0.1ug/ml，二抗?jié)舛仍?:20000的稀釋倍數(shù)下時得到梯度的數(shù)據(jù)，實驗成功。 分析上述表格，可以在包被抗原為0.1ug/ml，二抗?jié)舛仍?:20000的稀釋倍數(shù)下時，一抗與吸光度的線性關(guān)系最好，因此以包被抗原0.1g/ml，二抗1：20000的稀釋倍數(shù)為最佳工作濃度的情況下，標(biāo)本兔抗人白蛋白效價的線性范圍為1:1001:51200，以一抗稀釋倍數(shù)為

14、橫坐標(biāo)，對應(yīng)吸光度為縱坐標(biāo)，做回歸曲線：4、討論(toln) 本實驗采用間接ELISA的方法測定抗人血清白蛋白效價，利用抗原抗體(kngt)特異性結(jié)合，酶標(biāo)二抗與一抗結(jié)合后通過酶標(biāo)顯色后用酶標(biāo)儀測出OD值，再計算出空白(kngbi)值，根據(jù)樣品的OD值與空白值的之比，若大于2.1則為陽性，若小于2.1則為陰性。這樣即可確定工作濃度以及效價。在預(yù)實驗當(dāng)中，本小組并未得到很好的梯度來確定包被抗原與二抗的最適工作濃度，故在進(jìn)行確定實驗時是根據(jù)全班的實驗結(jié)果來確定的工作濃度，由于在包被抗原為0.1g/ml和0.01g/ml，二抗稀釋在1:16000時，有其它小組得出梯度數(shù)據(jù)，所以確定二抗的稀釋為1:1

15、0000和1:20000。 造成預(yù)實驗結(jié)果出現(xiàn)跳躍，未出現(xiàn)適宜的梯度可能的原因有：（1）本次實驗是有小組內(nèi)成員分工合作，共同完成的，由于每個人操作方法都存在著差異性，這樣勢必會給最后的結(jié)果造成極大的誤差；（2）實驗中由于加量的孔眾多，且均有一個人完成，容易造成每孔中的濃度與實驗設(shè)計的濃度不一致，這樣結(jié)果就不具真實性；（3）微孔板封閉后本應(yīng)4過夜后即拿出進(jìn)行洗板，但因為課程安排的問題，在封閉后第四天下午才進(jìn)行洗板，取出酶標(biāo)板部分孔底部有白色沉渣沉積，猜測可能因封閉時間太長，封閉液中已經(jīng)出現(xiàn)微生物污染，從而影響最后的實驗結(jié)果；（4）在加一抗和二抗時用手指放在反應(yīng)板上，手上很多雜質(zhì)比如蛋白質(zhì)、汗液、

16、細(xì)菌污染了反應(yīng)板，繼而影響了板底得抗原或者一抗二抗等物質(zhì)；（5）加入終止液的速度太慢，導(dǎo)致各孔的顯色時間不太統(tǒng)一，最終測出的OD值跳躍太大而沒有規(guī)律。待測血清效價的確定實驗通過測定各組合的OD值，分析結(jié)果得出當(dāng)包被抗原為0.1g/ml，二抗1：20000的稀釋倍數(shù)時，一抗與吸光度的線性關(guān)系最好。結(jié)論 通過(tnggu)間接ELISA法，我們確定了最佳抗原的工作(gngzu)濃度為0.1g/ml，二抗稀釋(xsh)倍數(shù)1：20000，標(biāo)本兔抗人白蛋白效價的線性范圍為1:1001:51200，回歸方程為y=-0.1292lnx+1.5827 ，R=0.988。故抗人ALB的效價為1:51200。參考文獻(xiàn)1 呂世靜. 臨床免疫學(xué)檢驗 M. 第2版. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，20102 曾常茜，陶志華. 臨床免疫學(xué)檢驗實驗指導(dǎo) M. 第2版. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，20103