gxf畢業(yè)論文定稿教案資料

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。gxf畢業(yè)論文定稿吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文論文題目：不同配方稀釋液對銀黑狐精液冷凍保存質(zhì)量的影響年級專業(yè)：08級野生動物與自然區(qū)保護(hù)管理學(xué)生姓名：學(xué)號：0802605指導(dǎo)教師：評閱教師：完成日期：2012年5月10日吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院不同配方稀釋液對銀黑狐精液冷凍保存質(zhì)量的影響學(xué)生:專業(yè):野生動物與自然保護(hù)區(qū)管理指導(dǎo)教師:摘要用4種稀釋液對5只12歲的健康種銀黑狐精液進(jìn)行體外低溫保存，采用伊紅-苯胺黑法檢測精子活率，低滲腫脹法檢測精子質(zhì)膜的完整性，考馬斯亮藍(lán)染色法檢測精子的頂體狀態(tài)。結(jié)果表明：氨基乙酸

2、稀釋液低溫保存時(shí)精子的活率、質(zhì)膜的完整性、頂體的完整性明顯優(yōu)于其他3種稀釋液，在第3d時(shí)，精子活率為(63.592.48)%，質(zhì)膜完整性為(63.572.30)%，頂體完整性為(65.272.49)%。關(guān)鍵詞：銀黑狐；精液；冷凍保存；稀釋劑ThedifferentformulationstodilutesilverandblackfoxsemencryopreservationqualityinfluenceName:Major:WildanimalsandnaturereservemanagementTutor:SAbstractWithfourdilutestofivediluteonly

3、12yearsoldofthehealthofthesilverandblackfoxsemeninlowtemperaturepreservation,theIraqired-anilineblackmethodtodetectspermliverate,lowpermeabilityswellingmethodtodetecttheintegrityofthespermofmembrane,takeanexaminationofMaSiLiangbluestainingmethodtodetectthespermofthetopbodycondition.Theresultsshowtha

4、t:theaminoacidlowtemperaturepreservationdilutespermliverate,theintegrityoftheplasmamembrane,toptheintegrityofthebodyismuchbetterthanotherthreediluent,at3days,spermliverateis(63.592.48)%,plasmamembraneintegrityfor(63.572.30)%,topbodyintegrityfor(65.272.49)%.KeyWords：Silverblackfox；semen；cryopreservat

5、ion；thinner目錄TOCo1-3hzuHYPERLINKl_Toc326910566摘要PAGEREF_Toc326910566hIHYPERLINKl_Toc326910567AbstractPAGEREF_Toc326910567hIIHYPERLINKl_Toc326910568前言PAGEREF_Toc326910568h1HYPERLINKl_Toc3269105691材料與方法PAGEREF_Toc326910569h2HYPERLINKl_Toc3269105701.1材料PAGEREF_Toc326910570h2HYPERLINKl_Toc3269105711.1.1

6、試驗(yàn)動物PAGEREF_Toc326910571h2HYPERLINKl_Toc3269105721.1.2試驗(yàn)地點(diǎn)PAGEREF_Toc326910572h2HYPERLINKl_Toc3269105731.2精液的采集PAGEREF_Toc326910573h2HYPERLINKl_Toc3269105741.3精液的稀釋保存PAGEREF_Toc326910574h2HYPERLINKl_Toc3269105751.3.1稀釋液配方PAGEREF_Toc326910575h2HYPERLINKl_Toc3269105761.3.2精液的稀釋PAGEREF_Toc326910576h3HY

7、PERLINKl_Toc3269105771.3.3精液的保存PAGEREF_Toc326910577h3HYPERLINKl_Toc3269105781.4精液品質(zhì)評價(jià)PAGEREF_Toc326910578h3HYPERLINKl_Toc3269105791.4.1精子活率的檢測子活率的檢測PAGEREF_Toc326910579h3HYPERLINKl_Toc3269105801.4.2質(zhì)膜完整性的檢測PAGEREF_Toc326910580h4HYPERLINKl_Toc3269105811.4.3頂體狀態(tài)的檢測PAGEREF_Toc326910581h4HYPERLINKl_Toc3

8、269105822結(jié)果與分析PAGEREF_Toc326910582h4HYPERLINKl_Toc3269105832.1伊紅苯胺黑染色法檢測精子活率PAGEREF_Toc326910583h4HYPERLINKl_Toc3269105842.2低滲腫脹試驗(yàn)檢測精子質(zhì)膜完整性PAGEREF_Toc326910584h5HYPERLINKl_Toc3269105852.3考馬斯亮藍(lán)染色法檢測銀黑狐精液中頂體完整精子的比率PAGEREF_Toc326910585h6HYPERLINKl_Toc3269105862.4銀黑狐精液在不同稀釋劑保存下不同方法間的相關(guān)系數(shù)PAGEREF_Toc32691

9、0586h6HYPERLINKl_Toc3269105873討論P(yáng)AGEREF_Toc326910587h7HYPERLINKl_Toc3269105883.1卵黃對精液質(zhì)量的影響PAGEREF_Toc326910588h7HYPERLINKl_Toc3269105893.2甘油對精液質(zhì)量的影響PAGEREF_Toc326910589h7HYPERLINKl_Toc326910590結(jié)論P(yáng)AGEREF_Toc326910590h8HYPERLINKl_Toc326910591參考文獻(xiàn)PAGEREF_Toc326910591h9HYPERLINKl_Toc326910592致謝PAGEREF_T

10、oc326910592h10前言目前，狐人工授精技術(shù)作為養(yǎng)狐業(yè)的一項(xiàng)重大技術(shù)，在引進(jìn)芬蘭藍(lán)狐改良我國現(xiàn)有藍(lán)狐品質(zhì)的過程中，已愈來愈被廣大養(yǎng)狐者所重視。隨著人工授精技術(shù)的不斷開展，精液的體外保存就顯得十分重要。目前生產(chǎn)中主要使用鮮精進(jìn)行人工授精，受孕率也比較理想，但精子的存活時(shí)間短，使優(yōu)良的種狐資源難以得到充分利用，造成一些優(yōu)良精液的浪費(fèi)。由于精子解凍后的低成活率和人工授精后的低繁殖率，使得銀黑狐精液冷凍技術(shù)難以得到推廣1。精液的低溫保存可以減少冷凍對精子的損傷，而且存活時(shí)間比常溫時(shí)明顯延長，可用于人工授精。但隨著體外保存時(shí)間的延長，精子的受精能力會逐漸降低。所以，銀黑狐精液低溫保存及保存時(shí)精子

11、質(zhì)量的評價(jià)就顯得非常重要。在我國，研究狐的人工授精開始于20世紀(jì)60年代，而冷凍精液的研究是在人工授精工作的基礎(chǔ)上于20世紀(jì)90年代開始在生產(chǎn)上探索并應(yīng)用2，其結(jié)果遠(yuǎn)不如象家畜精液冷凍那樣擁有一整套完備的成熟技術(shù)措施，這是狐屬動物在人工飼養(yǎng)條件下繁殖力不高的表現(xiàn)。文獻(xiàn)查新表明，稀釋液是精子的保護(hù)劑，對精液的保存效果起決定性作用。關(guān)于銀黑狐冷凍稀釋液方面的研究報(bào)道很少。本選題設(shè)計(jì)不同稀釋液對銀黑狐精子低溫保存的影響的進(jìn)行研究，篩選出一種高效低溫保存銀黑狐精子的稀釋液配方，可以提高銀黑狐人工授精技術(shù)的效率。冷凍精液的應(yīng)用可進(jìn)一步提高優(yōu)良種公狐的配種潛力，可進(jìn)行種間雜交，可使母狐配種不受時(shí)間地域的限

12、制。通過研究不同配方稀釋液對銀黑狐精液冷凍保存質(zhì)量的影響3，篩選出一種高效低溫保存銀黑狐精子的稀釋液配方，可以提高銀黑狐人工授精技術(shù)的效率4，獲得更大的經(jīng)濟(jì)效益。為普及銀黑狐的冷配提供科學(xué)依據(jù)，對發(fā)展我國養(yǎng)狐業(yè)集約化、科學(xué)化和規(guī)范化飼養(yǎng)具有極其重要的意義。本研究對銀黑狐精液用伊利尼變溫液(IVT)、氨基乙酸、卵黃牛奶、葡萄糖卵黃4種低溫稀釋液稀釋保存，在05保存5d的過程中對精子的質(zhì)量從活率、質(zhì)膜的完整性、頂體的完整性進(jìn)行了檢測。利用伊紅苯胺黑檢測精子的活率；利用低滲腫脹實(shí)驗(yàn)檢測精子質(zhì)膜的完整性；利用考馬斯亮藍(lán)染色檢測精子頂體的狀態(tài)5。為探討行之有效的精液低溫保存的稀釋液配方，提高銀黑狐人工授

13、精技術(shù)的效率提供依據(jù)。1材料與方法稀釋液是精子的保護(hù)劑，對精液的保存效果起決定性作用。一般的稀釋液由糖類、蛋白質(zhì)、脂類、緩沖液、保護(hù)劑和其他添加物質(zhì)組成。動物精液種類不同，所用方法不同其稀釋液的組成也不同。本試驗(yàn)選用伊利尼變溫液(IVT)、氨基乙酸、卵黃牛奶、葡萄糖卵黃4種稀釋液對銀黑狐精液進(jìn)行低溫保存，從精子活率、質(zhì)膜完整性、頂體狀態(tài)3個(gè)方面對精子質(zhì)量進(jìn)行檢測，旨在篩選出一種高效低溫保存銀黑狐精子的稀釋液配方，為普及銀黑狐的冷配提供理論依據(jù)。1.1材料1.1.1試驗(yàn)動物試驗(yàn)動物為12歲的健康種銀黑狐5只，均為雄性。1.1.2試驗(yàn)地點(diǎn)精液采集于2012年2月至3月在吉林市左家狐場。稀釋液配制及

14、試驗(yàn)樣品測試在吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物繁殖實(shí)驗(yàn)室完成。1.2精液的采集采用手握法采精，將公狐固定于采精架上，呈站立姿勢，待其安靜后，用420.1%的高錳酸鉀水對陰莖及其周圍部位進(jìn)行消毒。然后，用右手拇指、食指和中指握陰莖龜頭尖端，上下輕輕滑動，待陰莖稍有突起時(shí)將陰莖由公狐兩后腿間拉向后方，上下按摩數(shù)次，約2030s，公狐即可產(chǎn)生射精反射，左手持集精杯隨時(shí)準(zhǔn)備接取精液。然后對鮮精液進(jìn)行品質(zhì)檢查6，選取活力在0.8以上，密度在10 x108個(gè)/mL以上的精液用于冷凍7。1.3精液的稀釋保存1.3.1稀釋液配方試驗(yàn)選用IVT、氨基乙酸、卵黃牛奶、葡萄糖卵黃4種稀釋液，4種稀釋液配方見表1-18。表1-1

15、銀黑狐精液低溫保存稀釋液成分(每100mL)成分稀釋液配方IVT氨基乙酸卵黃牛奶葡萄糖卵黃檸檬酸鈉/g2.000.72碳酸氫鈉/g0.21氯化鉀/g0.04葡萄糖/g0.305.50氨苯磺胺/g0.30氨基乙酸/g1.82乳糖/g1.00蔗糖/g0.16奶粉/g0.40甘油/g5.00卵黃/mL10.005.0020.0020.00鏈霉素/萬IU10101010青霉素/萬IU101010101.3.2精液的稀釋稀釋液均為實(shí)驗(yàn)當(dāng)日新配制，試驗(yàn)前將四種稀釋液作37水溶同溫處理，選取活力在0.8、密度在10 x108個(gè)/mL以上的精液，與預(yù)熱好的稀釋液，以精液：稀釋液=1：2(體積)的比例稀釋9。1

16、.3.3精液的保存將IVT、氨基乙酸、卵黃牛奶、葡萄糖卵黃4種稀釋液稀釋在35冰箱內(nèi)平衡2h。用鋁盒蓋距液氮面1cm左右，在-80-100下滴凍，1mL精液滴凍101粒，凍后取出凍精檢查精子活力后，再放入紗布袋內(nèi)浸入液氮罐保存。將稀釋后的4份精液分別在0，2，4，8，12h及1，2，3，4，5d取出適量的精液，放入37的恒溫水浴中升溫處理，升溫后的精子用伊紅苯胺黑染色、低滲腫脹試驗(yàn)和考馬斯亮藍(lán)染色進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)。1.4精液品質(zhì)評價(jià)1.4.1精子活率的檢測子活率的檢測將染色液伊紅(5%)、苯胺黑(1%)按1:1混合，37預(yù)熱。取少量稀釋后的精液與染色液迅速混合，制成抹片自然干燥，顯微鏡下觀察，死精

17、子為紅色，活精子不著色或只在頭部的核環(huán)處呈淡紅色。隨機(jī)觀察200個(gè)精子并計(jì)算出死活精子的比例。1.4.2質(zhì)膜完整性的檢測取lmL低滲液于集精杯中，37預(yù)熱5min，取稀釋后的精液0.1mL加入預(yù)熱的低滲液中，37孵育30min。在高倍鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)精子，數(shù)出精子尾部出現(xiàn)腫脹的百分率。1.4.3頂體狀態(tài)的檢測取80L精子稀釋液置于1mL生理鹽水中，10000r/min離心15s，棄上清液，取沉淀加1mL3.7%多聚甲醛和磷酸鹽緩沖液(PBS)后，用加樣器懸浮，室溫固定30min，離心，棄上清液，取沉淀用1mLPBS懸浮，離心，棄上清液，取沉淀用500800LPBS懸浮，涂片干燥，0.22%考馬

18、斯亮藍(lán)染色5min，用蒸餾水洗去染液后，干燥，中性樹膠封片、觀察。隨機(jī)選取200個(gè)頂體藍(lán)色、邊緣光滑的精子為具有完整頂體的精子類型10。2結(jié)果與分析2.1伊紅苯胺黑染色法檢測精子活率表2-1銀黑狐精液中活精子的比率%保存時(shí)間精液稀釋液IVT氨基乙酸卵黃牛奶葡萄糖卵黃0h82.91Aa1.0982.91Aa1.0982.91Aa1.0982.91Aa1.092h81.13Aa2.1581.23Aab1.9579.60Ab1.9680.55Ab1.494h78.56Ab1.7078.92Ab1.7975.99Bc1.7579.38Ab2.458h76.45Ab3.3675.47Ac2.6472.0

19、1Bd2.4376.05Ac2.2612h71.69ABc3.2472.15Acd2.6868.27Ce1.5974.28Ac2.701d65.96ABd4.1668.97ACde3.6064.48Bf2.0470.38Cd2.292d60.44Abe3.6565.57Cef2.8857.28Bg1.7364.73Ce3.193d48.78Af3.2263.59Bfg2.4842.07Ch2.6955.04Df2.804d27.56Ag2.2160.38Bgh3.3413.84Ci2.4120.01Dg4.955d6.01Ah2.1355.90Bh3.734.46ACj2.358.62ADh3

20、.65注:同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)大寫字母不同表示差異顯著(p0.05)；同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)小寫字母不同表示差異顯著(p0.05)。從表2-1可知：4種稀釋液保存精子活率的效果依次為氨基乙酸葡萄糖卵黃IVT卵黃牛奶。新鮮精液的精子活率是(82.911.09)%。4種稀釋液保存8h后活率仍在70%以上，IVT稀釋液保存的精子活率下降的最慢，而卵黃牛奶稀釋液下降的最明顯。保存12h后，只有氨基乙酸活率下降緩慢，其他幾種活率下降顯著(p0.05)。在5d時(shí)，4種稀釋液保存的精子活率都顯著下降，氨基乙酸稀釋液最好，為(55.903.73)%。2.2低滲腫脹試驗(yàn)檢測精子質(zhì)膜完整性表2-2銀黑狐精液中質(zhì)膜完整精子的比率%保

21、存時(shí)間精液稀釋液IVT氨基乙酸卵黃牛奶葡萄糖卵黃0h83.39Aa1.7783.39Aa1.7783.39Aa1.7783.39Aa1.772h81.27Aa2.1980.25Ab2.5779.84Aab3.8882.15Aab2.284h78.10Ab2.6478.33Abc2.7977.89Abc2.7980.34Abc2.428h75.26Ac1.5776.55ABc2.9575.61Acc2.0378.34BCcd2.6912h71.71Ad2.7273.39ABcd4.7472.17Ad3.0476.03Bde2.931d67.33Ae3.0369.81Ade2.3069.34ABd

22、3.4973.03Be2.292d59.48Af3.1366.72Bef3.3861.21Ac2.7365.18Bf1.513d50.65Ag2.9463.57Bfg2.3045.26Cf3.0956.25Dg3.174d29.52Ah1.8661.47Bg2.1215.40Cg2.3526.99Ah3.335d7.63Ai1.3356.97Bh3.188.72Ah2.1914.80Ci2.86注:同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)大寫字母不同表示差異顯著(p0.05)；同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)小寫字母不同表示差異顯著(p0.05)。從表2-2可知：4種稀釋液保存精子質(zhì)膜完整性比率依次為氨基乙酸葡萄糖卵黃IVT卵黃牛奶。新鮮精

23、液中精子質(zhì)膜完整的比例為(83.391.77)%。4種稀釋液除氨基乙酸在3d后精子質(zhì)膜完整性迅速下降。在5d時(shí)，4種稀釋液保存的精子質(zhì)膜完整性都顯著下降(p0.05)，氨基乙酸稀釋液最好，為(56.973.18)%。2.3考馬斯亮藍(lán)染色法檢測銀黑狐精液中頂體完整精子的比率表2-3銀黑狐精液中頂體完整精子的比率%保存時(shí)間精液稀釋液IVT氨基乙酸卵黃牛奶葡萄糖卵黃0h83.62Aa1.5083.62Aa1.5083.62Aa1.5083.62Aa1.502h81.95Aab3.4181.66Aab3.4680.62Abc2.2682.85Aab1.334h78.95Abc1.9879.45Abc1

24、.7278.26Acd2.7381.02Aab2.678h76.04Acd3.7277.09Acd2.4476.81Ad2.2079.53Abc3.6512h73.36Ade1.8575.42ABd2.7173.03Ae1.2777.39Bc2.591d69.78Ae3.6171.31Ae2.8370.55Ae2.8873.33Ad2.912d61.77Af2.8569.24Bef3.7861.79Af2.1266.58Be2.753d52.69Ag3.1265.27Bfg2.4946.54Cg2.3761.12Df3.114d31.42Ah2.5163.75Bg2.2219.02Ch2.22

25、28.81Ag2.115d13.31Ai1.9960.52Bh2.039.74Ci2.0218.13Dh2.37注:同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)大寫字母不同表示差異顯著(p0.05)；同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)小寫字母不同表示差異顯著(p0.05)。從表2-3可知：4種稀釋液對藍(lán)狐精液頂體完整性的保存效果依次為氨基乙酸葡萄糖卵黃IVT卵黃牛奶。新鮮的精液中，具有完整頂體精子的百分率為(83.621.50)%。4種稀釋劑保存12h精子頂體完整比率非常高。當(dāng)保存1d時(shí)，4種稀釋液頂體完整性還很高，之后頂體完整性比率不斷下降，氨基乙酸稀釋液下降緩慢。在5d時(shí)，氨基乙酸稀釋液最好，為(60.522.03)%。2.4銀黑狐精液在不同

26、稀釋劑保存下不同方法間的相關(guān)系數(shù)表2-3不同方法檢測銀黑狐精子在不同稀釋液低溫保存時(shí)質(zhì)量的相關(guān)系數(shù)方法伊紅苯胺黑低滲試驗(yàn)考馬斯亮藍(lán)伊紅苯胺黑0.99860.9981低滲試驗(yàn)0.99860.9991考馬斯亮藍(lán)0.99810.9991用低滲腫脹試驗(yàn)和考馬斯亮藍(lán)染色法同時(shí)檢測精子頭尾部膜的功能狀態(tài)，用伊紅苯胺黑染色和考馬斯亮藍(lán)染色法同時(shí)檢測精子的活率和頂體的完整性，結(jié)果均高度相關(guān)，顯示數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠。3討論稀釋液對精子的體外保存起著決定性的作用，稀釋液的成分影響精液的質(zhì)量11。3.1卵黃對精液質(zhì)量的影響試驗(yàn)選擇的4種稀釋液中都加入了卵黃，通常卵黃被用來防止冷刺激，它可以直接滲透到質(zhì)膜內(nèi)，保持質(zhì)膜穩(wěn)定性

27、，防止由于膜不穩(wěn)定引起獲能、頂體反應(yīng)導(dǎo)致的精子死亡。3.2甘油對精液質(zhì)量的影響試驗(yàn)中，氮基乙酸可作為精子呼吸的代謝基質(zhì)，增強(qiáng)其存活時(shí)間。葡萄糖卵黃稀釋液中加入了甘油，甘油作為一種抗凍物質(zhì)已廣泛應(yīng)用于冷凍精液中12，但在低溫稀釋液中加入甘油，保存效果并不十分理想13。這可能是由于低溫保存時(shí)精子的新陳代謝作用比冷凍保存時(shí)活躍，而甘油具有弱毒性且能滲入到精子內(nèi)，使精子的形態(tài)受到損傷。IVT稀釋液中的碳酸氫鈉和氯化鉀雖能補(bǔ)充保存過程中鈉、鉀離子的缺失，但對精子保存效果并不理想。卵黃牛奶稀釋液中的牛奶和卵黃都含有卵磷脂、脂蛋白及其復(fù)合物，具有防止精子冷體克的作用，但二者在同一稀釋液中的保存效果不明顯，是4種低溫稀釋液中對精子保存效果最差的，與期望結(jié)果差異顯著，其原因還需進(jìn)一步深入研究14。結(jié)論4種稀釋液對銀黑狐精子低溫保存效果依次為氨基乙酸葡萄糖卵黃IVT卵黃牛奶。低溫稀釋液IVT、葡萄糖卵黃、卵黃牛奶稀釋液在保存2d、氨基乙酸稀釋液在保存4d時(shí)精液中精子的活率、質(zhì)膜及頂體的完整性仍高于60%，均可用于輸精，氨基乙酸稀釋液是4種稀釋液中對精子低溫保存效果最好的。利用氨基乙酸稀釋液低溫保存銀黑狐精子的稀釋液配方，可以解決精子解凍后的低成活率和人工授精后的低繁殖率的問題，使得銀黑狐精液冷凍技術(shù)得以推廣，提高經(jīng)濟(jì)效益，對發(fā)展我國科學(xué)化集約化養(yǎng)狐有促進(jìn)作用。