基因治療與反義藥物頁P(yáng)PT課件

1、基因治療與反義藥物 陳華 陳俊吉 王亦楓 肖陽 方友第一節(jié) 基因治療概論 一、基因治療的概念 凡是將新的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移得到某一個體的細(xì)胞內(nèi)，使功能正常的但表達(dá)量很低的基因、機(jī)體本身不存在的外源基因得到正常表達(dá)，或者降低、抑制機(jī)體基因的表達(dá)，從而達(dá)到治療的目的，這種治療方法就稱為基因治療 基因治療的對象是人體，因此基因治療要求確保有效和安全，其難度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的基因工程技術(shù)近些年來，基因治療取得了重大進(jìn)展，研究內(nèi)容也已經(jīng)從單基因的遺傳病擴(kuò)大到多基因的腫瘤、艾滋病、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)等方面疾病 二、基因治療的方法 1. 基因增補(bǔ) 基因增補(bǔ)就是將正常的基因?qū)氩∽兗?xì)胞或其他細(xì)胞，以補(bǔ)償缺陷基

2、因的功能或調(diào)整細(xì)胞的某些功能基因增補(bǔ)是目前最常用的基因治療方式 2. 基因替換用同源重組或者基因打靶技術(shù)，用正?；蛱鎿Q整個致病基因，使致病基因得到永久更正這種以正?；蛱鎿Q致病基因的方法是最為理想的基因治療，但是目前技術(shù)手段，體內(nèi)重組的頻率還太低，只有百萬分之一左右 3. 基因修復(fù) 是指將致病基因的突變堿基在原位進(jìn)行糾正，而正常的部分予以保留這種方法是最理想的基因治療方法，但是目前還沒有成功的報道，只是一種理論上的理想的方式4. 基因修飾 基因修飾是指將目的基因?qū)氩∽兗?xì)胞或者其他細(xì)胞，目的基因的表達(dá)產(chǎn)物特異性的修飾突變?nèi)毕菁?xì)胞的功能或者使原有的功能得到加強(qiáng)，但致病基因本身并沒有改變與基因替

3、換和基因修復(fù)相比，這種方法比較容易實(shí)現(xiàn)，也是基因治療最常用的方法之一5. 基因失活 利用反義技術(shù)將反義寡聚核苷酸或反義RNA導(dǎo)入細(xì)胞，特異性地封閉某些基因的表達(dá)，以達(dá)到抑制有害靶基因的表達(dá)作用，也就是人們通常意義上所說的反義療法 引入的反義物質(zhì)，可以通過和基因組DNA結(jié)合，降低或阻止轉(zhuǎn)錄的發(fā)生，也可以通過和mRNA的結(jié)合，阻止或降低蛋白質(zhì)的翻譯，還可以通過核酶降解mRNA 許多腫瘤的發(fā)生都涉及多重癌基因及相關(guān)基因的激活并過度表達(dá)，抑制這些基因的表達(dá)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生逆轉(zhuǎn)6. 免疫基因的治療 將抗體、抗原、細(xì)胞因子的基因?qū)牖颊叩捏w內(nèi)，改變免疫狀態(tài)，以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的 將抗原基因?qū)霗C(jī)體內(nèi)

4、，可以理解為是一種DNA疫苗，特別是治療性的核酸疫苗 7. 自殺基因治療 這是一種腫瘤的治療方法，是指向腫瘤細(xì)胞中導(dǎo)入一種基因，基因產(chǎn)物為一種酶，它可以將無細(xì)胞毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化為毒性代謝產(chǎn)物，將腫瘤細(xì)胞殺死，又稱為活化前體藥物基因治療，這種基因也就被稱為“自殺基因”8. 耐藥基因治療 耐藥基因的治療是指為了提高機(jī)體耐受腫瘤化療藥物的能力，將產(chǎn)生抗毒性的基因?qū)肴梭w細(xì)胞如向骨髓干細(xì)胞中導(dǎo)入多藥抗性基因mdr-1，使機(jī)體耐受更大劑量的化療 三、基因治療的途徑 ex vivoin vivo 1. ex vivo 是指將含外源基因的載體外導(dǎo)入到人體自身或異體細(xì)胞（異種細(xì)胞），經(jīng)體外細(xì)胞擴(kuò)增后，輸回人

5、體 這種方法簡單，溶液操作，而且外源物質(zhì)能被稀釋并清除。但是載體系統(tǒng)不易形成規(guī)模，而且需要專門的臨床基地 2. in vivo 將外源基因裝配與特定的真核表達(dá)載體，直接導(dǎo)入體內(nèi) 載體可以是病毒型的或者非病毒型的，甚至可以是裸露的DNA 這種方式比較容易大規(guī)模生產(chǎn)。但是必須保證載體的安全性，而且進(jìn)入人體后，能導(dǎo)入靶細(xì)胞并穩(wěn)定表達(dá)達(dá)到治療目的 第二節(jié) 基因治療的原則和問題 一、 基因治療的原則 基因治療的步驟 分離出具有特定功能的特異性基因獲得足夠量該基因的載體或細(xì)胞建立有效的途徑將外源基因?qū)霗C(jī)體內(nèi) 進(jìn)入宿主細(xì)胞的外源基因必須產(chǎn)生足夠量的產(chǎn)物，維持適當(dāng)?shù)臅r間，且不產(chǎn)生有害的副作用 1. 選擇目的

6、基因的原則 待研究基因的異常是發(fā)生疾病的根源該基因遺傳的分子機(jī)制已經(jīng)研究清楚基因已經(jīng)被克隆，且表達(dá)機(jī)制研究得較為清楚轉(zhuǎn)移的基因最好能夠完整、穩(wěn)定地整合到受體細(xì)胞的基因組上，并且適量表達(dá)功能蛋白有合適的啟動子控制、完整的信號肽等 2. 受體細(xì)胞選擇的原則 最好選擇組織特異性細(xì)胞，以便使外源基因只在該特異性組織細(xì)胞中表達(dá)，而在其他組織中不表達(dá)或表達(dá)水平很低細(xì)胞易于從體內(nèi)取出，有增值趨勢，且生命周期較長離體的細(xì)胞能接受外源基因的轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)過體外操作能夠存活下來，并能安全輸送回體內(nèi)3. 載體的選擇 作為一種基因載體，易于導(dǎo)入到受體細(xì)胞調(diào)控基因復(fù)制、表達(dá)等元件，在宿主細(xì)胞中能適量表 二、基因治療中的問題

7、 安全性 高效的靶向性基因?qū)?外源基因表達(dá)的可控性 治療基因過少 第三節(jié) 基因治療的病毒載體 用于基因治療的病毒載體系統(tǒng)應(yīng)該具備條件 攜帶外源基因并能包裝成病毒顆粒介導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)移和表達(dá)對機(jī)體不致病 一、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 轉(zhuǎn)錄病毒是一類正鏈RNA病毒，可以逆轉(zhuǎn)錄成DNA，以前病毒形式存在，前病毒還可以整合到基因組上，和宿主細(xì)胞長期共存二、腺病毒載體 腺病毒是雙鏈DNA病毒腺病毒通過大量復(fù)制DNA和蛋白質(zhì)，并包裝成病毒顆粒，嚴(yán)重地阻礙宿主細(xì)胞的DNA和蛋白質(zhì)的合成，使細(xì)胞營養(yǎng)枯竭而死亡腺病毒主要感染上皮細(xì)胞，產(chǎn)毒性感染主要發(fā)生在腸胃道、呼吸道和眼部上皮細(xì)胞三、腺相關(guān)病毒載體 腺相關(guān)病毒是單鏈線

8、狀DNA病毒，最初在腺病毒液中發(fā)現(xiàn)腺病毒必須在外界刺激因子作用下發(fā)生復(fù)制性感染，一般情況下以潛伏狀態(tài)與宿主共存偏向于整合到人基因組19號染色體的長臂上 四、單純皰疹病毒載體 單純皰狀病毒是雙鏈DNA病毒 第四節(jié) 基因治療的非病毒載體 一、脂質(zhì)體 陽離子脂質(zhì)體 陰離子脂質(zhì)體 pH敏感型脂質(zhì)體 融合脂質(zhì)體 二、陽離子多聚物 利用DNA的電負(fù)性，可以和電正性的氨基基團(tuán)相互作用，形成穩(wěn)定的多聚物，使DNA不易被核酸酶降解，并可防止大的復(fù)合物在短時間內(nèi)沉淀，從而提高轉(zhuǎn)染效率 三、質(zhì)粒DNA 質(zhì)粒DNA就是在體外將目的基因及其所有的順式調(diào)控元件質(zhì)粒DNA的基因轉(zhuǎn)移為非整合性，但是轉(zhuǎn)染效率低，難以在細(xì)胞中長

9、期表達(dá)質(zhì)粒DNA可以采用三種方式注射到機(jī)體內(nèi)：裸露DNA直接注射，目前在骨骼肌和心肌中表達(dá)最好；將DNA包裹在脂質(zhì)體中注射；受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，將DNA與配體相連，增加DNA的定向?qū)?四、其他非病毒載體 1. 脂質(zhì)DNA多聚物結(jié)合脂質(zhì)體和陽離子多聚物的優(yōu)點(diǎn)，將脂質(zhì)體、DNA、多聚賴氨酸混合制備而成。2. 生物高聚物DNA微球體和納米粒生物高聚物如白明膠、殼聚糖等，可以包裹或結(jié)合DNA，形成微米級或納米級的藥物3. 利用微生物或其他成分構(gòu)建的載體如利用病毒外殼蛋白的運(yùn)輸能力，來介導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)移 第五節(jié) 疾病的基因治療 一、基因治療與腫瘤 腫瘤的基因治療，根據(jù)作用機(jī)制可以分成兩類調(diào)節(jié)機(jī)體免疫利用正

10、常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的差異。1. 導(dǎo)入細(xì)胞因子基因進(jìn)行治療 許多細(xì)胞因子，如干擾素、白介素、腫瘤壞死因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子等，都有提高人體免疫力，抑制腫瘤的作用 2. 導(dǎo)入MHC的基因治療 主要組織相容性復(fù)合體（MHC）是具有個體特性的抗原系統(tǒng) 腫瘤細(xì)胞免疫逃逸機(jī)制中一個重要方面，就是腫瘤細(xì)胞上的MHC表達(dá)很弱或者不表達(dá)，使機(jī)體免疫應(yīng)答不能發(fā)生 3. 導(dǎo)入抑癌基因的基因治療 很多腫瘤細(xì)胞的某些基因異常表達(dá)，被稱為癌基因，當(dāng)他們處于正常狀態(tài)時，就稱為原癌基因機(jī)體正常細(xì)胞存在抑制細(xì)胞異常增殖的基因，即抑癌基因，它們在細(xì)胞周期的調(diào)控和細(xì)胞凋亡中，起著非常重要的作用腫瘤細(xì)胞中，抑癌基因往往會產(chǎn)生

11、突變、重排或缺失或者表達(dá)異常。4. 自殺基因的治療 自殺基因療法的基本思想就是將編碼某種特殊酶的基因?qū)爰?xì)胞，使無毒的前體藥物轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘亩疚?，引起靶?xì)胞的死亡 5. 腫瘤疫苗 從基因治療的角度來看，腫瘤疫苗就是將腫瘤的組織特異性抗原的基因，導(dǎo)入到機(jī)體內(nèi)，表達(dá)出的抗原，激發(fā)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷 二、基因治療與艾滋病 艾滋病又稱獲得性免疫缺陷綜合癥，是由于人免疫缺陷病毒HIV感染，特異性地破壞了免疫細(xì)胞CD4，使機(jī)體發(fā)生免疫缺陷，造成機(jī)體發(fā)生腫瘤、機(jī)會性感染的一種致死性疾病HIV病毒是單鏈的RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒，其外殼糖蛋白Gp120可以和CD4特異性高親和力結(jié)合，使CD4T細(xì)胞減少

12、，并使細(xì)胞因子的分泌功能受阻，引起機(jī)體的免疫缺陷 1. 反義核酸 用互補(bǔ)于mRNA的DNA或RNA，在細(xì)胞內(nèi)形成雙鏈分子，阻礙mRNA的剪接、運(yùn)送、翻譯，降低mRNA的穩(wěn)定性，從而影響病毒基因的表達(dá)與復(fù)制。目前需要解決的問題是反義核酸的專一性轉(zhuǎn)移和進(jìn)入靶細(xì)胞之前的降解 2. 核酶 核酶是具有催化RNA自我剪切反應(yīng)的核酸，目前報道的核酶是在培養(yǎng)細(xì)胞上干預(yù)HIV基因的表達(dá)核酶的穩(wěn)定性比較低，生理?xiàng)l件下反應(yīng)緩慢是其用于抗HIV的不足之處，同時針對它在機(jī)體內(nèi)是怎樣被轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后抗RnaseH的能力還需進(jìn)一步研究 3. 可溶性CD4分子的表達(dá) 編碼CD4的基因已經(jīng)得到了克隆，并已經(jīng)在真核系統(tǒng)中表達(dá)。將C

13、D4分子的編碼基因通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入到外周淋巴細(xì)胞、骨髓造血干細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞中得到表達(dá)，表達(dá)出來的CD4分子可以與入侵的HIV病毒包膜蛋白Gp120結(jié)合，競爭性地保護(hù)CD4T淋巴細(xì)胞不受或少受感染 4. 特異性抗體的誘導(dǎo) 誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗HIV的特異性抗體也是抗HIV治療的一個重要方法，將gp120的基因?qū)肴梭w中表達(dá)，誘導(dǎo)抗包膜蛋白Gp120的體異性抗體，不僅可以誘導(dǎo)產(chǎn)生IgG，而且可以引發(fā)特異性的細(xì)胞免疫 5. Tat蛋白突變體表達(dá)Tat蛋白在HIV病毒基因的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中有著極為重要的反式調(diào)控作用，將突變體形式的tat基因?qū)肴梭w后，突變體的大量表達(dá)，競爭性地結(jié)合

14、Tat受體位點(diǎn)，抑制或干擾HIV病毒基因組的正常復(fù)制和轉(zhuǎn)錄功能 第六節(jié) 反義技術(shù)概論 一、反義技術(shù)與反義核酸 反義技術(shù)是指用人工合成或生物合成的核酸分子,抑制、封閉、破壞靶基因的技術(shù)。反義技術(shù)中的核酸分子可以是DNA，RNA或者肽核酸 反義技術(shù)中所用的核酸，一般又稱為反義核酸，就是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原理，結(jié)合并調(diào)節(jié)靶基因活性的核酸分子 通過翻譯技術(shù)制備的藥物，就是人們常說的反義藥物 二、反義核酸藥物特點(diǎn) 1）高度特異性2）高效性3）最優(yōu)化的藥物設(shè)計 4）低毒、安全 5）制備簡單 三、反義技術(shù)的分類1. 反義脫氧核苷酸（ODN） 又稱反義DNA，通過與mRNA的結(jié)合形成DNA-RNA雜合體，從而影

15、響基因的表達(dá)調(diào)控。 由于DNA序列合成儀的廣泛使用，所以O(shè)DN很容易獲得 2. 反義RNA 反義RNA是與能mRNA序列互補(bǔ)配對形成雙鏈復(fù)合物的RNA片段，影響基因的翻譯 3. 核酶 核酶存在于生物細(xì)胞中，是一類具有催化活性的RNA分子，具有核酸酶的水解活性，可以特異性地剪切RNA分子 4. 三鏈形成寡核苷酸（TFO） 三鏈形成寡聚核苷酸是指可與雙鏈或單鏈DNA形成三股鏈，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄的寡核苷酸 5. 肽核酸（PNAS） 肽核酸是以肽為骨架的DNA類似物，是用手性不對稱的中性肽鏈骨架置換脫氧核糖磷酸而成第七節(jié) 反義技術(shù)原理和方法一、反義脫氧核酸天然存在未經(jīng)修飾的磷酸二酯脫氧化核苷酸（POO

16、DN）作為反義藥物雖然有和靶RNA發(fā)生特異序列結(jié)合，激活Rnase H的活性，但是在生理?xiàng)l件下，PO-ODN對核酸酶很敏感，易被快速降解，限制了它的實(shí)際使用 1. 第一代硫代寡聚核苷酸（PS-ODN） 以一個硫原子取代了核酸中磷酸的非橋羥基上的氧原子 顯著地提高了化合物在各種環(huán)境中對核酸酶的穩(wěn)定性，而且保留了在交親和性以及對RnaseH的激活活性 第一個獲得美國FDA批準(zhǔn)的反義藥物弗米韋新 2. 第二代混合骨架寡核苷酸（MBO） 典型的MBO為三明治寡核苷酸 中間是PS-ODN片段 ，能夠提供激活RnaseH活性的信息 5端和3端為對核酸酶穩(wěn)定的修飾寡核苷酸，主要是對核糖的2號位烷基化的PS-

17、ODN 一個MBO分子通常由中間810個堿基的PS-ODN和兩端的46個甲基化的PS-ODN組成 二、反義RNA 反義RNA可以通過人工合成，但是更容易被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶降解一般利用基因重組技術(shù)將靶基因序列反向插入到病毒載體或質(zhì)粒載體的啟動子和終止子之間，克隆后導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，從而源源不斷地產(chǎn)生反義RNA 常用的病毒載體有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、HIV病毒載體非病毒載體常用的就是質(zhì)粒載體。 三、核酶 1990年Sarver首先報道核酶在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中成功地抑制了HIV的復(fù)制，從而引起了越來越多的醫(yī)學(xué)和生物工作者的重視 天然存在的核酶根據(jù)催化活性分為下面幾類1）錘頭狀核酶

18、、發(fā)卡核酶和肝炎核酶。它們?yōu)樾》肿雍嗣?，主要在病毒或類病毒RNA中發(fā)現(xiàn)，其特點(diǎn)是可以自我剪切特定的磷酸二酯鍵。2）I型內(nèi)含子和II型內(nèi)含子核酶。它們分子量較大，在低等生物和一些細(xì)菌的內(nèi)含子中存在，可以進(jìn)行自我剪接，被加工成反式作用的核酶3）RNaseP核酶。最早在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，具有tRNA前體加工活性獲得核酶的方法可以通過人工合成或表達(dá)載體的表達(dá)裸露的RNA在體液中的半衰期是以秒來計算的，所以局部注射或使用裸露RNA是不可能的必須通過修飾增加穩(wěn)定性后才能直接使用用載體進(jìn)行表達(dá)是比較好的選擇，最常用的載體是腺相關(guān)病毒載體 四、三鏈形成寡核苷酸 三鏈形成寡聚核苷酸是直接作用于DNA的轉(zhuǎn)錄或復(fù)制過程寡聚嘧啶或嘌呤的TFO，通過Hoogteen堿基配對規(guī)則，形成三鏈核苷酸，從而抑制