分子標記技術在植物育種研究中的應用(共7頁)

1、生 物工程下游技術 學院(xuyun)：資源環(huán)境學院 專業(yè)：生物(shngw)技術1102班 姓名(xngmng)：李紅秀 學號：311103050201 指導老師：李剛 分子標記技術在動植物育種研究(ynji)中的應用 摘要(zhiyo) 分子標記是繼形態(tài)(xngti)標記、細胞標記和生物化學標記之后發(fā)展起來的一種的較為理想的遺傳標記形式,近年來發(fā)展非常迅速。本文主要介紹幾種應用在植物育種中的分子標記技術。分別闡述了它們的原理、方法步驟與優(yōu)缺點、應用范圍等。 關鍵詞 分子標記 植物育種 應用 分子標記（Molecular Markers），是以個體間遺傳物質內 HYPERLINK /view

2、/117213.htm t /_blank 核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，其研究始于20世紀80年代，它是 HYPERLINK /view/758.htm t /_blank DNA水平遺傳多態(tài)性的直接的反映。與其他幾種 HYPERLINK /view/226639.htm t /_blank 遺傳標記如 HYPERLINK /view/1015107.htm t /_blank 形態(tài)學標記、 HYPERLINK /view/1015140.htm t /_blank 生物化學標記、 HYPERLINK /view/1015111.htm t /_blank 細胞學標記相比，具有很多的優(yōu)點，

3、大多數(shù)分子標記為 HYPERLINK /view/716319.htm t /_blank 共顯性，對 HYPERLINK /view/1298951.htm t /_blank 隱性的性狀的選擇十分便利；基因組變異極其豐富，分子標記的數(shù)量幾乎是無限的；在 HYPERLINK /view/4579.htm t /_blank 生物發(fā)育的不同階段，不同組織的DNA都可用于標記分析；分子標記揭示來自DNA的變異；表現(xiàn)為中性標記； HYPERLINK /view/66302.htm t /_blank 檢測手段簡單、迅速等而被的廣泛應用于遺傳育種、 HYPERLINK /view/3853603.h

4、tm t /_blank 基因組作圖、 HYPERLINK /view/87883.htm t /_blank 基因定位、物種親緣關系鑒別、基因庫構建、基因 HYPERLINK /view/1364.htm t /_blank 克隆等方面。本文主要論述幾種植物育種中的分子標記技術。1 分子標記技術種類 1980年Bostern將生物個體之間DNA序列的差異作為標記用于遺傳作圖，從此開創(chuàng)了在DNA水平上研究遺傳變異的新階段?，F(xiàn)階段，隨著 HYPERLINK /view/667116.htm t /_blank 分子生物學技術的發(fā)展，DNA分子標記技術已有數(shù)十種，主要包括3種類型：一是建立在Sou

5、thern雜交基礎上的分子標記技術，如限制性內切酶片段長度多態(tài)性標記(RFLP )、染色體原位雜交(CISH)；二是以PCR為基礎的分子標記技術，它包括隨機擴增多態(tài)性DNA( RAPD )、擴增片段長度多態(tài)性 (AFLP) 、單鏈構象多態(tài)性(SSCP)、靶位區(qū)域擴增多態(tài)性(TRAP)、序列特征化擴增區(qū)域(SCAR)、相關序列擴增多態(tài)性(SRAP )等。第三類是基于 DNA芯片技術的分子標記，如單核苷酸多態(tài)性（SNP）表達序列標簽（EST）等1。目前(mqin),用于植物(zhw)育種的分子標記主要有限制性片斷(pindun)長度多態(tài)性（RFLP)、隨機擴增多態(tài)性DNA (RAPD)、微衛(wèi)星DN

6、A(SSR)又稱簡單重復序列，擴增片斷長度多態(tài)性(AFLP)等。2 限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)RFLP是應用最早的分子標記技術,1974年Grodzicker等創(chuàng)立了限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）技術，1980年Botesin提出RELP可以作為遺傳標記，開創(chuàng)了直接應用DNA多態(tài)性的新階段。RFLP原理為當用特定限制性內切酶處理不同生物體的DNA時,所產生的大分子片段長度可能不相同,這種限制性片段長度的差異就是限制性片段長度多態(tài)性,當這些長度不同的片段通過凝膠電泳時,就形成不同的帶,再通過與克隆的DNA探針進行Southern雜交和放射自顯影后,即獲得反映個體特性的RFLP圖譜,依據(jù)限

7、制性片段或位點的差異,計算DNA間的遺傳距離,據(jù)此來判定個體間、群體間或種間的差異。它所代表的是基因組DNA在 HYPERLINK /view/48578.htm t /_blank 限制性內切酶消化后產生片段在長度上差異。由于不同個體的等位基因之間 HYPERLINK /view/24576.htm t /_blank 堿基的替換、重排、缺失等變化導致限制 HYPERLINK /view/1327347.htm t /_blank 內切酶識別和酶切發(fā)生改變從而造成基因型間限制性片段長度的差異。 RFLP標記具有共顯性的特點,標記位點不受數(shù)量限制，可以區(qū)別純合基因型和雜合基因型,能夠提供單個位

8、點上的較完整的資料。但是RFLP標記對DNA的需要量較大，克隆能表現(xiàn)基因組DNA多態(tài)性的探針較為困難，而且實驗操作較繁瑣、檢測周期長、費用高，主要適用于研究進化關系較近種之間的系統(tǒng)發(fā)生關系,而用于相距較遠種時需特別小心,因為較遠種間的酶切片段同源性差,不能清晰地推演種間進化關系。RFLP遺傳圖譜是植物遺傳育種研究中的一個熱點.結合RFLP連鎖圖,任何能用RFLP探針檢測出的基因及其DNA片段都可以通過回交快速、有效地進行轉移.尤其是分離群體中進行目標性狀的檢測和篩選時,不再需要等到目標性狀表達,大大縮短了傳統(tǒng)回交育種的周期,減少了后期的篩選.李平等也利用RFLP標記構建了一張水稻分子連鎖圖譜。

9、黃烈健采用RFLP標記構建了包含124個標記的玉米RFLP連鎖圖,覆蓋玉米基因組1 999.8CM,標記間平均距離為16.5CM3。原始種、野生種和老品種中存在豐富的基因資源.如抗病基因、抗逆基因,及一些特殊用途的基因等.傳統(tǒng)方法在轉移這些基因時受到很大的限制,主要是因為無法保證種質資源中的目標基因實現(xiàn)轉移.利用RFLP技術能夠準確地標記定位種質中的目標基因,結合雜交、回交(hu jio)、組培等標記就可以快速有效地將所需目標基因的DNA片段引入栽培品種中,實現(xiàn)品種改良.因此在遺傳育種研究中運用RFLP進行基因定位十分廣泛4。3 隨機(su j)擴增多態(tài)性DNA (RAPD)RAPD，即隨機擴

10、增多態(tài)性DNA技術，是由美國科學家Wiliams和Welsh于1990年分別研究提出的，又稱任意引物PCR。RAPD是建立在PCR 基礎(jch)之上的一種可對整個未知序列的基因組進行 HYPERLINK /view/126521.htm t /_blank 多態(tài)性分析的分子技術。其以 HYPERLINK /view/3851989.htm t /_blank 基因組DNA為模板，以單個人工合成的隨機多態(tài) HYPERLINK /view/3851939.htm t /_blank 核苷酸序列為 HYPERLINK /view/352480.htm t /_blank 引物，在熱穩(wěn)定的DNA 聚

11、合酶或Taq 酶作用下，進行PCR 擴增。擴增產物經瓊脂糖或聚丙烯酰胺 HYPERLINK /view/25110.htm t /_blank 電泳分離、 HYPERLINK /view/480156.htm t /_blank 溴化乙錠染色后，在紫外透視儀上檢測多態(tài)性。擴增產物的多態(tài)性反映了基因組的多態(tài)性5。基因型不同的品種或不同親緣關系的物種, 基因組內核苷酸序列存在差異。當使用同一隨機引物對不同基因組體外擴增時, 基因組上與引物互補的DNA 片段的數(shù)目、位點是不同的, 因而其擴增產物的大小、數(shù)目也不同, 亦即擴增產物表現(xiàn)出多態(tài)性。當使用一系列不同的隨機引物擴增時, 這種多態(tài)性更加豐富。這

12、種擴增產物的多態(tài)性反映了被測材料的遺傳多樣性。進一步通過相關分析、聚類分析等數(shù)量遺傳分析手段, 還可以對不同親緣物種間的分類、遺傳距離、系統(tǒng)發(fā)育、親緣關系等進行研究。通過 RAPD 分析可以篩選出與目標基因連鎖的 DNA片段, 作為輔助育種的分子標記。很多植物的目標基因已經找到與其連鎖的RAPD分子標記, 這些標記在植物育種中發(fā)揮了重要作用。近等基因系是由提供目標基因的親本同輪回親本雜交, 并連續(xù)回交, 經每代對目標基因選擇而獲得。近等基因系也可以由自然突變或誘發(fā)突變產生。利用 RAPD 對這兩種基因組 DNA進行多態(tài)性檢測, 找出兩種基因組擴增產物的差異, 并以這些差異產物為探針,經 RFL

13、P 分析即可定位此基因。通過檢測遠緣雜種或體細胞雜種中特異性RAPD 標記的有無, 可以鑒定雜種的真實性。也可以通過建立品種(組合)的 RAPD 指紋檔案, 用來鑒定品種純度, 為種子質量提供可靠資料, 或用來保護品種專利6。4 簡單(jindn)重復序列(SSR)簡單重復序(SSR)也稱微衛(wèi)星DNA，其串聯(lián)重復的核心序列為1-6 bp，其中最常見是雙核苷酸重復，即(CA)n和(TG)n每個微衛(wèi)星DNA的核心序列結構相同，重復單位數(shù)目10-60個，其高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)數(shù)目的不同。SSR標記的基本原理：根據(jù)微衛(wèi)星序列兩端互補序列設計引物，通過(tnggu)PCR反應擴增微衛(wèi)星片段，由于核心

14、序列串聯(lián)重復數(shù)目不同，因而能夠用PCR的方法擴增出不同長度的PCR產物，將擴增產物進行凝膠電泳，根據(jù)分離片段的大小決定基因型并計算等位基因頻率。在真核生物中，存在許多2-5bp簡單重復序列，稱為“微衛(wèi)星DNA”其兩端的序列高度保守，可設計雙引物進行(jnxng)PCR擴增，揭示其多態(tài)性。SSR具有很多優(yōu)點，SSR數(shù)量極為豐富，而且分布于整個基因組,多態(tài)性高，等位位點多，因此信息含量極為豐富.它一般檢測到的是一個單一的多 HYPERLINK /s?wd=%E7%AD%89%E4%BD%8D%E5%9F%BA%E5%9B%A0&hl_tag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v

15、6zkg6 t /_blank 等位基因位點且呈共 HYPERLINK /s?wd=%E6%98%BE%E6%80%A7%E9%81%97%E4%BC%A0&hl_tag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t /_blank 顯性遺傳，故可鑒別雜合子和 HYPERLINK /s?wd=%E7%BA%AF%E5%90%88%E5%AD%90&hl_tag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t /_blank 純合子，另外所需DNA量少。然而，在采用SSR技術分析微衛(wèi)星DNA多態(tài)性時必須知道重復序列兩端的DNA序列的信息。如不能直

16、接從DNA數(shù)據(jù)庫查尋則首先必須對其進行測序。近年來，SSR作為分子標記所具有的優(yōu)點使其在植物遺傳育種中得到廣泛應用。SSR作為以PCR為基礎的第二代分子遺傳標記，是構建高密度分子遺傳圖譜的有效工具。近年來，國內外許多學者利用標記構建了許多植物的圖譜。通過研究DNA的差異來分析群體的遺傳結構及遺傳多樣性更為直接，對正確評價植物種質資源的遺傳多樣性、制訂育種策略十分重要。在水稻、玉米、小麥、大麥、大豆等作物中，SSR的多態(tài)性顯著高于RFLP。郭小麗等利用 108對SSR引物對36個優(yōu)質小麥品種和來自不同生態(tài)區(qū)的12個普通品種進行了遺傳差異分析和比較研究，共擴增出705個等位位點，平均每個位點有6.

17、53個等位變異，其中B 組位點的變異最多，聚類結果和品種的系譜來源及地域相吻合7。雜種優(yōu)勢是指兩個遺傳組成(z chn)不同的親本雜交產生的F1在扣除上位性效應后產生的比親本具有更強的生活力、生長勢、適應性、抗逆性和豐產性等現(xiàn)象。國內外學者對雜種優(yōu)勢的產生曾提出過顯性假說、超顯性假說、生活力學說、活性基因效應假說等觀點?，F(xiàn)代雜種優(yōu)勢理論認為，雜種優(yōu)勢的強弱在一定程度上取決于親本間遺傳差異的大小。番興明等利用SSR標記技術對18個優(yōu)質蛋白玉米自交系和4個代表國內主要雜種優(yōu)勢群的普通玉米標準測驗種進行了雜種優(yōu)勢群劃分，劃分結果與田間產量配合力劃分結果及系譜分析基本一致8。參考文獻12 李平,朱立煌,周開達,等.利用分子標記和水稻秈粳交雙單倍體群體(qnt)進行遺傳作圖研究.植物學報,1996,38(11):881-886.3 黃烈健,向道權,楊俊品,等.玉米PFLP連鎖圖譜(tp)構建及大斑病QTL定位.遺傳學報,2002,29(12):1100-1104.4 張漢堯,劉小珍,等.RFLP在植物遺傳育種研究中的應用