神經生物學的常用研究方法ppt課件

1、五、神經生物學常用的研究方法（一）形態(tài)學方法（二）生理藥理學方法（三）生物化學方法（四）電生理學方法 （五） 分子生物學方法 （六）腦成像（Brain imaging）技術 .（一）形態(tài)學方法1、束路追蹤法2、免疫組織化學法3、原位雜交法4、受體定位法.束路追蹤法 研究神經元之間的纖維聯(lián)系是神經科學研究領域的一個基本問題，其研究方法主要有三：（1）利用神經元軸漿運輸現象的追蹤法，是目前應用最廣者；（2）利用神經元胞體受損或軸突離斷后遠側軸突的變性，或軸突切斷后胞體的反應特性的變性追蹤法；（3）利用某些熒光染料在神經細胞質膜擴散的神經元質膜熒光追蹤法。.（1）軸漿運輸追蹤法 軸漿運輸：神經元有長

2、短不等的軸突，由于軸突內缺乏參與蛋白質合成的核糖體，所以需要從細胞體不斷地將各種成分運輸至軸突及其分支以維持其代謝；在神經末梢釋放的神經肽及合成經典遞質的酶也需在胞體合成；從末梢也有影響細胞代謝的物質如神經營養(yǎng)因子等逆向傳送至胞體。不同物質的運輸速度不同。順行運輸：從胞體向軸突及其終末的運輸。逆行運輸：從軸突及其終末向胞體的運輸。.常用方法：a 辣根過氧化物酶追蹤法 1971年，Kristenson和Olsson首先報道辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）可被神經末梢攝取，經軸漿逆行運輸至神經元胞體，然后用組織化學方法即可顯示出神經元的輪廓，從而創(chuàng)建了HRP追

3、蹤神經元示蹤技術，即HRP法。 HRP即可作逆行追蹤劑使用，也可作順行追蹤劑使用。 基本步驟： 將HRP注射至實驗動物中樞核團或周圍器官、神經的一定部位；存活一定時間后灌注、固定動物，取材作冰凍切片；然后用雙氧水（H2O2）及呈色劑四甲基聯(lián)苯胺（TMD）或二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯示HRP反應產物。 .將HRP注射于周圍神經感覺末梢或神經干逆向標記背根神經節(jié)細胞后，HRP還可進一步沿背根節(jié)細胞的中樞突順向標記其在脊髓的中樞終止部位，稱作跨節(jié)標記。.HRP：1.游離HRP： 通過非特異性整體胞飲的方式被攝入 2.結合HRP：通過與細胞膜的特異性受體結合的介導進入神經元 麥芽凝集素（WGA）-HRP

4、 霍亂毒素（CT）-HRP 優(yōu)點：靈敏度高，用量較少， HRP在胞內降解時間明顯延長，能清晰地顯示包括細微分支在內的整個神經元的全貌。 注意：因為HRP到達預定部位的時間取決于運輸速度和距離，運輸速度因動物及纖維種類而異。同時HRP被運至胞體后即被送入溶酶體內水解。因此在聚集和降解兩個相反的過程中求得最佳存活期必須具體測試。呈色劑： 1.二氨基聯(lián)苯胺(DAB): DAB作為供氫體，HRP在H2O2存在的情況下，能使DAB發(fā)生氧化，生成不溶性棕褐色反應產物沉淀，定位在抗原所在處。 2.二鹽酸聯(lián)苯胺(BDHC) 3.鄰-聯(lián)茴香胺(OD) 4.四甲基聯(lián)苯胺(TMB)用途： 研究臟器的神經支配、中樞內

5、核團間的聯(lián)系等。還可與免疫組織化學、電鏡技術等結合。.HRP labelling neurons in oculomotor nucleus of cat 10 40.HRP labelling neurons in dLGN40.b 熒光素追蹤法-主要作逆向追蹤 1977年，荷蘭著名神經解剖學家Kuypers及其同事首先發(fā)現部分熒光化合物可被神經纖維的末梢攝取，并通過軸漿流逆行運輸到各自的神經元胞體，切片后在熒光顯微鏡下可直接觀察到這些胞體的定位，從而建立了研究神經纖維聯(lián)系的熒光素逆行追蹤法。 原 理： 將熒光物質注射至神經元的軸突分布區(qū), 經分支的末梢吸收后，循軸突逆行輸送至胞體。在熒光顯

6、微鏡 下可看到胞體內呈現熒光標記物。 .熒光素追蹤劑是一種暴露在一定激發(fā)波長光照下，以一定發(fā)射波長發(fā)出一定顏色熒光的化合物。每一種熒光素都有各自的激發(fā)波長和發(fā)射波長，不同的發(fā)射波長決定了這些熒光素發(fā)出的熒光顏色各異。不同熒光素在神經元內的標記特征不同： 絕大多數標記細胞質，如熒光金（Furogold，靈敏度高，能較好顯示樹突分支，只標記胞漿；在胞體內分解慢，甚至在注射后存活2個月標記強度仍無明顯變化；比較耐紫外線的照射，褪色比較緩慢；可以經受許多組織學染色處理，因而可以和HRP、免疫組織化學等結合使用），fast bule（固藍）等。 只有少數僅標記細胞核，如nuclear yellow（核黃

7、 ）, diamidino yellow（雙脒基黃）等。. Fast blue labelling neuronsDRGSpinal cord2020.Fast Blue LadellingGanglion Cells of Retina 20.優(yōu)點：可靠性，靈敏性， 利用其不同顏色可同時追蹤和顯示多重神經聯(lián)系。因此可選擇一種或兩種以上的熒光素分別對神經元進行單標、雙標或多重標記。 雙重標記和多重標記可用來研究神經元軸突的分支投射。若在腦內不同核團或區(qū)域分別注射兩種（或三種）不同熒光，在同一神經元胞體內能觀察到兩種（或三種）不同顏色的熒光，即說明該神經元的軸突分支分別投射到注射這些熒光劑的兩個

8、（或三個）腦內不同核團或區(qū)域。 需要注意的是各種熒光素逆行運輸的速度不同，所以動物存活時間也有差異。雙重標記是，有時需要做兩次手術先注射運輸慢的熒光素，過一定的時間后，再注射運輸較快的熒光素。缺 點：激發(fā)光照射下很快褪滅，因此允許觀察的時間較短，保存時間也有限。應 用：研究神經元的軸突分支至不同部位的投射?？膳c免疫組織化學結合，研究投射神經元的化學性質。.（2）變性束路追蹤法 利用神經元的軸突被損傷之后，在損傷的近側端和遠側端分別發(fā)生逆行和順行潰變；神經元胞體受損后，其發(fā)出的軸突從胞體向終末方向的遠側端發(fā)生順行潰變，來研究纖維的聯(lián)系。.損傷手段：物理性方法 銳器的切割、電凝、電離破壞、超聲破壞

9、等 特點：無選擇性，除了損傷神經元和發(fā)出的纖維以外，也能破壞通過此損傷部位的纖維，導致非特異性標記?；瘜W性破壞 單胺類神經毒劑：6-羥多巴胺（可選擇性被兒茶酚胺類神經元攝入，經過自氧化形成若干具有細胞毒性的產物。由于整個神經元的細胞膜均可攝入6-羥多巴胺，故兒茶酚胺類神經元的任何部位都可被6-羥多巴胺破壞。不易通過血腦屏障，因此如欲造成中樞性破壞，需做腦室或腦內注射）、6-羥多巴、5,6-雙羥色胺和5,7-雙羥色胺（選擇性破壞5-羥色胺能神經元） 膽堿類神經毒劑：乙基膽堿氮芥丙啶正離子 興奮性氨基酸：海人酸和鵝高蕈氨酸（能夠非選擇性損傷神經元的胞體，而不損傷軸突，故無過路纖維受損問題）.研究方

10、法： 20世紀從40年代，鍍銀染色法，根據銀染潰變纖維的形態(tài)變化來判斷、追蹤潰變纖維的方法。 20世紀從50年代，Nauta法，一種改進的潰變鍍銀法，能抑制正常纖維的染色而僅染出潰變纖維。 20世紀70年代，變性束路追蹤法逐漸被軸漿運輸追蹤法所代替?？膳c逆行標記法、順行標記法、免疫組織化學、原位雜交等技術結合運用。.（3）神經元質膜熒光染色法這類染料是利用它們能溶于細胞膜脂層內并在膜內擴散的特點?？捎迷诨铙w或固定的標本上追蹤纖維聯(lián)系。這類染料中DiI、DiA和DiO最常用。主要優(yōu)點是可用于固定標本，一些難以在活體注射的小核團在固定標本上常比較容易做到。缺點是其在膜內擴散的速度很慢，而且有效距離

11、比較短，因此最適用于胚胎或小動物。.免疫組織（細胞）化學法 20世紀70年代，免疫組織化學技術被引入腦研究領域，它以特異性強、靈敏度高的特點，使神經元內所含的神經活性物質、受體和轉運體可視化，給形態(tài)學研究開辟了新的途徑。.基本原理 利用免疫學中抗原與抗體特異性結合的特點以及組織化學的原理，在組織或細胞標本中加入特定的標記抗體，然后對標記物進行顯示，從而對組織或細胞內的抗原物質進行定性、定位或定量研究。免疫酶技術顯示Caspase-3免疫熒光技術顯示MOR.因為抗原與抗體的結合是高度特異的，所以免疫組織化學方法具有高度的特異性、靈敏性和精確性。免疫組織化學的抗原通常是肽或蛋白，有數量不等的抗原決

12、定簇。抗原決定簇由暴露于抗原表面、在空間上相鄰的3-8個氨基酸組成。一個抗原上可以有多個抗原決定簇。故由此而產生的抗血清中可能含有針對不同決定簇的多克隆抗體。用雜交瘤技術可以制成針對單個決定簇的單克隆抗體?？贵w僅識別特定的抗原決定簇，而不識別抗原本身，因此不同物質只要有相同的抗原決定簇，均可被同一抗體識別，所以在免疫組織化學法中應注意抗體的特異性及交叉反應。. 抗體（antibody, Ab）機體免疫細胞被抗原激活后，由分化成熟的終末B 細胞漿細胞合成、分泌的一類能與相應抗原特異性結合的具有免疫功能的球蛋白。是介導體液免疫的重要效應分子。典型的免疫球蛋白分子呈Y字型，由兩條相同的重鏈（heav

13、y chain, H）和兩條相同的輕鏈（light chain, L）借二硫鍵連接而成。在氨基端，重鏈的1/4和輕鏈的1/2氨基酸序列變化很大，為可變區(qū)（variable region, V）；其他部分氨基酸序列相對恒定，為恒定區(qū)（constant region, C）。.Fab即抗原結合片段（fragment antigen binding），由一條完整的輕鏈和部分重鏈（VH和CH1）組成。該片段具有單價抗體活性，能與一個相應的抗原決定族特異性結合。Fc即可結晶片段（fragment crystalline），Fc段含有兩條重鏈C端的一半，包含CH2和CH3兩個功能區(qū)，它無抗體活性。Ig在異

14、種間免疫所具有的抗原性主要存在于Fc段，同時Fc段還具有活化補體、親細胞、通過胎盤和介導與細菌蛋白結合等生物學活性。用木瓜蛋白酶水解IgG分子，可將其裂解為兩個完全相同的Fab和一個Fc片段。 . 多克隆抗體（polyclonal antibody, PcAb） 大多數天然抗原物質(如細菌或其分泌的外毒素以及各種組織成分等)往往具有多種不同的抗原決定簇，而每一決定簇都可刺激機體產生一種特異性抗體。多克隆抗體是多個抗原決定簇刺激機體后，由多個免疫淋巴細胞分泌的多種抗體的混合物。 PcAb 特異性差，易出現交叉反應。.由單一克隆B細胞雜交骨髓瘤細胞產生的，只識別一種抗原表位的具有高度特異性的抗體。

15、優(yōu)點：結構均一、純度高、特異性強、效價高、易大量制備。制備單一表位特異性抗體的理想方法是獲得針對單一表位的漿細胞克隆，使其在體外擴增并分泌抗體。但漿細胞在體外的壽命較短，也難以培養(yǎng)。于是，將可產生特異性抗體但短壽的漿細胞與無抗原特異性但長壽的惡性漿細胞瘤細胞融合，建立了可產生單克隆抗體的雜交瘤細胞和單克隆抗體技術。 單克隆抗體（monoclonal antibody, McAb）. 組織（細胞）化學是介于細胞學與化學之間的一門科學。細胞化學的目的是使用細胞學和化學的方法使細胞（組織）內的某些化學成分發(fā)生反應，在局部形成有色反應物，藉此對各種活性物質在顯微鏡水平進行定性、定位和定量分析。 酶組織

16、化學：利用酶對底物的催化作用，使底物發(fā)生顏色變化，其次對該酶進行定位、定量分析。. 在應用組織化學技術顯示組織和細胞內化學物質及定位和定量以及代謝狀態(tài)時，需要滿足以下要求：保持組織和細胞形態(tài)結構的良好狀態(tài)，以便反應產物的定位精確。如果形態(tài)結構破壞而失真，則定位困難。具備一定的特異性，以便獲取正確的實驗結果。具備一定的靈敏性，以便含量極微的物質也能被顯示出來。 生成的反應產物必須是有色沉淀，顆粒微細不溶，定位于原位。反應物沉淀的顏色深度與相應物質含量或酶的活性具有一定的量效關系。反應產物具有穩(wěn)定性，以便于重復觀察要有重復性。 選擇的試劑必須是分析純，對被檢測物質或酶應無任何影響；實驗所用器皿必須

17、清潔無污染雜質，使用的蒸餾水應為雙蒸水。為了保證實驗的可靠性、科學性，防止假陽性的發(fā)生，必須同時作對照實驗。.免疫組織化學的技術分類 根據AgAb結合方式分成： 直接法 間接法 多層法 根據染色方式分成： 貼片染色 漂浮染色.按標記物的性質分成：免疫熒光技術（免疫熒光法）免疫酶技術（酶標抗體法、橋法、PAD法、 ABC法）免疫金屬技術（免疫鐵蛋白法、免疫金染色法、蛋白A金法）標記物必要性：組織細胞內AgAb結合反應一般是不可見的，若在鏡下檢測，則必須具有可視性標記物。所以需要用標記的方法將某種標記物（如酶、熒光素）結合到抗體上，再用組織化學方法顯示此標記物或在熒光顯微鏡下觀察熒光素發(fā)出的熒光。

18、.常用標記物 熒光素：最常用的是異硫一氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate, FITC） 熒光顯微鏡下呈綠色熒光；Texas red 熒光顯微鏡下發(fā)紅色熒光 酶：辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶。 生物素：Biotin 鐵蛋白金等：主要應用于免疫電鏡。 其他：如同位素（因涉及污染和防護難一般不用）.應 用 凡是組織細胞內具有抗原性的物質，如肽類、激素、神經遞質、細胞因子、受體、表面抗原等等均可用免疫組織化學方法顯示，因而目前在基礎與臨床科研中被廣泛應用。最近幾年，分子生物學研究異?；钴S，但最終還要歸到形態(tài)上來。用免疫組織化學方法對所研究的大分子分子進行定位，進而深入研究其

19、功能。.免疫組織化學染色的基本過程固定：由于在進行免疫組織化學反應時，蛋白質或肽類在體內易分解，并從活體存在的部位流失，而必須盡可能在接近活體的狀態(tài)下，在盡可能短的時間內用固定劑將之交聯(lián)起來，在原位固定那些物質。常用的固定液包括甲醛、多聚甲醛、戊二醛等。制片：切片（冰凍切片對抗原保存性好，石蠟切片，樹脂切片，震動切片）、鋪片（視網膜）、細胞爬片反應.固定方法：推注，滴注滴注步驟： 1、開胸 2、暴露心臟 3、自心尖剪開左心室 4、插入灌流針至主動脈弓 5、固定灌流針 6、快速注入沖洗液（有時可免） 7、先快后慢注入固定液 8、慢注畢，將動物裝入含 有少量固定液的塑料袋 置4C冰箱內靜置2h后取

20、材.染色方法ABC法PAP法.熒光標記免疫組織化學酶聯(lián)免疫組織化學.1、免疫熒光細胞化學染色方法（1）直接法 熒光素直接標記在特異性第一抗體上，熒光素標記的抗體直接與組織切片上相應的抗原結合，一次孵育成功，在熒光顯微鏡下觀察檢測抗原。 優(yōu)點：簡單，時間短，特異性強。缺點：靈敏度低，所需抗體量大（不經濟）。應用：基本不用了.（2）間接法 先用第一抗體孵育組織切片，在第一抗體與組織中的抗原結合后，再用熒光素標記的第二抗體孵育，第二抗體是抗產生第一抗體的動物（如兔、羊、小鼠等）的IgG的抗體。通過上述步驟用熒光素標記的第二抗體與第一抗體結合的方法來間接顯示抗原所在的部位。 優(yōu)點：較直接法靈敏，而且只

21、需標記一種抗IgG抗體即可鑒定多種抗原。.免疫熒光雙標記法（1）直接法甲熒光標記的抗甲抗原抗體乙熒光標記的抗乙抗原抗體甲抗原乙抗原.（2）間接法甲抗原乙抗原抗甲抗原抗體抗乙抗原抗體乙熒光標記的第二抗體（二抗）甲熒光標記的第二抗體（二抗）. 兩種第一抗體需來自不同種屬的動物。將兩種第一抗體混合后與組織孵育，然后用不同熒光素（如FITC和Texas Red）標記的二抗混合孵育，各自與其一抗結合。兩種熒光素在熒光顯微鏡下發(fā)出不同熒光，可以更換濾色片系統(tǒng)分別進行觀察。.免疫熒光雙標記法的應用：1.將兩種抗體分別用不同的熒光素加以標記，用來顯示含有不同成分的兩種細胞在同一區(qū)域的定位模式激光掃描共聚焦顯微

22、鏡觀察.免疫熒光雙標記法的應用：2. 將兩種抗體分別用不同的熒光素加以標記，用來定位同一細胞內存在的兩種不同成分.2、免疫酶組織化學染色方法 用酶標記抗體和用組織化學方法顯示結果，間接的對抗原物質進行定位。酶類標記物滿足的條件：酶催化底物必須是特異的，并容易被顯示（產物易于鏡下觀察）；酶反應形成的終產物必須是穩(wěn)定的沉淀，不能從酶活性部位向周圍組織彌散；容易獲?。儯?；中性pH值時，具有穩(wěn)定性；酶標記至抗體上不影響酶和抗體的活性。 .常用酶類標記物辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP），H2O2和DAB（diaminobenzidine, 二氨基聯(lián)苯胺）為其常用

23、底物，產物為穩(wěn)定的棕黃色沉淀.堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, AP）：BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate，5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽) 和 NBT（Nitro-Blue-Tetrazolium，四氮唑藍）是AP的常用底物組合，其中，NBT作為氧化劑, BCIP作為AP底物。BCIPBCIP被AP水解成一種藍色的中間物，后者然后被NBT氧化形成二聚體（不溶性紫藍色沉淀）。.（1）PAP法 過氧化物酶抗過氧化物酶（Peroxidase anti-peroxidase method, PAP）法PAP作為特異性顯色基團。

24、每個PAP復合物含個抗HRP的IgG分子及個HRP分子。DAB作為供氫體，HRP在H2O2存在的情況下，能使DAB發(fā)生氧化，生成不溶性棕褐色反應產物沉淀，定位在抗原所在處。首先，特異性第一抗體（多為兔、羊或小鼠IgG）孵育組織切片。其次用抗第一抗體的抗體（如羊抗兔IgG 或驢抗小鼠IgG ）作橋接。然后用PAP復合物與橋抗體結合。最后，用HRP的底物來顯示PAP復合物。.優(yōu)點：靈敏度高，所用第一抗體的濃度可低于間接熒光法倍左右，并可長期保存。注意：橋抗體IgG分子有兩個Fab段，一個與第一抗體結合，另一個與PAP復合物結合。橋抗體的兩個Fab段是相同的，因此第一抗體及PAP復合物中的抗HRP抗

25、體必須來自同一種動物。.（2）ABC法卵白素-生物素- HRP復合物染色法（Avidinbiotinylated horeseradish peroxidase complex method，ABC法） Avidin：卵白素，一種糖蛋白，每個分子上有4個與生物素親和力極高的結合位點，可以結合4個生物素。Biotin ：生物素，為一小分子維生素，易于很多生物分子交聯(lián)。ABC是卵白素-生物素結合的 HRP復合物的簡稱，每一個卵白素分子上結合個帶HRP 的生物素，留出一個能與其他生物素結合的空位。ABC復合物HRP卵白素生物素.ABC法是在第一抗體反應后，用生物素結合的IgG抗體（ biotinyl

26、ated IgG）橋接。然后用ABC孵育，使橋抗上的生物素與ABC中卵白素上的空位結合。最后仍用HRP的底物呈色。B-IgGABCHRP卵白素生物素優(yōu)點：由于生物素與卵白素間的親和力極強，故ABC法比PAP法靈敏度更高。操作時間短，可長期保存。注意： ABC復合物與橋抗體之間是通過生物素結合的，因此ABC復合物沒有種屬特異性，可適合于任何種類的第一抗體。當然生物素結合的第二抗體必須是針對第一抗體屬性的。.熒光顯微鏡在照明系統(tǒng)的光源中使用高壓汞燈提供全波段激發(fā)光為延長汞燈壽命，打開后不可立即關閉（至少15min），以免水銀蒸發(fā)不完全而損壞電極；汞燈關閉后則不可馬上打開（至少30min），否則燈內

27、汞蒸汽尚未恢復液態(tài)，內阻極小，再次施加電壓會引起短路，導致汞燈爆炸。.激光共聚焦顯微鏡用激光作掃描光源，逐點、逐行、逐面快速掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用一個物鏡，物鏡的焦點即掃描激光的聚焦點，也是瞬時成像的物點。分辨率，是普通光學顯微鏡的3倍。用于觀察細胞形態(tài)、細胞內生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計以及細胞形態(tài)的測量。./hbchendl/article/i5275.htm.免疫組織化學染色的對照實驗陽性對照，用已經證實的含有靶抗原的組織切片與待檢標本同樣處理，免疫組織化學染色結果應為陽性，稱陽性對照。證明靶抗原有活性，抗體的特異性高，染色過程中各個步驟以及所使用的試劑都合乎標準，染色方法

28、可靠。陰性對照，用確知不存在靶抗原的組織切片與待檢標本同樣處理，結果應為陰性?？膳懦旧^程中由于非特異性染色或交叉反應等因素造成的假陽性結果。 常用空白試驗：即用稀釋一抗的稀釋液， 如10% NSS等，或 PBS替代一抗，反應應呈陰性；檢查顯示系統(tǒng)本身能否使組織染色。 替代試驗：正常兔血清或 正常羊血清代替兔抗血清或羊抗兔IgG，反應應呈陰性；吸附實驗：先將抗體與過量的與其針對的抗原（通常用10-6M）混合孵育，兩者形成特異性結合，再用結合后的混合物孵育切片，染色結果應為陰性。若染色結果仍為陽性，則為非特異性染色。此法可證明待檢組織切片的陽性結果是該抗體與組織內靶抗原特異性反應的結果。.免疫

29、組織化學法中的交叉反應抗體僅識別特異的抗原決定簇而不識別抗原本身，具有相同抗原決定簇的不同物質可以和同一種抗體結合。解決的最可靠的方法是將抗體用可能與之有交叉反應的抗原吸收，去除有交叉反應的抗體后，再用作免疫染色，或用已證明沒有交叉反應的單克隆抗體。制成針對抗原不同片段的抗體，如各抗體均得出相同的染色結果，則存在交叉反應的可能性要小得多。但是，無絕對對照實驗，其結果也是相對的。.原位雜交組織化學法 原位雜交組織化學（In situ hybridization histochemistry，ISHH）是應用已知堿基順序并帶有標記物的核酸按堿基配對的原則進行特異性結合，形成雜交體，然后再應用與標記

30、物相應的檢測系統(tǒng)通過組織化學或免疫組織化學在核酸原有的位置進行細胞內定位。.原位雜交組織化學法創(chuàng)于1969年。在神經形態(tài)學研究中，ISHH法主要用于顯示細胞內的mRNA。此法目前很成熟，其靈敏度已達到可以顯示細胞內僅幾個拷貝的mRNA的程度。ISHH法是用標記的單鏈核酸探針與組織切片反應的方法。.探針的類型1）按標記物 放射性探針（32P、35S及氚） 非放射性探針（生物素、堿性磷酸酶等物質標記的探針）2）按核酸性質 cDNA探針 RNA探針 寡核苷酸探針 分別于組織內相互補的mRNA結合，形成DNA- RNA或RNA- RNA雜交體。.cDNA是指與mRNA互補的DNA鏈，由克隆技術產生，原

31、位雜交的特異性強，比RNA探針簡便，應用較廣。主要缺點是cDNA探針通常是雙鏈的，必須在使用前加溫，使之分離成兩條單鏈，其中之一條為cDNA鏈，能參與雜交。但無關DNA鏈可以和cDNA鏈重新結合（退火），在雜交過程中與mRNA爭奪cDNA，而且其與cDNA鏈的結合可能比與mRNA的結合更容易。.RNA探針也是由克隆技術產生，技術上比cDNA困難。其優(yōu)點是所產生的探針是單鏈的，不存在退火問題，因此靈敏度更高， RNA- RNA結合還比DNA- RNA結合穩(wěn)定。寡核苷探針是人工合成的一段與mRNA互補的短核苷鏈。短探針有利于透入組織，寡核苷探針的制備容易，針對性強，因而特異性強。但由于探針短，其與

32、mRNA結合不夠牢固，故雜交及雜交后清洗的條件不能太苛刻。.原位雜交組織化學技術的基本方法 由于核酸探針的種類和標記物的不同，故具體應用技術方法上有差異，但基本方法和應用原則大致相同。大致可分為： 雜交前準備，包括固定、取材、玻片和組織處理，如何增強核酸探針的穿透性、減低背景染色等； 雜交； 雜交后處理； 顯示（visualization）：包括放射性自顯影和非放射性標記的顯色。.固定 原位雜交組織化學技術（In Situ Hybridization Histochemistry, ISHH）在固定劑的應用和選擇上應兼顧到三個方面：保持細胞結構，最大限度地保持細胞內DNA或RNA的水平；使探針

33、易于進入細胞或組織。 DNA是比較穩(wěn)定的，mRNA是相對穩(wěn)定的但易為酶合成和降解。 在固定劑中，最常用的是多聚甲醛。和其它的固定劑（如戊二醛）不同，多聚甲醛不會與蛋白質產生廣泛的交叉連接，因而不會影響探針穿透入細胞或組織。 .玻片和組織切片的處理 玻片的處理玻片包括蓋片和載片應用熱肥皂刷洗，自來水清洗干凈后，置于清潔液中浸泡24h，清水洗凈烘干，95%酒精中浸泡24h后蒸餾水沖洗、烘干，烘箱溫度最好在150或以上過夜以去除任何RNA酶。由于ISHH的實驗周期長，實驗程序繁雜，因此，要應用粘附劑預先涂抹在玻片上，干燥后待切片時應用，以保證在整個實驗過程中切片不致脫落。多聚賴氨酸液具有較好的粘附效

34、果。.增強組織的通透性和核酸探針的穿透性 增強組織通透性常用的方法如應用稀釋的酸洗滌、去垢劑（detergent）或稱清洗劑Triton X-100、酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶和淀粉酶（diastase）等。這種廣泛的去蛋白作用可增強組織的通透性和核酸探針的穿透性，提高雜交信號，但同時也會減低RNA的保存量和影響組織結構的形態(tài)，因此，在用量及孵育時間上應慎為掌握。 蛋白酶K（Proteinase K）的消化作用在ISHH中是應用于蛋白消化的關鍵步驟，其濃度及孵育時間視組織種類、應用固定劑種類、切片的厚薄而定。一般應用酶k 1g/ml(于0.1mol/l Tris/50mm

35、ol/L EDTA, pH8.0緩沖液中),37孵育1520min，以達到充分的蛋白消化作用而不致影響組織的形態(tài)為目的。 在蛋白酶K消化后，應用0.1mol/L的甘氨酸溶液（在PBS中）清洗以終止蛋白酶K的消化作用，甘氨酸是蛋白酶K的抑制劑。為保持組織結構，通常用4%多聚甲醛再固定。 .減低背景染色 雜交后（Posthybridization ）的酶處理和雜交后的洗滌均有助于減低背景染色。 預雜交（Prehybridization）是減低背景染色的一種有效手段。預雜交液和雜交液的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖（Dextran sulphate）。將組織切片浸入預雜交液中可達到封閉非特異性雜交

36、點的目的，從而減低背景染色。 防止RNA酶的污染 在整個雜交前處理過程都需戴消毒手套。所有實驗用玻璃器皿及鑷子都應于實驗前一日置高溫（240）烘烤以達到消除RNA酶的目的。要破壞RNA酶，其最低溫度必須在150左右。 .雜交（Hybridisation） 是ISHH中關鍵的而且是最重要的一個環(huán)節(jié)。 雜交是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片。加蓋片的目的是防止孵育過程中的高溫（50左右）導致雜交液的蒸發(fā)。雜交液的成分和預雜交液基本相同，所不同的是加入了標記的核酸探針和硫酸葡聚糖。 探針的濃度和長度，雜交的溫度和時間。探針的長度，一般應用于ISHH探針的最佳長度應在50100個堿基之間。探針

37、短易進入細胞，雜交率高，雜交時間短。 雜交反應溫度方面，甲酰胺起了極為重要的作用，從而有助于保持組織的形態(tài)結構。 硫酸葡聚糖的主要作用是促進雜交率，特別是對雙鏈核酸探針。.雜交后處理（post hybridisation treatment） 雜交后處理包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。 在雜交后漂洗中的RNA酶液洗滌能將組織切片中非堿基配對RNA除去。洗滌的條件如鹽溶液的濃度、溫度、洗滌次數和時間因核酸探針的類型和標記的種類不同而略有差異，一般遵循的共同原則是鹽溶液濃度由高到低而溫度由低到高。 顯示（Visualization） a 放射性自顯影 b 非放射性標記顯示：堿性磷酸酶標記

38、探針雜交結果用硝基四氮唑藍等底物顯示。.對照實驗同時設置證明特異性 由于mRNA分子僅由4種核苷組成，因此存在著不同mRNA分子有某些相同核苷片段的可能性。因此原位雜交也存在與免疫組織化學相類似的交叉反應問題。探針越短，交叉反應的可能性越大。 首先，在決定探針的堿基序列時，可用 Northern Blot法檢查該探針能否識別正確的mRNA位置。.在組織切片上的對照可采用：用核糖核酸酶進行雜交前處理， mRNA應不再出現；用有意義探針在相鄰切片進行雜交，應為陽性結果。用過量的未標記探針作競爭試驗，標記探針的特異結合將大為減弱。在相鄰切片對同一mRNA使用數種針對不同片段的探針進行雜交，能否得到同

39、樣結果。.原位雜交法和免疫組織化學法都是顯示細胞化學成分的方法，兩者相輔相成。兩者的一個共同問題是反應的特異性問題。兩種方法的互相印證可以彼此作為其特異性的證據。原位雜交法能更確切地反映某種物質表達的調節(jié)。mRNA量的消長通常反映了其表達的下調和上調，而免疫組織化學雖然也能反映細胞內物質的量的變化，但這種變化可以是由于其在細胞內合成量的變化，也可以是其從胞體釋放或被代謝、分解量的變化。.受體定位法神經活性物質擔負著在神經元間傳遞信息的作用，在其所作用的神經元上（內）存在著特異性地與某一具有特定構造的神經活性物質特異性結合，而使其發(fā)揮調節(jié)效應的物質，稱為受體。受體不僅分布在細胞體的胞膜上，也存在

40、于樹突、軸突等的膜上，還存在于胞核和胞漿內（兒茶酚胺類和肽類等親水性物質的受體存在于胞膜上，類固醇激素等疏水性物質的受體存在于胞核或胞漿內）。免疫組織化學法：用針對受體的特異性抗體原位雜交法：已知受體的氨基酸序列，人工合成針對它們的特異性分子探針。配體法：主要在組織切片上進行，利用標記的配體和受體結合以示蹤其部位。配體是與受體有親和力的物質的總稱。此法目前很少用。.（二）生理藥理學方法1、神經遞質釋放量的測定2、神經遞質功能的測定 3、行為學方法.1、神經遞質釋放量的測定（1）推挽灌流（2）腦內微透析術（3）伏安法（4）微穿刺術（5）腦片. 在中樞神經系統(tǒng)中，復雜的神經聯(lián)系要通過突觸來傳遞。當

41、動作電位到達突觸前末梢時，突觸前膜去極化，Ca2+內流，引起突觸前膜內神經遞質的釋放，神經遞質進入突觸間隙后，通過擴散到達突觸后膜，與位于突觸后膜上的受體結合，引起突觸后神經細胞的功能狀態(tài)發(fā)生變化。從生理功能上來看，神經遞質的釋放是整個神經遞質代謝各環(huán)節(jié)中的最重要的一環(huán)，它代表了中樞神經系統(tǒng)功能的主要方面。.神經遞質釋放的動態(tài)變化可用在體和離體方法進行研究。推挽灌流是在體研究中樞核團遞質釋放的有用方法，通過推挽灌流套管，使灌流液直接灌流腦組織，從流出液中分析神經遞質的變化。腦內微透析術是在推挽灌流基礎上發(fā)展起來的新技術，其特點是灌流液在半透膜管內流動，不與腦組織直接接觸，可測定腦組織細胞外液中

42、不同生理狀態(tài)下基礎的、對藥物反應的神經遞質及其代謝產物釋放量及其變化。伏安法是應用微電極測定腦內的生物胺及其代謝產物的方法，其時間分辨率比腦內微透析術高。微穿刺術能快速、簡便獲取腦核團組織進行化學測定。同位素標記腦片是離體研究神經遞質釋放過程及其機制的重要手段。.在體研究特定腦區(qū)或核團遞質釋放的方法，通過推挽灌流套管，使灌流液直接灌流腦組織，從流出液中分析神經遞質的變化。實驗裝置由三部分組成：灌流液泵和進液系統(tǒng)、灌流探頭、灌流液收集系統(tǒng)。灌流液泵和進液系統(tǒng)由一個恒速泵和進液管組成。灌流液在恒速泵的推動下通過進液管進入到灌流探頭內。灌流液通常為人工腦脊液。為減輕對腦組織的刺激，灌流時灌流液通常維

43、持在36-37。灌流探頭有多種形式，并列式推挽灌流探頭結構較簡單，但對腦組織損傷較大。同心圓式推挽灌流探頭對腦組織損傷較小，是目前國內外常用的灌流探頭。（1）推挽灌流.同心圓式推挽灌流裝置由直徑不同的同心圓不銹鋼內、外套管和灌流泵組成。灌流時，灌流液經內套管進入局部腦組織，再由外套管經側管吸出流入收集器。為了防止套管末端處的負壓對腦組織的局部抽吸作用，減少腦組織的損傷，在外套管與側管交接處開一小孔，在抽吸灌流液時讓空氣從小孔進入側管，避免套管末端形成負壓。. 收集的樣品可通過高效液相層析、放射免疫測定等方法進行測定。兩個問題：1 推挽灌流時，灌流液直接與腦組織接觸，可能造成灌流部位腦組織的損傷

44、；2 腦組織所釋放的各種化學物質，包括各種蛋白質、多肽、氨基酸和小分子化學物質均可進入灌流液中，為測定灌流液中的特定神經化學物質帶來干擾。 因此，發(fā)展起來一種新的腦組織灌流技術，即腦組織微透析方法。.（2）腦內微透析術腦內微透析術是在特定的腦區(qū)內，植入由透析膜組成的透析管。當用灌流液持續(xù)灌流透析管時，待測的物質可順濃度梯度進行擴散，或從腦組織的細胞外液進入透析管，或從透析管擴散至細胞外液，通過收集灌流液，測定其中的待測物質的含量，就可監(jiān)測該物質的含量變化。腦內微透析時可以選用通透性不同的透析膜，以選擇性地允許分子量在某一范圍內（小于透析膜孔徑）的化學物質通過透析膜進入灌流液中。所以，腦內微透析

45、所能監(jiān)測的神經化學物質主要是一些分子較小的神經遞質和較小的神經肽，如去甲腎上腺素、多巴胺、腦啡肽等。.腦內微透析術的裝置包括探頭、導管、微量灌流泵、樣品收集器和定量分析儀等。探頭由流入管、流出管和中空纖維管構成。中空纖維管是能通過最大分子量為5000-50000的物質的透析管。探頭按植入的方式可分為跨腦探頭、U型探頭和型探頭。所有探頭的植入均根據腦立體定位圖譜，借助腦立體儀進行。.常用透析液是人工腦脊液，透析的速度一般為0.1-10l/min。樣品的采集一般在透析開始后30-60min開始，這時透析液中的神經化學物質的回收率趨于穩(wěn)定。注意灌流液中鈣離子濃度要合適，過高或過低都會影響神經遞質的釋

46、放和更新。分析結果時注意，所得結果僅僅是神經末梢釋放到突觸間隙的神經遞質濃度的平均變化，這是以分鐘或小時為單位時間的變化，而不能檢測突觸間隙神經遞質濃度的瞬時變化。.應用測定體內不同腦區(qū)各種內源性化學物質的濃度；刺激不同核團或神經通路對不同腦區(qū)神經遞質的釋放量的影響；動物自然行為的變化以及外界各種刺激引起的反應與內源性神經遞質釋放的關系；研究腦內各化學系統(tǒng)的功能性的相互作用；研究藥物對腦內化學物質的影響；通過測定體內回收率的變化，可研究神經遞質的釋放和攝取及它們的調節(jié)；研究影響腦化學的病理變化如腦缺血時腦組織內的興奮性氨基酸含量的變化等。.（3）伏安法 活體內包括腦內的細胞外液中存在一些具有氧

47、化還原電活性的物質，如生物胺神經遞質（去甲腎上腺素、腎上腺素、多巴胺和5-羥色胺） 及它們的代謝產物、抗壞血酸、尿酸、谷胱甘肽等。若在細胞外液中加入2個電極，接通電源，在電極處就會出現電解反應（在陰極出現氧化反應）。應用微電極進行電解，并記錄電流-電壓曲線（又稱伏安圖），這個過程稱為伏安法。.基本原理.遞質釋放的動態(tài)過程.測量儀器與設備碳纖維電極： 聚丙稀微碳纖電極（細胞，腦片） 柱狀碳纖電極（在體）膜片鉗放大器（電壓鉗模式）數據采集接口卡計算機系統(tǒng).優(yōu) 點胞吐活動的檢測不受胞吞活動重疊的干擾直接檢測釋放的物質量化測量單個囊泡的分泌實時監(jiān)測無創(chuàng)傷測量.局限性可檢測的物質：氧化電壓小于1000m

48、V的遞質分子（腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺、5-羥色胺、組胺、抗壞血酸等）。 谷氨酸、乙酰膽堿、GABA、胰島素等不能被檢測。碳纖電極測量的只是直接與碳纖電極尖端相接觸或距離小于5m 范圍內的那些小泡分泌。只能測量胞吐但不能測量胞吞。 .恒電位（安培法，amperometry） 時間分辨率高三角波循環(huán)電壓（伏特法，voltammetry） 能鑒別是哪種遞質分子 但測量靈敏度比安培法低 因此，如果已知該細胞分泌的是哪一種遞質，一般都使用安培法來記錄細胞分泌。.碳纖電極性能測試1. 電學特性測試 電極尖端緩慢浸入生理溶液中, HP=780 mV。由于電極極化作用, 碳纖電極的檢測電流( Iamp

49、) 波形會有一上沖。好的電極由于其漏電流很小, 在十幾秒到幾十秒后電流波形會降至10 pA 以內。.2. 電極氧化性能測試.3. 腎上腺嗜鉻細胞分泌的檢測和判定. 伏安法的優(yōu)點是時間分辨率高，伏安法電極的反應時間短，可用于檢測腦內單胺遞質快速的動態(tài)變化。伏安法的碳素纖維微電極（一般在10-20m）遠比腦內微透析中的微透析管（大于200m）口徑小，可減少腦組織的損傷及可檢測腦內小核團的神經活性物質。但微透析法中用HPLC檢測樣品，有很高的特異性，而且一次可同時檢測多種神經活性物質，可同時了解不同物質的動態(tài)變化及它們之間的相互作用，這是伏安法難以做到的。.假遞質標記法：原理是對于特定的分泌細胞，尋

50、找一種該細胞的分泌小泡內本來不存在，但分泌小泡能夠自動攝取的“易氧化分子”。將該易氧化物質放到細胞外液中，待分泌小泡攝取足夠易氧化分子后便可做CFE實驗。電極涂層法：原理是對于待測量的特定遞質，尋找一種能夠選擇性“催化”該遞質的化學物質或生物酶，并將該物質“鍍”到CFE 電極尖端，當遞質分子到達CFE電極尖表面時，首先經“鍍層”物質催化而在小于1000mV條件下氧化，氧化電流成為涂層CFE的信號。尋找高效率并且穩(wěn)定性較高的涂層是本方法的關鍵。 .（4）微穿刺術微穿刺術是利用中空針管切取腦片中的特定核團，用于檢測其化學成分，包括神經遞質及其代謝產物等。動物處死后立即取出腦，迅速將所需的腦區(qū)作冷凍

51、切片。在顯微解剖鏡下，確定腦片中要切取的腦核團的位置，然后用中空針管穿刺腦片切取樣品。然后，將樣品進行適當的處理，如勻漿、超聲波破碎或提取等，最后進行化學測定。能快速、簡便獲取腦核團組織進行化學測定。微穿刺術廣泛應用于神經科學的研究。用于了解神經遞質、神經肽、酶和受體等在腦區(qū)中的分布，測定這些化學物質在實驗條件和病理條件下的改變。優(yōu)點：操作簡單快捷且非?？煽浚泻芨叩慕馄式Y構的分辨率，樣品經過適當處理后可用許多分析技術進行測定。缺點：組織樣品是在死后獲得的；樣品中的神經元失去了傳入和傳出的聯(lián)系；在處理過程中如勻漿等會引起缺氧。.（5）腦片離體研究神經遞質釋放過程及其機制的重要手段。過程包括：

52、腦片制備：麻醉后取腦，將選擇好的腦區(qū)切成腦片。 孵育：5CO2、95O2飽和的緩沖液，37。 標記腦片：孵育液中加入適量的含放射性同位素的神經遞質或其前體標記腦片。腦片的神經末梢對這些物質應具有高親和力攝取，使神經末梢的遞質貯庫被放射性物質選擇地標記。.灌流裝置釋放量的測定：基礎釋放量去極化刺激引起的釋放量：電場刺激高鉀濃度去極化 最后檢測流出液和組織的放射活性，或用HPLC檢測。.2、神經遞質功能的測定 突觸前神經末梢的遞質是以量子式釋放的，其量很微小，因此在進行神經遞質功能測定時，只能用最小而有效的劑量模擬神經遞質的生理效應。 （1）微電泳：能將微量的神經遞質導入神經元附近，觀察其作用。（

53、2）抗體微量注射. 定義：借助微電極通以一定的電流將解離物質電泳到神經元附近，觀察神經遞質或其他藥物對該神經元的作用。 基本原理：外加電流通過含解離物質溶液的微電極時，會將微電極內的解離物質從管尖釋放出來。例如在微電極接正極，動物頭皮接負極時，帶陽離子的物質從微電極中釋出。相反，微電極接負極，頭皮接正極（內向電流）時，微電極釋出的是帶負離子的物質。微電泳時解離物質從微電極釋出量，與它通過的電荷量成正比。因此，通常用微電極的電流強度表示解離物質的釋放量。 方法：1）拉制微電極：五管：每管尖端直徑1-3m, 五管總直徑510m.其中，一管為紀錄，一管為對照，三管為藥物。若需作細胞內記錄，則有一管應

54、較其他管略長，以便插入細胞內。 （1）微電泳 Microelectrophoresis. 藥物管可根據實驗需要，將神經遞質或藥物配成離子化溶液。為此常用稀釋的NaOH溶液或HCl溶液制備，并調整溶液的pH值，使要作微電泳的物質呈陽離子或陰離子，以便微電泳時能將所需要的解離物質導入所要觀察的神經元。 2）微電極充滿溶液后，在立體定位儀幫助下，將微電極插至所需要觀察的腦核團內的神經元附近。微電泳儀上的輸出接頭通過Ag-AgCl細絲插入微電極各管中，另一共用接頭連在動物頭皮上，是每一管電極與頭皮電極之間形成回路。然后，立即施加滯留電流防止自發(fā)性外溢。微電泳時選擇一定強度（nA）的電流通過微電極，微電

55、極中的解離物質釋放量與通電電流強度成正比。.多管微電泳方法具有三大特點。第一，與離體實驗相比，應用這種方法得到的實驗結果能夠提供整體條件下目標細胞功能狀態(tài)的信息。第二，藥物的作用范圍很小，可以精確定位到一個或幾個細胞的反應，所以用來研究藥物對單個神經細胞的直接作用。第三，可以通過改變微電泳電流的大小來調節(jié)所施加藥物的量。.Microionphoresis:This methods enables a researcher to apply very small amounts of drugs or neurotransmitter candinates to the surface of n

56、eurons.應用：將神經遞質或藥物越過血腦屏障直接作用于神經元，甚至突觸前膜和后膜，觀察這些遞質和藥物對它們的作用?？梢灾苯訉λ涗浀纳窠浖毎┘佣喾N受體的激動劑或拮抗劑，確定該神經細胞膜上是否存在這種受體，激活或阻斷這種受體引起神經細胞發(fā)生興奮還是抑制。另外，還可將跨膜信號傳導通路中某些關鍵因子如G-蛋白、第二信使等的激動劑或抑制劑通過微電泳方法施加到記錄的神經細胞處，從而研究受體激活后的信號傳導通路。. 基本原理: 抗體抗原中和反應。特異性抗體注射在某一腦區(qū)，可中和神經末梢釋出而進入突觸間隙的神經肽，防止其與受體結合。因此，用此方法可解釋消除該神經肽的生理效應的結果，從而推測內源性神經遞

57、質的作用。 中樞內直接注射法包括：腦室內注射，通過腦內埋植慢性套管和脊髓蛛網膜下腔慢性插管進行恒速微量注射等方法，或通過玻璃微電極向被紀錄的神經元附近微量注射。 （2）抗體微量注射.3、行為學方法經典條件反射操作式條件反射 動物必須完成某種運動或操作后才能得到強化。例如，將大鼠放入實驗箱內，當它在走動中偶然踩杠桿時即喂食，以強化這一操作，如此重復多次，大鼠即學會自動踩杠桿而得食。踩杠桿這樣一個特定的動作就是條件反應，簡稱反應。操作式條件反射代表了反應與強化之間的關系。 .（三）生物化學方法 神經科學中，生物化學方法的主要任務是分離和分析神經組織以及與神經活動有關的種類繁多的化學組分，特別是諸多

58、的神經遞質、調質、激素、生長因子及其受體，這些物質的含量極微，有些組分很容易失去活性。因此，和其他領域比較，更需要用溫和的、高回收、高分辨和高靈敏度的分離分析方法。.1、層析分離技術2、放射免疫測定法3、酶聯(lián)免疫吸附法4、免疫印跡法. 層析，也稱為色譜分析，是一種分離技術，其基本原理是利用不同的物質在兩個相（即固定相和移動相）之間具有不同的分配系數，即不同物質和固定相締合的緊密程度以及用液體（即移動相）淋洗時被洗脫的難易程度的不同，而達到將樣品中所含的各種物質分離的目的。其優(yōu)點是分離條件溫和，有利于保持生物活性，并適合于大量制備。1、層析分離技術. 層析法進行時有兩個相，一個相稱為固定相(St

59、ationary phase )，通常為表面積很大的或多孔性固體；另一相稱為流動相(Mobile phase ) ，是液體或氣體。當流動相流過固定相時，由于物質在兩相間的分配情況不同，經過多次差別分配而達到分離，或者說，易分配于固定相的物質移動速度慢，易分配于流動相中的物質移動速度快，因而得到逐步分離。.層析分離法基本原理.層析技術的分類 按兩相所處的狀態(tài)分類 以液體作為流動相的層析稱為液相層析，以氣體作為流動相的稱為氣相層析。 其固定相也可有兩種狀態(tài)，一種是以固體作為吸附劑的固定相，另一種是以涂布在固體載體表面的液體作為固定相。.層析氣相層析（gas-chromatography）液相層析（

60、liquid-chromatography）氣-固層析（gas-solid chromatography）氣-液層析（gas-liquid chromatography）液-固層析（liquid-solid chromatography）液-液層析（liquid-liquid chromatography）.2.按操作技術形式分類.柱層析（colum chromatography） 將固定相裝在層析柱中，使樣品朝著一個方向移動，通過各組分隨流動相流動而得到分離的方法。紙層析（paper chrmatography） 用紙作為液體的載體，樣品點在紙上隨后展開達到分離鑒定的方法。薄層層析（thin