第五章-中藥指紋圖譜課件

1、第五章中藥指紋圖譜與特征圖譜大綱要求掌握中藥指紋圖譜分析及評(píng)價(jià)熟悉中藥指紋圖譜研究程序及技術(shù)要求了解中藥指紋圖譜測(cè)定方法同一個(gè)成藥，療效一致么？不同廠家：不同工藝：不同輔料：Forsythiaside AForsythin 123青翹Immature Lianqiao老翹 mature Lianqiao老翹（無種子）Mature Lianqiao （without seeds)質(zhì)量相差懸殊的連翹藥材Great disparity of ingredients in different Lianqiao crude drugs青翹老翹無籽老翹所含有效成分遞減相同處方，不同工藝，療效？2022/7

2、/197目前中藥質(zhì)量控制的局限齊墩果酸、熊果酸、大黃酸、槲皮素、小檗堿 缺乏化學(xué)對(duì)照品 化學(xué)對(duì)照品缺乏專屬性 物質(zhì)群體間的量化特征無法體現(xiàn)黃柏、黃連 小檗堿、巴馬亭的比例人參、西洋參或三七幾種人參皂苷的比例 中藥整體的用藥的特色無法體現(xiàn)第一節(jié) 概述中藥色譜指紋圖譜的提出中藥依賴其所含的多種化學(xué)成份發(fā)揮療效任何單一的活性成份或指標(biāo)成份都難以有效地評(píng)價(jià)中藥的真?zhèn)蝺?yōu)劣利用現(xiàn)代分析技術(shù)分析不同中（成）藥的整體特征以提高鑒別的準(zhǔn)確性指紋圖譜分析（Chromatographic Fingerprint Analysis）第一節(jié) 概述定義: 中藥指紋圖譜是指中藥經(jīng)適當(dāng)處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標(biāo)

3、示該中藥特性的共有峰的圖譜，是一種新的中藥質(zhì)量控制模式。 中藥指紋圖譜的基本屬性：整體性和模糊性。整體性：強(qiáng)調(diào)多個(gè)成分（共有指紋峰）的相對(duì)穩(wěn)定的比例、排列順序及相互的牽制，反映的質(zhì)量信息是綜合的。模糊性：中藥化學(xué)成分復(fù)雜性+次生代謝產(chǎn)物化學(xué)成分不確定性，具有無法精密度量的模糊性。中藥特征圖譜的提出定義: 中藥特征圖譜是指中藥經(jīng)適當(dāng)處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標(biāo)示其中各種組分群特征的共有峰的圖譜，是一種新的中藥質(zhì)量控制模式。中藥指紋圖譜和中藥特征圖譜均以表征中藥內(nèi)在質(zhì)量的整體變化為評(píng)價(jià)目的 圖譜分析：強(qiáng)調(diào)準(zhǔn)確的辨認(rèn)，而不是精密的計(jì)算。 圖譜比較：強(qiáng)調(diào)的是相似性，而不是相同。特點(diǎn)：(1)

4、通過指紋圖譜或特征圖譜的特征性，能有效鑒別中藥的真?zhèn)巍?2)通過指紋圖譜或特征圖譜主要特征峰的面積和比例的制定，能有效控制中藥質(zhì)量，保證中藥質(zhì)量的相對(duì)穩(wěn)定（即穩(wěn)定性和均一性）。 指紋圖譜的作用對(duì)中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)充和提高?？刂圃?、中間體、成品的一致性，控制工藝，減少批間差異。指紋圖譜的特性穩(wěn)定性（重現(xiàn)性）特征性在規(guī)定的方法與條件下，不同的操作者和不同的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)能重復(fù)能反映中藥有效部位所含大部分成分的種類，或指標(biāo)成分的全部能特征地區(qū)分中藥的真?zhèn)闻c優(yōu)劣整體性（模糊性）指紋圖譜中應(yīng)包含的信息中藥材和中藥飲片：種的共性產(chǎn)地、采收期、炮制方法的個(gè)性信息。半成品和中藥制劑：原藥材（甚至輔料）的信息工藝信息

5、等。藥效信息(二) 指紋圖譜的發(fā)展現(xiàn)狀1.指紋圖譜的發(fā)展階段： 初級(jí)階段: 是確立指紋圖譜的建立方法及相似度判定。研究重點(diǎn)主要是測(cè)定方法的建立，方法穩(wěn)定性和適用性考察，化學(xué)有效部分基礎(chǔ)研究，圖譜多指標(biāo)控制等，力求基本說清中藥化學(xué)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制參數(shù)，將中藥質(zhì)量控制提到整體量化的高度。 高級(jí)階段: 即指紋圖譜特征和藥效相關(guān)性研 究，指紋圖譜的生物等效性研究。 中藥指紋圖譜的研究向多學(xué)科的相互滲透、從單指標(biāo)向多指標(biāo)（多維多息）的綜合發(fā)展，最終建立體現(xiàn)譜效關(guān)系的指紋圖譜，確保中藥安全、有效和可控。 國(guó)內(nèi)，目前還處在初級(jí)階段。1.針對(duì)中藥注射劑這一相對(duì)簡(jiǎn)單的體系，進(jìn)行大量研究和深入探討。2.利用指紋圖譜

6、手段表征中藥注射劑的特性，表達(dá)成品的質(zhì)量，以達(dá)到控制工藝操作和原藥材的目的，利用指紋圖譜追尋工藝操作中的問題和實(shí)現(xiàn)對(duì)原藥材GAP的質(zhì)量要求。3.通過對(duì)大量注射劑的指紋圖譜研究，建立系統(tǒng)的測(cè)定方法和全面的指標(biāo)控制參數(shù)，尋找一定的數(shù)學(xué)模型，最終達(dá)到指紋圖譜的可操作，可控，穩(wěn)定，顯性和量化的目的，提高整個(gè)中藥注射劑的質(zhì)量控制水平。4.逐步建立其它類中藥制劑，中藥復(fù)方制劑的指紋圖譜。 2.指紋圖譜的分類指紋圖譜可按應(yīng)用對(duì)象、測(cè)定手段進(jìn)行不同的分類。按應(yīng)用對(duì)象分類： 中藥材(原料藥材)指紋圖譜中藥原料藥(包括飲片、配伍顆粒)指紋圖譜中藥中間體（工藝生產(chǎn)過程中間產(chǎn)物）指紋圖譜中藥制劑指紋圖譜 按測(cè)定方法分

7、類: 中藥化學(xué)指紋圖譜 指紋圖譜系指采用色譜、光譜和其他分析方法建立的用以表征中藥化學(xué)成分的特征的指紋圖譜。中藥化學(xué)指紋圖譜對(duì)控制中藥質(zhì)量具有更直接、更重要的意義。 色譜指紋圖譜：TLC、GC、GC-MS、HPLC、HPLC-MS等光譜指紋圖譜：UV、IR、FP、NMR、MS等中藥生物指紋圖譜包括：中藥材DNA指紋圖譜 中藥基因組學(xué)指紋圖譜 中藥蛋白組學(xué)指紋圖譜中藥材DNA指紋圖譜主要是測(cè)定各種中藥材的DNA圖譜，由于每個(gè)物種基因的唯一性和遺傳性，中藥材DNA指紋圖譜可用于對(duì)中藥材的種屬鑒定、植物分類研究和品質(zhì)研究。它對(duì)中藥材GAP基地建設(shè)、中藥材種植規(guī)范(SOP)、選擇優(yōu)良種質(zhì)資源和藥材道地

8、性研究極為有用。 中藥基因組學(xué)圖譜和中藥蛋白組學(xué)指紋圖譜系指用中藥作用于某特定細(xì)胞或動(dòng)物后，引起的基因和蛋白的復(fù)雜的變化情況，這兩種指紋圖譜可稱為生物活性指紋圖譜。 中藥蛋白組學(xué)指紋圖譜是指紋圖譜研究的最高級(jí)階段，可確定中藥的主要活性物質(zhì)。第二節(jié) 中藥指紋圖譜研究程序及技術(shù)要求（一）指紋圖譜的要求 中藥指紋圖譜應(yīng)滿足特征性、重現(xiàn)性和可操作性的技術(shù)要求（即三性要求）。當(dāng)一張指紋圖譜不足以表現(xiàn)其全部特征，可用幾張指紋圖譜來表現(xiàn)某種中藥(藥材或復(fù)方)的各個(gè)不同側(cè)面的特征，從而構(gòu)成其全貌。對(duì)每一張圖譜都應(yīng)有其特征性。丹參滴丸多元HPLC指紋圖譜指紋圖譜I (280nm)指紋圖譜II (203nm)首先

9、具備專屬性或唯一性。能夠表達(dá)某品種特征的性質(zhì)。在滿足專屬性前提下要有較好的重現(xiàn)性，指同一品種的同一樣品，同一操作條件下，結(jié)果的重現(xiàn)性要好，即不同實(shí)驗(yàn)室和不同操作者得到的色譜整體特征應(yīng)有較高的相似度(0.9以上)。具有可操作性。指針對(duì)不同用途，選用不同分析方法來達(dá)到不同的要求，選擇的方法和試驗(yàn)條件應(yīng)便于推廣和便于操作，要有普遍適用性。（二）指紋圖譜的構(gòu)建方法1、色譜法 色譜技術(shù)具有極強(qiáng)的分離能力和極大的適應(yīng)性，中藥指紋圖譜首推色譜法，其常用的方法有： TLC、GC、HPLC、HPCE、SFC等。薄層色譜Thin Layer Chromatography (TLC)可在同板同時(shí)分析多達(dá)18個(gè)樣品，

10、時(shí)效高所用的是正相展開劑，其組成變化靈活，可適應(yīng)多種成分的分離既可直觀比較圖譜，又可掃描得到輪廓圖和處理數(shù)據(jù)具有色彩參數(shù)，可獲得色彩豐富的色譜圖像，直觀性強(qiáng)；同時(shí)輔以功能團(tuán)顯色劑還可提示成分的類別，提高鑒別的專屬性。離線操作，占機(jī)時(shí)間短展距局限10cm20cm ，柱效相對(duì)較低，對(duì)復(fù)雜組分不提高分離度則難以提取指紋特征的藥材受到限制。開放系統(tǒng)，對(duì)環(huán)境溫度、相對(duì)濕度要求較高反相高效液相色譜法 Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography適用范圍廣分離性能好分析速度快流動(dòng)相選擇范圍寬靈敏度高色譜柱可多次重復(fù)使用流出組分可以收集采用多種檢測(cè)

11、器，可同時(shí)獲取保留值信息和化合物的光譜、質(zhì)譜信息 對(duì)較為復(fù)雜的色譜實(shí)驗(yàn)條件要求比較苛刻，由此帶來不同實(shí)驗(yàn)室之間重現(xiàn)性的難度增大訶子指紋圖譜訶 子小訶子大訶子絨毛訶子氣相色譜Gas Chromatography (GC)分離效能高分析速度快適用于植物的揮發(fā)油成分及其它易揮發(fā)性成分或可轉(zhuǎn)化為可揮發(fā)的成分測(cè)定可提供保留值信息，與質(zhì)譜聯(lián)用，還可提供更豐富的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息 分辨率高，得到的色譜組份非常復(fù)雜，尤其是含揮發(fā)油藥材，單萜類成分組成很不穩(wěn)定，樣品間差異可能很大，處理數(shù)據(jù)和判別相似度時(shí)一定程度的取舍毛細(xì)管電泳Capillary Electrophoresis分離效能高分析速度快高分辨率可與紫外、熒光

12、、電化學(xué)、質(zhì)譜、拉曼光譜等聯(lián)用，可提供更豐富的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息肉桂油的氣相色譜指紋圖譜HPCE指紋圖譜紅外光譜 Infrared Spectra幾乎所有的物質(zhì)都有特征的紅外光譜。雖然植物中藥提取物還是一個(gè)混合物，但是由于不同物質(zhì)的紅外光譜具有加合性，因此，植物中藥提取物的紅外光譜能反映出所有成分的綜合信息因而具有全息光譜的特點(diǎn)。操作簡(jiǎn)便（不需要復(fù)雜的提取儀器）、快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、溶劑低毒、重復(fù)性高、實(shí)用性強(qiáng)。中國(guó)藥典規(guī)定：小薊在開花時(shí)采。 根據(jù)1384cm-1處吸收峰的有無，可以鑒別其采集時(shí)間是否正確。小薊丁酮提取物的紅外指紋圖譜中藥指紋圖譜供試品溶液10批以上中藥圖譜信息固定產(chǎn)地、采收期和加工炮

13、制的中藥中藥未知檢品預(yù)處理不同產(chǎn)地、采收期和加工炮制的中藥評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)藥效學(xué)試驗(yàn)代表性均一性選擇測(cè)試條件方法建立考察測(cè)定圖譜參數(shù)圖譜分析相關(guān)性圖譜評(píng)價(jià)圖譜測(cè)試、相似度評(píng)價(jià)方法檢驗(yàn)中藥指紋圖譜的研究程序一、研究方案設(shè)計(jì) 1、研究對(duì)象的確定 君藥、臣藥中有效成分作為主要研究對(duì)象2、研究?jī)?nèi)容樣品收集：要求有一定的數(shù)量，以保證供試品的代表性和均一性溶液的制備：包括對(duì)照品溶液和供試品溶液的制備。檢測(cè)方法確立：包括測(cè)定方法、供試品溶液制備的提取條件、測(cè)定條件等篩選。方法學(xué)考察試驗(yàn)：包括精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)以及圖譜采集記錄時(shí)間的考察試驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)制定 ：根據(jù)多批次樣品測(cè)定圖譜，建立共有模式，制定評(píng)價(jià)指

14、標(biāo)等。二、樣品收集 樣品收集是研究指紋圖譜最初也是最關(guān)鍵的步驟，收集的樣品要有足夠的代表性。要求收集10批次以上的樣品。樣品數(shù)越多越好，使得到的指紋圖譜更具生物統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。最關(guān)鍵的步驟 真實(shí)性 代表性10批以上 原藥材 ：不同產(chǎn)地、不同采收季節(jié)等 樣品收集原則： 1）正品優(yōu)質(zhì)道地藥材，或規(guī)范化種植藥材。 2）結(jié)合臨床使用情況選擇性收集藥材樣品。 3）不同產(chǎn)地、不同采收期藥材樣品（指導(dǎo)實(shí)際合理“勾兌”過程） 。 4）中間體、中藥制劑的樣品收集，應(yīng)選擇工藝穩(wěn)定、療效恒定、臨床使用中很少異常的批次。注意：收集藥材樣品“批次”，其含義與工業(yè)產(chǎn)品“批次”的含義是完全不同的，它是指相互獨(dú)立的樣品，即不能將

15、同一地點(diǎn)或同一渠道同一時(shí)間獲得的樣品分成若干批次樣品。不同產(chǎn)地或同一產(chǎn)地不同等級(jí)規(guī)格的樣品，均可視作不同批次。同一產(chǎn)地的樣品，存在不同的種植園和地塊之差異，也均可視作不同批次。三、供試品溶液的制備 根據(jù)中藥中所含化學(xué)成分的理化性質(zhì)和檢測(cè)方法的要求，選擇適宜的制備方法。制備方法必須確保中藥中的主要化學(xué)成分或有效成分在指紋圖譜中得以體現(xiàn)。 原藥材、飲片供試品溶液的制備 盡可能與生產(chǎn)工藝的提取溶劑接近或一致，定量操作 半成品/中間體供試品溶液的制備 參考制劑和產(chǎn)品制備工藝 中藥制劑供試品溶液的制備 直接使用、稀釋或溶劑提取的方式四、 對(duì)照品(參照物)溶液制備 建立指紋圖譜應(yīng)設(shè)立參照物或參照峰。 對(duì)照

16、品作為參照物：常為供試品中主要成分 或者峰面積相對(duì)較大、較穩(wěn)定的共有峰（內(nèi)參物）制備：根據(jù)檢測(cè)方法的需要，選擇適宜的方法進(jìn)行。 五、研究方法的選擇 包括指紋圖譜試驗(yàn)方法和試驗(yàn)條件的優(yōu)選，是通過比較試驗(yàn)，從中選取相對(duì)簡(jiǎn)單易行的方法和條件，獲取足以代表品種特征的指紋圖譜，以滿足指紋圖譜的專屬性、重現(xiàn)性和可操作性的要求，并須經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證。 首選色譜方法，其中HPLC法適用范圍廣，對(duì)含生物堿、蒽醌、黃酮、有機(jī)酸、酚類、木脂素等成分的中藥均可采用。 (一) 測(cè)定條件的選擇 提取條件、色譜條件需進(jìn)行優(yōu)化，在定量操作的前提下，使供試品中所含成分盡可能地被提取并獲得分離，即分得的色譜峰越多越好，使中藥的內(nèi)在

17、特性都顯現(xiàn)出來，為中藥指紋圖譜評(píng)價(jià)及其品質(zhì)鑒定提供足夠的信息。 液相色譜 色譜柱：比較試驗(yàn)加以選擇流動(dòng)相比較流動(dòng)相 1流動(dòng)相 2流動(dòng)相 3適宜的柱溫和檢測(cè)波長(zhǎng)1520253035203210236254365(二) 方法學(xué)驗(yàn)證1. 精密度試驗(yàn)： 主要考察儀器的精密度。取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次以上進(jìn)行檢測(cè)，各共有峰峰面積比值的RSD3，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在平均相對(duì)保留時(shí)間1min內(nèi)?；蛴谩爸兴幹讣y圖譜相似度計(jì)算軟件”計(jì)算，相似度應(yīng)大于0.9。 2.穩(wěn)定性試驗(yàn)： 主要考察供試品的穩(wěn)定性。取同一供試品溶液，分別在不同時(shí)間檢測(cè)（0、1、2、4、8、12、24、36、48h），考察色譜峰的相

18、對(duì)保留時(shí)間、峰面積比值的一致性，確定檢測(cè)時(shí)間?；蛴谩爸兴幹讣y圖譜相似度計(jì)算軟件”計(jì)算，相似度應(yīng)大于0.9。 3.重復(fù)性試驗(yàn)： 主要考察實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性。取同一批號(hào)的樣品5份以上，分別按照選定的提取分離方法制備供試品溶液，并在選定的色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)，各共有峰峰面積比值的RSD3，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在平均相對(duì)保留時(shí)間1min以內(nèi)。或用“中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件”計(jì)算，相似度應(yīng)大于0.9。 4. 指紋圖譜的記錄時(shí)間考察： 如采用HPLC或GC法一般為60min。但實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)記錄2小時(shí)的色譜圖，考察1小時(shí)以后的色譜峰情況，以確定記錄時(shí)間。指紋圖譜的建立 根據(jù)足夠樣品數(shù)（10批次以上）測(cè)試結(jié)果

19、所給出的峰數(shù)、峰值（積分值）和峰位（保留時(shí)間）等相關(guān)參數(shù)，確定共有指紋峰（相對(duì)保留時(shí)間、峰面積比值），選取特征指紋峰群（色譜峰組合），制定指紋圖譜。采用阿拉伯?dāng)?shù)字標(biāo)示共有峰，用“S” 標(biāo)示參照物峰。 中藥材指紋圖譜要對(duì)不同產(chǎn)地、不同等級(jí)規(guī)格或不同采收季節(jié)等的代表性樣品進(jìn)行分析比較，從中歸納出中藥材共有的、峰面積相對(duì)穩(wěn)定的色譜峰作為特征指紋峰。對(duì)于多來源的中藥材，必須考察品種間的特異性。 中藥制劑指紋圖譜的建立，要將原藥材、半成品、成品之間的圖譜進(jìn)行比較，考察相互之間的相關(guān)性。 指紋圖譜的辨認(rèn)應(yīng)注意指紋特征的整體性，從整體的角度綜合考慮，注意各具有指紋意義的譜峰之間相互的依存關(guān)系。 指紋圖譜的評(píng)

20、價(jià)指標(biāo)是供試品指紋圖譜與該品種對(duì)照用指紋圖譜(共有模式)及供試品之間指紋圖譜的相似性。 相似性比較可以用“相似度”表達(dá)，一般指紋圖譜相似度計(jì)算結(jié)果在0.91.0(或以90100表示)之間即符合要求。 指紋圖譜的相似性從兩個(gè)方面考慮:色譜的整體面貌是否相似，以判斷樣品的真實(shí)性；供試品與對(duì)照樣品或“對(duì)照用指紋圖譜”之間及不同批次樣品指紋圖譜之間總積分值作量化比較，如總積分面積相差較大(如20%)，則說明同樣量的樣品含有的內(nèi)在物質(zhì)有較明顯的“量”的差異，這種差異是否允許，應(yīng)視具體品種、具體工藝的實(shí)際情況，并結(jié)合含量測(cè)定項(xiàng)目綜合判斷。這種比較應(yīng)在同一臺(tái)儀器平行進(jìn)行測(cè)定。中藥指紋圖譜分析及評(píng)價(jià) 根據(jù)指紋

21、圖譜所獲取的信息，建立指紋圖譜分析比較的重要參數(shù)，如共有峰、重疊率、n強(qiáng)峰、特征指紋等；計(jì)算特征指紋的相似率與差異率，進(jìn)行指紋圖譜評(píng)價(jià)；應(yīng)用相似度分析、主成分分析、聚類分析或人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等計(jì)算機(jī)技術(shù)，進(jìn)行解析、識(shí)別圖譜信息以及圖譜相似度評(píng)價(jià)，以建立可行、實(shí)用的中藥指紋圖譜量化評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。 （一）重要參數(shù)的建立 1. 共有指紋峰 中藥指紋圖譜中，多個(gè)樣品所具有的相同相對(duì)保留值的色譜峰，即為共有指紋峰。(1) 共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間：相對(duì)保留時(shí)間=tR/tRs。12345678910沒食子酸大黃素圖5-2 大黃HPLC指紋圖譜(2) 共有指紋峰面積比值：指紋峰面積比值=A/As 各共有指紋峰的面積

22、比值必須相對(duì)固定。 未達(dá)基線分離的共有峰，以該組峰的總峰面積計(jì)，同時(shí)標(biāo)定該組各峰的相對(duì)保留時(shí)間。非共有峰：供試品的圖譜與指紋圖譜比較，共有指紋峰以外的相對(duì)保留值不同的色譜峰。特征指紋峰 所有供試品圖譜中均存在的色譜峰，可以認(rèn)為它們是該中藥品種所特有，故又稱之為特征指紋峰。 特征指紋是指由一系列特征指紋峰所組成的固定峰群，從多組分的角度來反映中藥內(nèi)在特征，為原藥材或飲片品種鑒定，特別是同屬不同種或含相同有效成分不同種的藥材的鑒別，提供更多更細(xì)致的信息和依據(jù)。 要求“準(zhǔn)確的辨認(rèn)”而不是“精密的測(cè)量”；比較供試品與對(duì)照品的色譜指紋圖譜要求“相似”而不是“相同”。評(píng)價(jià)色譜比較的結(jié)果，是根據(jù)其模糊屬性，

23、著眼于宏觀的規(guī)律性的特征分析，即著重辨認(rèn)完整色譜的“圖貌”，而不是求索細(xì)枝末節(jié)。計(jì)算機(jī)輔助相似度評(píng)價(jià)第三節(jié) 中藥指紋圖譜研究實(shí)例例1 中藥大黃指紋圖譜研究(一) 基源 為蓼科植物掌葉大黃Rheum Palmatum L.、唐古特大黃Rheum tanguticum Maxim. ex Balf.或藥用大黃Rheum officinale Baill.的干燥根及根莖。(二) 產(chǎn)地 掌葉大黃主產(chǎn)于甘肅、青海、西藏、四川等地；唐古特大黃主產(chǎn)于青海、甘肅、西藏及四川等地。二者商品均稱為“西大黃”、“北大黃”。藥用大黃主產(chǎn)于四川、貴州、云南、湖北、陜西等地，商品稱為“南大黃”、“川大黃”。商品以掌葉大黃

24、產(chǎn)量大，唐古特大黃次之，藥用大黃少見。 據(jù)產(chǎn)地考察及調(diào)查，甘肅莊浪、禮縣大黃種植面積約6666.67km2，年產(chǎn)量約5萬噸，資源十分豐富。甘肅主產(chǎn)區(qū)大黃資源分布圖 (三) 化學(xué)成分 主含蒽醌類成分：大黃酸(rhein)、大黃素(emodin)、大黃酚(chrysophanol) 、蘆薈大黃素(aloe-emodin)、大黃素甲醚(physcion)、番瀉苷A、B、C、D、E、F(sennoside A、B、C、D、E、F)、大黃酸-8-葡萄糖苷(rhein-8-mono-D-glucoside)、大黃素甲醚葡萄糖苷(physcion monoglucoside)、蘆薈大黃素葡萄糖苷(aloe-

25、emodin monoglucoside)、大黃素葡萄糖苷(emodin monoglucoside)、大黃酚-1-葡萄糖苷(chrysophanol-1-monoglucoside)。還含苯丁酮苷類、鞣質(zhì)及相關(guān)的多元酚類等成分。 (四) 實(shí)驗(yàn)儀器和材料儀器: Agilent1100液相色譜儀，DAD檢測(cè)器；樣品: 大黃采自甘肅省華亭、莊浪、禮縣、宕昌四縣，共15份樣品，采集時(shí)間為2001年11月，經(jīng)品種鑒定為掌葉大黃。對(duì)照品: 沒食子酸(gallic acid)、大黃素(emodin)均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，供含量測(cè)定用，純度分別為98.14%、99.02%。試劑: 乙腈（美國(guó)Ted

26、ia公司，色譜純）、甲醇（上海化學(xué)試劑有限公司，分析純；Tedia公司，色譜純）、冰醋酸（南京化學(xué)試劑一廠，分析純）、重蒸去離子水（實(shí)驗(yàn)室制備）。(五)供試品溶液制備 精密稱取大黃供試品粉末(過20目篩) 2g，加入甲醇50ml，水浴(80)加熱回流1h，濾過。殘?jiān)蛹状?0ml，水浴(80)加熱回流1h，濾過，合并兩次濾液。置蒸發(fā)皿中，水浴揮去部分溶劑，加甲醇溶解并定容至25ml。用微孔濾膜（孔徑為0.45m）濾過，濾液作為供試品溶液。(六)參照物溶液制備 精密稱取沒食子酸、大黃素對(duì)照品各5mg，用甲醇溶解并定容至25ml，配成0.2mg/ml的溶液，再將該溶液稀釋10倍，作為參照物溶液。

27、(七)色譜條件 色譜柱:Inertsil ODS-3分析柱(250mm 4.6mm，5m) 流動(dòng)相: (A)1%HAc-H2O與(B)1%HAc-CH3CN梯度洗脫 055min B（）025 5575min B（）2555 7590min B（）5585 流量:1.0ml/min 柱溫: 30 檢測(cè)波長(zhǎng): 280nm 參比波長(zhǎng):380nm 分析時(shí)間: 90min (八)方法學(xué)考察 1. 精密度試驗(yàn) 取同一批次供試品（9號(hào)樣品：莊浪大黃），連續(xù)進(jìn)樣5次，考察色譜峰相似度的一致性，用“中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件”計(jì)算，結(jié)果相似度大于0.9，表明儀器精密度良好。 2. 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次樣品（9號(hào)樣品：莊浪大黃），按上法分別制備5份供試品，平行測(cè)定，考察色譜峰相似度的一致性，用“中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件”計(jì)算，結(jié)果相似度大于0.9，表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。 3.穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批次供試品溶液（9號(hào)樣品：莊浪大黃），分別在0，2，4，7，11，16，22，29，36h不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，用“中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件”計(jì)算，結(jié)果相似度大于0.9，表明供試品在36h內(nèi)穩(wěn)定。 (九)供試品溶液測(cè)定 同一上述實(shí)驗(yàn)條件，測(cè)定10批次供試品HPLC色譜圖