抗體制備技術(shù)課件(PPT 87頁)

1、抗體制備技術(shù)第1頁，共87頁。 是指無性繁殖細胞系，是由單一個祖先細胞分裂繁殖而形成的一簇細胞純系。在這個家族的所有成員中，如無突變發(fā)生，其基因是完全相同的。 克隆(clone)第2頁，共87頁。 1、多克隆抗體（polyclonal antibody, pAb）：用一種包含多種抗原決定簇的抗原免疫動物，可刺激機體多個B細胞克隆產(chǎn)生針對多種抗原表位的不同抗體。所獲得的免疫血清實際上是含有多種抗體的混合物。2、單克隆抗體（monoclonal antibodies, mAb）：由一個識別一種抗原表位的B細胞克隆產(chǎn)生的同源抗體。高度均一、特異性強、效價高、少或無交叉反應(yīng)性。第3頁，共87頁。 抗體

2、的制備技術(shù)經(jīng)歷了三代：第一代抗體是傳統(tǒng)的抗體制備方法即利用抗原免疫動物后獲得抗體，稱為多克隆抗體（polyclonal antibody）；第二代抗體是通過雜交瘤技術(shù)制備出針對抗原中某一抗原決定簇的抗體稱為單克隆抗體(monoclonal antibody, McAb)；第三代抗體是利用基因工程技術(shù)制備而來，稱為基因工程抗體(genetic engineering antibody)。第4頁，共87頁。Ab1Ab3Ab4單克隆抗體抗原Ab1抗血清Ab1Ab2Ab3Ab4Ab2Ab3Ab4普通抗血清（多克隆抗體）脾B細胞骨髓瘤小鼠取腹水骨髓瘤細胞HAT培養(yǎng)，稀釋單克隆抗體和多克隆抗體產(chǎn)生區(qū)別示意

3、圖雜交瘤細胞+ PEG, 融合Ab2第5頁，共87頁。 抗體制備技術(shù)一、多克隆抗體制備（一）免疫原的制備（二）免疫動物（三）免疫血清的純化（四）免疫血清的鑒定（五）免疫血清的保存二、單克隆抗體制備（一）單克隆抗體制備原理第6頁，共87頁。 抗體制備技術(shù)（二）單克隆抗體制備的技術(shù)要點（三）影響雜交瘤技術(shù)的因素（四）單克隆抗體的應(yīng)用三、基因工程抗體技術(shù)（一）人源化抗體（二）小分子抗體（三）雙特異性抗體（四）抗體庫技術(shù)第7頁，共87頁。多克隆抗體制備一、免疫原的制備免疫原（immunogen）指能刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體或致敏淋巴細胞的抗原最重要的性質(zhì)是免疫原性（immunogenicity）

4、免疫原天然抗原、人工 合成抗原； 蛋白質(zhì)、多糖、脂類、核酸抗原； 第8頁，共87頁。（一）、細胞性抗原制備： 綿羊紅細胞（SRBC）- 溶血素； 細菌- 抗菌抗體（動物免疫血清）（二）、可溶性抗原制備： 指蛋白質(zhì)、多糖和脂類等。作為免疫原需要由細胞的破碎、提取與純化1）細胞的破碎（物理法、化學(xué)法）第9頁，共87頁。反復(fù)凍融法超聲破碎法自溶法酶處里法表面活性劑處理法第10頁，共87頁。2）提取與純化：超速離心分離是一種根據(jù)分離物質(zhì)的比重特點，通過差速或梯度密度離心，將分子大小不同的抗原顆粒分開的方法，只適宜少數(shù)大分子物質(zhì)的分離。第11頁，共87頁。選擇性沉淀選擇某抗原理化特性，采用相應(yīng)沉淀劑或溶

5、液環(huán)境。 核酸去除 鹽析沉淀法 有機溶劑沉淀法 高分子聚合物沉淀法例： 50%飽和硫酸銨鹽溶液可沉淀析出學(xué)清球蛋； 8%12%PEG6000可沉淀IgG。第12頁，共87頁。 鹽析法沉淀抗原的機理 第13頁，共87頁。超濾法利用孔徑大小不同的特制薄膜對不同分子大小的抗原物質(zhì)進行濾篩。層析法 凝膠過濾 離子交換 親和層析電泳（略）第14頁，共87頁。 凝膠過濾層析( 分子篩)的作用機理第15頁，共87頁。 親和層析的作用機理第16頁，共87頁。3）鑒定： 鑒定純化蛋白的含量、相對分子的質(zhì)量、 純度以及免疫學(xué)活性。蛋白的含量定氮（紫外光280nm等）分子的質(zhì)量電泳、質(zhì)譜蛋白的純度電泳等免疫學(xué)活性免

6、疫雙擴散、免疫印跡第17頁，共87頁。 抗原性質(zhì)分析結(jié)果第18頁，共87頁。（三）半抗原性免疫原的制備1.載體選擇常用載體：蛋白質(zhì)、多肽聚合物、大分子聚合物。（1）蛋白質(zhì)類：常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血蛋白等，其中以牛血清白蛋白最為常用。（2）多肽類聚合物：是由人工合成的多肽聚合物，也是一類良好的載體，常用的有多聚賴氨酸。（3）大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲基纖維素(CMC)等皆可與半抗原結(jié)合，加入福氏完全佐劑可誘導(dǎo)動物產(chǎn)生良好的抗體。第19頁，共87頁。2.連接方法 半抗原與載體的連接有物理法和化學(xué)法。物理法 是用物理吸附法將載體與半抗原連接，其原理是通過電荷和微孔來

7、吸半抗原，吸附載體主要有PVP和CMC等；化學(xué)法 是利用某些功能基團把半抗原連接到白質(zhì)類或多肽類聚合物載體上。不同的半抗原應(yīng)選用不同的方法進行連接。第20頁，共87頁。 根據(jù)半抗原擁有的化學(xué)基團不同，連接方法主要有以下幾類：帶游離氨基或羧基以及二種基團皆有的半抗原：羧基可用混合酸酐法和碳二亞胺法與載體氨基形成穩(wěn)定的肽鍵，帶氨基的半抗原則可與載體羧基縮合。帶有羥基、酮基、醛基的半抗原：不能直接與載體連接，需要用化學(xué)方法如琥珀酸酐法、O-（羧甲基）羥胺法等方法將之轉(zhuǎn)變?yōu)閹в恤然陌肟乖苌锖蟛拍芘c載體連接。帶有酚基的半抗原，可用一氯醋酸鈉法或重氮化的對氨基苯甲酸法，生成帶有羧基的半抗原衍生物。第

8、21頁，共87頁。（五）免疫佐劑某些物質(zhì)與抗原一起或先于抗原注入機體，可增強機體對該抗原的特異性免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型，此類物質(zhì)稱為免疫佐劑(immunoadjuvant)，簡稱佐劑。 第22頁，共87頁。佐劑的種類 佐劑一般包括以下幾類：無機佐劑： 如氫氧化鋁、明釩等生物性佐劑： 如結(jié)核分枝桿菌、卡介苗、小棒狀桿菌、百日咳桿菌、革蘭陰性桿菌內(nèi)毒素、霍亂毒素的B亞單位、胞壁酰二肽和細胞因子等；人工合成佐劑： 如雙鏈多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）、雙鏈多聚腺苷酸：尿苷酸（poly A：U）；油劑： 如弗氏完全佐劑、花生油乳劑等；納米佐劑 第23頁，共87頁。 弗氏佐劑（Freunds

9、 adjuvant）,分為弗氏不完全佐劑和完全佐劑兩種：前者是由油劑（礦物油或花生油）和乳化劑（羊毛脂或吐溫-80）按1：11：5比例混合而成；后者由弗氏不完全佐劑加卡介苗組成。在免疫動物時，先將弗氏佐劑與抗原等比混勻，制成“油包水”乳化液。 第24頁，共87頁。 佐劑與抗原混合乳化的方法：研磨法和攪拌混合法兩種 第25頁，共87頁。 2. 佐劑的免疫生物學(xué)作用增強抗原免疫原性：使無或微弱免疫原性的物質(zhì)變成持久或強的免疫原；增強機體對抗原刺激的反應(yīng)性，提高初次應(yīng)答和再次應(yīng)答所產(chǎn)生的抗體滴度；改變抗體類型，使產(chǎn)生抗體由IgMG型轉(zhuǎn)變?yōu)镮gG型；引起或增強遲發(fā)性超敏反應(yīng)。第26頁，共87頁。3.

10、佐劑的作用機制 佐劑的作用機制歸納起來主要有如下幾種：可增強抗原的表面積和改變抗原活性基團構(gòu)型，從而增強抗原的免疫原性。佐劑與抗原混合一起注入機體，可改變抗原的物理性狀，形成抗原儲存庫，延長抗原在局部組織的滯留時間，有利于抗原的緩慢釋放。增強吞噬細胞的吞噬作用（被佐劑吸附的抗原易被吞噬細胞吞噬），促進對抗原的處理，刺激淋巴細胞增生，從而增強和擴大免疫應(yīng)答的效應(yīng)。 第27頁，共87頁。二、免疫動物 為獲取高質(zhì)量的抗體，除了需制備高純度的抗原外，還需選擇適宜的動物和設(shè)計有效可行的免疫方案，如抗原的劑量、劑型、注射途徑、注射次數(shù)、注射間隔和接種動物的年齡均與免疫效果密切的關(guān)系。 第28頁，共87頁。

11、1.免疫動物的選擇 選擇動物時應(yīng)考慮以下因素：抗原來源與動物種屬的關(guān)系?？乖膩碓磁c免疫動物種屬差異越遠，其免疫源性越強，免疫效果越好，而同種系或親緣關(guān)系越近，免疫效果越差。動物個體的選擇。適齡、健康、體重符合要求的正常動物（以雄性為佳）；抗體需要量少時，選用家兔、豚鼠和雞等小動物；抗體需要量大時，可選用綿羊、山羊、馬、驢等大動物。抗原性質(zhì)與動物種類。第29頁，共87頁。2.免疫方法 選定動物后，在免疫過程中應(yīng)考慮免疫劑量、免疫途徑、免疫次數(shù)、免疫間隔等因素。 (1) 免疫原的劑量：免疫原的接種劑量按免疫原性的強弱、動物的個體狀態(tài)和免疫時間來確定。首次免疫時，劑量不宜過大，以免產(chǎn)生免疫麻痹。第

12、30頁，共87頁。 (2) 免疫途徑與免疫間隔時間免疫途徑通常有皮內(nèi)、皮下、肌肉、靜脈、腹腔、淋巴結(jié)等，視不同的免疫方案而異。對于不易獲取的寶貴抗原可采用淋巴結(jié)免疫法。 免疫間隔時間是影響抗體產(chǎn)生的重要因素，其中首次與第二次免疫的間隔時間尤為重要，一般以1020天為佳，二次后間隔時間一般為710天，若間隔時間太長，則刺激減弱，抗體效價不高。 第31頁，共87頁。 3. 動物采血 采集免疫血清前，要預(yù)先測試抗體效價測定，若效價達到要求，應(yīng)在末次免疫后一周及時采血，否則抗體效價會下降。 (1) 頸動脈采血法 (2)心臟采血法 (3)靜脈采血法 第32頁，共87頁。圖1 頸動脈分離圖 第33頁，共8

13、7頁。三、免疫血清的純化 1. 特異性抗體的純化 免疫原不純，導(dǎo)致產(chǎn)生雜抗體混雜于抗血清中。雜抗體的除去可采用： (1) 親和層析法（2）吸附法 第34頁，共87頁。2. IgG類抗體的純化 IgG類抗體的純化常用方法有鹽析法、凝膠過濾、離子交換層析、親和層析等方法。 (1) 鹽析法：硫酸銨鹽析常用于-球蛋白提取，經(jīng)三次沉淀后提取的-球蛋白大多屬于IgG。第35頁，共87頁。(2) 凝膠過濾法：各種蛋白質(zhì)成分的分子量大小不同，在通過凝膠介質(zhì)時，洗脫速度也不同，從而達到分離目的。 血清蛋白的分級分離常用凝膠過濾法進行，按分子大小可分為三組：第一組包括IgM和一些脂蛋白；第二組主要是IgG和較少量

14、的IgA、IgD、IgE等球蛋白；第三組主要白蛋白、血清粘蛋白、鐵傳遞蛋白等。第36頁，共87頁。 在凝膠過濾柱上血清蛋白的層析示意圖 (M=IgM, G=IgG, A=IgA) 第37頁，共87頁。(3) 離子交換層析法純化IgGIgG作為一種-球蛋白，在血清蛋白中帶電荷較最少，用離子交換層析法易于分離。DEAE-Sephadex A-50是一弱堿性離子交換劑，常用于免疫球蛋白的純化。血清中的-球蛋白屬于中性蛋白，其余均屬酸性蛋白。在pH7.27.4的環(huán)境中, 酸性蛋白被DEAE-Sephadex A-50吸附，-球蛋白不被吸附而得以純化。該技術(shù)純化IgG簡便，不損壞抗體結(jié)構(gòu)和特異性。 第3

15、8頁，共87頁。圖3 在DEAE-纖維素上人血清蛋白的層析示意圖 (M=IgM, G=IgG, A=IgA) 第39頁，共87頁。(4) 親和層析法純化 葡萄球菌A蛋白（SPA）或連球菌G蛋白具有與IgG Fc段結(jié)合的能力，可用親和層析來分離IgG。 分離時可采用兩種類型的親和層析柱即SPA或G蛋白交聯(lián)至Sepharose 4B制成的親和層析柱?？寡逋ㄟ^層析柱時，IgG被吸附，而非特異性蛋白則未能結(jié)合被洗脫除去，然后改變洗脫條件，使IgG從層析上解離從而達到純化目的 。第40頁，共87頁。圖4 親和層析純化IgG基本過程示意圖 第41頁，共87頁。四、免疫血清的鑒定1. 效價的測定：顆粒性抗

16、原可采用凝集試驗，可溶性抗原常用雙向免疫擴散試驗、ELISA等方法。2. 特異性的鑒定：抗體特異性鑒定常用雙向免疫擴散法、免疫電泳法第42頁，共87頁。3. 純度的鑒定： 抗體純度的鑒定可采用SDS-聚丙酰胺凝膠電泳（SDS）、雙向擴散試驗、免疫電泳等方法。 IgG含有重鏈和輕鏈，純IgG的SDS結(jié)果應(yīng)有兩條蛋白電泳帶（分子量約53kD和22kD），若出現(xiàn)多條電泳帶則表明制備的抗體混有雜蛋白，需進一步純化。4. 親和力的鑒定：測定抗體親力的方法較多，如平衡透析法、ELISA或RIA競爭結(jié)合試驗等。第43頁，共87頁。單抗親合常數(shù)的測定：單抗親合常數(shù)測定采用非競爭酶免疫試驗法：1）先確定在某一抗

17、原濃度時抗體可以達到飽和；2）以該抗原濃度為實驗條件，飽和時的OD值作為OD-100，找出OD-50時的抗體濃度和相應(yīng)的pp65抗原濃度；3)根據(jù)公式Ka= n-1 計算McAb的Ka值。 2(nAbt-Ab t)t代表測定時的溫度；n=Abt/Abt；Abt表示抗原濃度較高的Amax的一半；Abt表示抗原濃度較低的Amax的一半。對于單克隆抗體，一般親合力要求107L/mol，好的單抗多大于109 L/mol。 第44頁，共87頁。五、免疫血清的保存 1、4保存（6個月）2、低溫保存（-70 -20 ，5年）3、真空干燥保存（5 10年）注意點：保存前需經(jīng)除菌 保存液含防腐劑 避免反復(fù)凍融（

18、分裝） 第45頁，共87頁。第二節(jié) 單克隆抗體的制備 Preparation of monoclone antibody第46頁，共87頁。單克隆抗體（McAb） 是由只識別單一抗原決定簇的B細胞克隆產(chǎn)生的同源抗體。 理化性狀高度均一 效價高 只與一種抗原表位發(fā)生反應(yīng)、生物活性單一 具有高度特異性又易于大量制備第47頁，共87頁。 克隆選擇學(xué)說的模式圖第48頁，共87頁。單克隆抗體制備方法：雜交瘤技術(shù)EBV技術(shù)第49頁，共87頁。雜交瘤單克隆抗體?通過抗原致敏B淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤細胞，經(jīng)克隆化培養(yǎng)所形成單克隆雜交瘤細胞克隆，所分泌的針對抗原上某一抗原表位的純的抗體，具有生物活性

19、單一，理化性質(zhì)高度均一，產(chǎn)量高等特點。第50頁，共87頁。一、雜交瘤技術(shù)的基本原理第51頁，共87頁。 一、雜交瘤技術(shù)的原理及流程第52頁，共87頁。第53頁，共87頁。第54頁，共87頁。二、單克隆抗體制備技術(shù)主要材料細胞融合前準(zhǔn)備細胞融合 抗體的初篩和克隆化雜交瘤細胞凍存與復(fù)蘇單克隆抗體的批量生產(chǎn)單克隆抗體的純化與鑒定第55頁，共87頁。（一）主要材料： 培養(yǎng)液1.RPM1640培養(yǎng)液 FCS 10% 谷氨酰胺 2mmol/L 青霉素 100IU/ml 鏈霉素 100Ug/ml2.DMEM培養(yǎng)液第56頁，共87頁。H（Hypoxanthine, H）次黃嘌呤； A（Aminopterin）

20、氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑 T (Thymidine, T) 胸腺嘧啶核苷； “核苷酸前體”，供細胞通過替代途徑合成DNA。 。HAT培養(yǎng)基第57頁，共87頁。 淋巴細胞：在培養(yǎng)液中不能生長，5-7天死亡； 骨髓瘤細胞：在培養(yǎng)液中不能生長，5-7天死亡； DNA合成的主要途徑：被A阻斷； DNA合成的替代途徑：由于HGPRT缺乏，不能利用 H、T而被阻斷。HAT選擇作用第58頁，共87頁。PEG是最常用的細胞融合劑。PEG可能的作用機理： PEG導(dǎo)致細胞膜上脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細胞膜易打開而有助于細胞融合。PEG的細胞融合作用完全是隨機發(fā)生的。一般選用分子量4000 的PEG

21、作為細胞融合劑。不同廠商、批號、分子量的PEG，其純度與毒性有所不同。細胞融合劑第59頁，共87頁。（二）細胞融合前準(zhǔn)備 1. 免疫方案 顆粒性抗原 可溶性抗原 2. 飼養(yǎng)細胞 3. 骨髓瘤細胞 4. 免疫脾細胞第60頁，共87頁。常用骨髓瘤細胞系有：NS1SP20X63 Ag8.653 第61頁，共87頁。第62頁，共87頁。骨髓瘤細胞系選擇要點：動物品系相同不產(chǎn)生免疫球蛋白重鏈和輕鏈對HAT敏感融合后產(chǎn)生穩(wěn)定性高的雜交瘤細胞第63頁，共87頁。1 選擇對數(shù)生長期的細胞進行傳代培養(yǎng)，細胞形態(tài)應(yīng)是渾圓、透亮、均一、排列整齊。2 避免細胞返祖：定期用8-AG處理細胞。 切忌過多傳代培養(yǎng)，可將細胞

22、分裝凍存于-80或液氮及干冰中。 培養(yǎng)骨髓瘤細胞第64頁，共87頁。 1. 細胞融合 2. HAT選擇雜交瘤(二) 細胞融合，選擇雜交瘤第65頁，共87頁。（三）抗體初篩與克隆化以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。常用的方法有:1.ELISA用于可溶性抗原(蛋白質(zhì))、細胞和病毒等McAb的檢測。2.RIA用于可溶性抗原、細胞McAb的檢測。3.FACS(流式細胞術(shù))用于檢查細胞表面抗原的McAb檢測。 第66頁，共87頁。（四）雜交瘤的凍存和克隆化1. 克隆化方案 用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀釋和軟瓊脂平板法。 (1) 有限稀釋法 (2) 軟瓊脂法第67頁，共87頁。2. 雜交瘤細

23、胞的凍存細胞凍存液:50小牛血清40不完全培養(yǎng)液10DMSO(二甲亞砜)第68頁，共87頁。（五）單克隆抗體的大量生產(chǎn)大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：1.體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細胞，從上清中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液含量為1060gml，如果大量生產(chǎn)，費用較高。 2.體內(nèi)接種雜交瘤細胞，制備腹水或血清。 第69頁，共87頁。（六）單克隆抗體的鑒定1.抗體特異性的鑒定： 2.McAb的Ig類與亞類的鑒定： 3. McAb中和活性的鑒定：4.McAb親和力的鑒定： 第70頁，共87頁?？贵w的純化：硫酸銨沉淀離子交換層析SPA-sepharose 親和層析柱分離第71頁

24、，共87頁。影響雜交瘤技術(shù)的因素1、試劑與器材 用前必須經(jīng)嚴格的篩選，尤其血清、融合劑2、培養(yǎng)技術(shù) 防止污染，細胞培養(yǎng)的嫻熟技能3、早期克隆化 避免無關(guān)細胞克隆的過度生長，但又應(yīng)避免 克隆細胞的丟失。第72頁，共87頁。第四節(jié) 基因工程抗體技術(shù) Genetic Engineering Technique 是指應(yīng)用NDA重組及蛋白工程技術(shù)對編碼抗體的基因按不同的需要進行改造和裝配，經(jīng)導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細胞后重新表達的抗體。 基因工程抗體(重組抗體)第73頁，共87頁。基因工程抗體技術(shù)用DNA重組和蛋白工程技術(shù)對已有的單抗進行改造。包括人源化抗體、小分子抗體、雙價特異性抗體和抗體融合蛋白等的制備。用抗

25、體庫技術(shù)篩選、克隆新的單抗。 第74頁，共87頁。一、人源化抗體1. 將小鼠的CDR序列移植到人抗體可變區(qū)框架中，產(chǎn)生的抗體稱為CDR移植抗體。2.將小鼠Ig基因敲除，轉(zhuǎn)染人Ig基因，在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生人Ab，再經(jīng)雜交瘤技術(shù)，產(chǎn)生大量完全人源化抗體。第75頁，共87頁。 從雜交瘤細胞分離出功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)基因連接，插入適當(dāng)表達載體，轉(zhuǎn)染宿主細胞，表達人-鼠嵌合抗體。 特點： 1.減少了鼠源性抗體的免疫原性 2.保留了親本抗體特異性結(jié)合抗 原的能力。1.嵌合抗體(chimeric antibody)第76頁，共87頁。嵌合抗體(chimeric antibody)第77頁，共87頁。指利用基因工程技術(shù)，將人抗體可變區(qū)（V）中互補決定簇（CDR）序列改換成鼠源單抗CDR序列