植物細胞培養(yǎng)制藥課件(PPT 121頁)

1、植物細胞培養(yǎng)制藥意義藥用植物是天然藥物的寶庫植物細胞培養(yǎng)是生產(chǎn)的藥物可能途徑目前采用植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)的藥物主要包括 （1）苷（甙）類：包括皂苷（人參皂苷、三七皂苷、柴胡皂苷、著芋皂苷等）、強心苷（強心醇苷、毛地黃毒配質(zhì)衍生物等）、甘草甜苷、香豆精苷等。 （2）甾醇：包括菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、膽甾醇、異巖藻甾醇等。 第1頁，共121頁。強心苷類（側(cè)鏈為不飽和內(nèi)酯環(huán)）甾醇第2頁，共121頁。（3）生物堿：吡啶、喹啉、異喹啉等。（4）醌類：包括蒽醌、萘醌等。（5）蛋白質(zhì)類：胰島素、氨基酸、蛋白酶抑制劑。植物病毒抑制劑、植物抗生素等。（6）黃酮類：具有C6-C3-C6結(jié)構(gòu)，生物合成前體是苯丙氨酸和

2、丙二酸單酰輔酶A。多為治理心血管疾病和高血壓的藥物成分。小檗堿蒽醌黃酮第3頁，共121頁。植物細胞培養(yǎng)制藥進展第一個專利： 1956年Routin和Nickell首次數(shù)提出利用植物細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)天然產(chǎn)物的第一個專利 工業(yè)植物生物技術(shù) ：20世紀90年代明確提出 已經(jīng)從 200余種藥用植物獲得了愈傷組織或細胞懸浮培養(yǎng)物（傅經(jīng)國等，2004） 國際日本 ：紫草 人參 紅豆杉 歐美 ：美國紅豆杉； 德國紫錐菊國內(nèi)：羅士韋 葉和春 鄭光植 侯嵩生 丁家宜 第4頁，共121頁。技術(shù)路線 目標植物選擇愈傷組織誘導(dǎo)液體培養(yǎng)培養(yǎng)條件的優(yōu)化反應(yīng)器擴大培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)固體、液體培養(yǎng)高產(chǎn)細胞系篩選生物合成途徑的研

3、究器官分化（發(fā)狀根）固體液體培養(yǎng)條件的優(yōu)化反應(yīng)器擴大培養(yǎng)有效成分提取、分離第5頁，共121頁。植物細胞培養(yǎng) 是指在離體條件下，將愈傷組織或其它易分散的組織置于液體培養(yǎng)基中進行振蕩培養(yǎng)，得到分散成游離的懸浮細胞，通過繼代培養(yǎng)增殖，獲得大量細胞的一種技術(shù)。第6頁，共121頁。植物細胞培養(yǎng)的特點:大小;細胞團的形式存在;纖維素細胞壁和大液泡,易被剪切力損傷;生長緩慢培養(yǎng)基成分豐富而復(fù)雜,易被微生物污染;需光氧二氧化碳第7頁，共121頁。培養(yǎng)類型按培養(yǎng)對象來說，可分為原生質(zhì)體培養(yǎng)和單細胞培養(yǎng)；按培養(yǎng)基類型可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)；按培養(yǎng)方式可分為懸浮細胞培養(yǎng)和固定化細胞培養(yǎng) 。第8頁，共121頁。植物

4、單細胞分離和初步培養(yǎng)單細胞獲得：機械法；酶解法；愈傷組織法單細胞培養(yǎng)：看護培養(yǎng)法（nursing culture)飼養(yǎng)層培養(yǎng)(feeding layer culture)第9頁，共121頁。固體培養(yǎng)固體培養(yǎng)是在培養(yǎng)基中加入一定量的凝固劑，經(jīng)加熱溶解后，分別裝人培養(yǎng)用的容器中，冷卻后凝結(jié)成固體培養(yǎng)基。優(yōu)缺點簡便易行、所占空間小 生長的不平衡，易出現(xiàn)了極化現(xiàn)象 易堆積生長過程中排出的有害物質(zhì) 有些生理生化指標測定不方便常用的固化劑 瓊脂、明膠（10%）等第10頁，共121頁。液體培養(yǎng) 1成批培養(yǎng)法 batch culture細胞和培養(yǎng)基一次性加入到培養(yǎng)容器或生物反應(yīng)器內(nèi)進行培養(yǎng),在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液

5、體積不變,不添加營養(yǎng)成分,待細胞增長和產(chǎn)物積累到適當(dāng)?shù)臅r間,一次性收獲細胞產(chǎn)物和培養(yǎng)液的培養(yǎng)方法.第11頁，共121頁。液體培養(yǎng) 1成批培養(yǎng)法 batch culture特點：操作簡單，培養(yǎng)周期短. 直接反映細胞生長代謝過程.可直接放大不能控制底物濃度細胞易老化生長周期短效率低.兩步成批培養(yǎng)法即使用兩個生物反應(yīng)器，第一個反應(yīng)器用于細胞生物量的累積，第二個反應(yīng)器用于次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。第12頁，共121頁。2. 半連續(xù)培養(yǎng)法 semi-continuous culture重復(fù)分批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng).在細胞增長和產(chǎn)物形成過程中,每間隔一段時間從中取出部分培養(yǎng)液或細胞,剩余的細胞作為種子,再用新的培養(yǎng)

6、液補足到原體積,使生物反應(yīng)器內(nèi)的總體積不變.特點:細胞可持續(xù)指數(shù)生長,并可保持產(chǎn)物和細胞在一較高的濃度水平,培養(yǎng)過程中可延續(xù)很長時間.可進行多次收獲.操作簡便,生產(chǎn)效率高.第13頁，共121頁。3連續(xù)培養(yǎng)法(continuous culture)連續(xù)培養(yǎng)法是利用連續(xù)培養(yǎng)反應(yīng)器，在投料和接種培養(yǎng)一段時間后，以一定速度連續(xù)采集細胞和培養(yǎng)液，并以同樣速度供給新鮮培養(yǎng)基以使細胞生長環(huán)境長期維持恒定的方法。該法的理論基礎(chǔ)是根據(jù)Monod公式，即生長速度取決于基質(zhì)的濃度。 maxS/(Ks+S) =特定生長速度； max=特定最大生長速度；Ks=飽和系數(shù)；S=基質(zhì)濃度兩階段連續(xù)培養(yǎng)法于第一反應(yīng)器中投入生長

7、培養(yǎng)基并連續(xù)加入該培養(yǎng)基，而于第二反應(yīng)器中投入生產(chǎn)培養(yǎng)基。 第14頁，共121頁。3連續(xù)培養(yǎng)法(continuous culture)特點:細胞能在近似恒定狀態(tài)下生長、營養(yǎng)物質(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度、pH基本保持恒定，細胞濃度以及細胞比生長速率可基本維持不變，細胞維持持續(xù)指數(shù)增長。穩(wěn)定狀態(tài)可有效地延長分批培養(yǎng)中的對數(shù)生長期。第15頁，共121頁。3連續(xù)培養(yǎng)法(continuous culture)問題:一直有細胞收獲，濃度一般不高細胞分裂快、易變異；由于是開放式操作，加上培養(yǎng)周期較長，容易造成污染對設(shè)備、儀器的控制技術(shù)要求較高。第16頁，共121頁。懸浮培養(yǎng)（Suspension culture）懸浮

8、培養(yǎng)是細胞培養(yǎng)的基本方法，是將單個游離細胞或小細胞團在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。 特點 1. 培養(yǎng)細胞可不斷增殖，且生長速度快。 2. 液體狀態(tài)下便于細胞和營養(yǎng)物質(zhì)的充分接觸和交換，細胞狀態(tài)可以相對保持一致。 第17頁，共121頁。細胞懸浮培養(yǎng)的建立愈傷組織的誘導(dǎo)懸浮系的建立與繼代培養(yǎng)懸浮細胞的生長動態(tài)懸浮細胞同步化第18頁，共121頁。愈傷組織的誘導(dǎo)選擇適宜的外植體：幼胚、下胚軸、子葉。選擇適宜的培養(yǎng)基：較高激素濃度；必要的附加物質(zhì)。第19頁，共121頁。要求：松散性好、增殖快、再生能力強。其外觀一般是色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色，呈細小顆粒狀，疏松易碎第20頁，共121頁。懸浮系的建立與

9、培養(yǎng)callus150250ml flaskcentrifuge isolationsubculture1g/10ml medium100120 rmp culture transfer 1 time/3d80 rpm第21頁，共121頁。第22頁，共121頁。成功的懸浮細胞培養(yǎng)體系特征懸浮培養(yǎng)分散性良好，細胞團較小，一般在3050個細胞以下。均一性好，細胞形狀和細胞團大小大致相同。懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。細胞生長迅速，懸浮細胞的生長量一般23天便可增加一倍。第23頁，共121頁。第24頁，共121頁。第25頁，共121頁。懸浮細胞的生長動態(tài)

10、第26頁，共121頁。懸浮細胞生長的衡量根據(jù)不同培養(yǎng)時間的細胞數(shù)變化，或細胞質(zhì)量變化。生長速率(p)：不同時間細胞密度(x)的自然對數(shù)與起始密度(x0)的自然對數(shù)之差與培養(yǎng)時間(t)的比值p(lnx-lnx0)/t鮮重：真空減壓過濾后稱重，反應(yīng)細胞生長情況干重：鮮細胞烘干至衡重，反應(yīng)細胞質(zhì)量第27頁，共121頁。影響懸浮細胞生長的因素起始愈傷組織的質(zhì)量接種細胞密度：懸浮細胞的起始密度一般在0.52.5105個細胞/毫升。接種初期的細胞密度過低往往使延遲期加長。最低有效密度：即能使細胞分裂、增殖的最低接種量。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基、方式、溫度、繼代周期。第28頁，共121頁。影響懸浮細胞生長的因素培養(yǎng)

11、基應(yīng)用條件培養(yǎng)基（生長過愈傷組織或懸浮細胞的液體培養(yǎng)基）提供單細胞生長和分裂所需的特殊代謝物?；九囵B(yǎng)基成分的調(diào)節(jié)視不同的培養(yǎng)目的而定 培養(yǎng)基設(shè)計時,一般均以誘導(dǎo)愈傷組織形成的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)進行調(diào)整。常用的培養(yǎng)基有MS、B5、LS 、N6等。植物激素和其他附加成分的應(yīng)用。第29頁，共121頁。影響懸浮細胞生長的因素培養(yǎng)方式：搖瓶，反應(yīng)器（氣動式、攪拌式）；分批培養(yǎng)，半連續(xù)培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)溫度 25繼代周期指具有一定起始密度的細胞,從開始培養(yǎng)到細胞數(shù)目和總重量增長停止的一個過程。培養(yǎng)周期的長短是由起始細胞密度、延遲期的長短、生長速率等決定。繼代培養(yǎng)（Subculture）：繼初代培養(yǎng)之后的連續(xù)數(shù)代的

12、擴繁殖培養(yǎng)過程。第30頁，共121頁。懸浮培養(yǎng)細胞的同步化細胞同步化：同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細胞都同時通過細胞周期的某一特定時期。植物細胞在懸浮培養(yǎng)中容易團聚并進入不同程度的分化狀態(tài)，因此，要達到完全同步化是十分困難的。同一培養(yǎng)體系的植物細胞經(jīng)常不能處于同一細胞周期，這種差異使懸浮細胞分裂、代謝以及生理生化狀態(tài)等復(fù)雜化。通過一定的理化措施可以使同一體系中的細胞達到相對同步化。 什么措施？第31頁，共121頁。細胞周期 第32頁，共121頁。饑餓法饑餓導(dǎo)致的細胞分裂受阻常常是使細胞不能合成DNA，即不能進入S期，或細胞分裂不能進行，即不能進入M期。因此，通過饑餓法可以獲得處于G1和G2期的同步化

13、細胞。氮饑餓時，通常獲得G1期的同步化細胞磷和碳饑餓時，獲得G1和G2期的同步化細胞。將饑餓細胞轉(zhuǎn)入完整培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)時，細胞分裂又可重新恢復(fù)。第33頁，共121頁。抑制劑法通過一些DNA合成抑制劑處理細胞，使細胞滯留在DNA合成前期，當(dāng)解除抑制后，即可獲得處于同一細胞周期(G1)的同步化細胞。常用抑制劑主要有5-氟脫氧尿苷(FudR)和羥基尿(HU)。用羥基尿處理獲得同步化細胞的方法在小麥、玉米、西芹等植物細胞培養(yǎng)中已有成功應(yīng)用。利用破壞微管的藥物將細胞阻斷在中期，常用的藥物有秋水仙素和秋水仙酰胺，后者毒性較小。第34頁，共121頁。分選法依據(jù)：細胞體積大小方法常規(guī)分選方法是梯度離心精細的

14、分選可采用流式細胞儀優(yōu)點操作簡單分選細胞維持了自然生長狀態(tài)，不會有其它處理帶來的副作用缺點分選精細度較差第35頁，共121頁。低溫處理可以提高培養(yǎng)體系中細胞同步化的程度Okamura等曾采用此方法使胡蘿卜懸浮細胞較好地同步化。梅興國等（2001）采用6低溫處理紅豆杉細胞也獲得較明顯同步化效果?？赡艿脑虿煌臏囟葘毎挠薪z分裂有極明顯的影響，在一定范圍內(nèi)，溫度下降使細胞分裂速度減慢，細胞周期延長，從而相應(yīng)地延長了分裂期的時間，使分裂指數(shù)提高，細胞同步化率升高。第36頁，共121頁。單細胞培養(yǎng)意義分離方法機械法酶解法培養(yǎng)方法平板培養(yǎng)看護培養(yǎng)微室培養(yǎng)雙層濾紙培養(yǎng)第37頁，共121頁。單細胞分離方

15、法機械法具體做法：將葉片輕輕研碎、過濾離心、收集凈化從未分化的疏松易碎的愈傷組織，通過搖床振蕩獲得分散的單細胞或小細胞團優(yōu)點：細胞不受酶傷害；有利于進行細胞的生理和生化研究。第38頁，共121頁。單細胞分離方法酶解法酶對細胞壁有一定的軟化作用，所以采用酶法時，必須加入甘露醇等滲透壓保護劑；可通過加入硫酸葡聚糖鉀來提高游離細胞的產(chǎn)量。酶解法的優(yōu)點可獲得較多的葉肉游離細胞（但對禾本科植物葉片效果不好）。第39頁，共121頁。細胞平板培養(yǎng)（plating culture)指將一定密度的懸浮細胞接種到一薄層固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的技術(shù)。Bergman(1960)首創(chuàng)單細胞的分離：一般采用酶分離法，小細胞

16、團不能超過6個細胞。單細胞懸浮液的制備：分離的單細胞經(jīng)培養(yǎng)基洗滌2次以后，調(diào)整密度為5103個/毫升植板：將1份已調(diào)整好密度的單細胞懸浮液與4份35的固體培養(yǎng)基充分混合均勻，然后均勻地平鋪于培養(yǎng)皿中，其厚度為5mm左右。第40頁，共121頁。細胞平板培養(yǎng)（plating culture)平板培養(yǎng)的效果一般用植板率來衡量。植板率是能長出細胞團的單細胞在接種單細胞總和中所占的比例。 每個平板形成的細胞團數(shù)植板率 每個平板接種的細胞總數(shù)第41頁，共121頁。細胞平板培養(yǎng)（plating culture)優(yōu)點：單細胞在培養(yǎng)基中分布均勻，便于在顯微鏡下對細胞進行定點觀察，是單細胞株篩選和突變體篩選的常用

17、方法。由于它具有篩選效率高、篩選量大、操作簡便等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于細胞分裂、分化、生理生化、遺傳變異、次生代謝產(chǎn)物合成等。缺點：通氣狀況不好，排泄物質(zhì)易積累造成毒害或影響組織吸收。第42頁，共121頁。細胞懸浮過濾與培養(yǎng)基混合植板培養(yǎng)克隆愈傷組織第43頁，共121頁?？醋o培養(yǎng)（nurse culture）Muir(1953)首創(chuàng)此法獲得煙草單細胞體系。優(yōu)點：簡便易行，效果好。缺點：不能在顯微鏡下追蹤細胞分裂、生長過程。第44頁，共121頁。第45頁，共121頁。微室培養(yǎng)(microchamber culture)在人工制造的無菌小室中，將一滴懸浮細胞液培養(yǎng)在少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖形成細胞團

18、的方法。由Jones等在1960年設(shè)計的。優(yōu)點：可對培養(yǎng)細胞連續(xù)進行顯微觀察，了解一個細胞的生長、分裂、分化等過程缺點：培養(yǎng)基少，營養(yǎng)和水分難以保持，pH變動幅度大，培養(yǎng)細胞僅能短期分裂。細胞起始密度：3080個/室。第46頁，共121頁。第47頁，共121頁。雙層濾紙植板培養(yǎng)Horsch等（1980）建立培養(yǎng)皿培養(yǎng)基飼養(yǎng)細胞層培養(yǎng)細胞 看護濾紙轉(zhuǎn)移濾紙第48頁，共121頁。固定化培養(yǎng)法 將細胞限制或定位于特定空間位置的培養(yǎng)技術(shù)稱為細胞固定化培養(yǎng)。固定化培養(yǎng)采用的固定化反應(yīng)器有網(wǎng)狀多孔板、尼龍網(wǎng)套和中空纖維膜等多種類型，將細胞固定于尼龍網(wǎng)套內(nèi)，或固定于中空纖維反應(yīng)器的膜表面，或固定于網(wǎng)狀多孔板

19、上，放入培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，或連續(xù)流入新鮮培養(yǎng)液，進行連續(xù)培養(yǎng)及連續(xù)收集培養(yǎng)產(chǎn)物，也可通入凈化空氣以代替攪拌。 第49頁，共121頁。與懸浮培養(yǎng)相比，固定化培養(yǎng)的優(yōu)點：提高了藥物的合成、積累；能長時間保持細胞活力；可以反復(fù)使用；抗剪切能力強；耐受有毒前體物質(zhì)的濃度高；遺傳性狀較穩(wěn)定；后處理難度小。第50頁，共121頁。固定化植物細胞培養(yǎng)技術(shù)要進入工業(yè)化生產(chǎn)有許多問題尚待解決。首先，固定化培養(yǎng)要求代謝產(chǎn)物必須是分泌到細胞外的。第二，植物細胞藥物的積累是不連續(xù)的，這也限制了固定化細胞方法的應(yīng)用。第三，易污染。Flash第51頁，共121頁。植物細胞規(guī)?；囵B(yǎng)規(guī)?；囵B(yǎng)體系的建立生 物 反 應(yīng) 器規(guī)模

20、化培養(yǎng)的技術(shù)問題第52頁，共121頁。植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的技術(shù)要求從工程的角度講必須要進一步研究和開發(fā)適宜于植物生長和生產(chǎn)的生物反應(yīng)器，建立最佳的控制和調(diào)節(jié)系統(tǒng)；從培養(yǎng)技術(shù)方面講必須滿足以下三個條件：培養(yǎng)的細胞在遺傳上應(yīng)是穩(wěn)定的，以得到產(chǎn)量恒定的產(chǎn)物。細胞生長速度快，短時間內(nèi)能生產(chǎn)較多產(chǎn)物產(chǎn)物不被迅速降解，最好能分泌到培養(yǎng)基中第53頁，共121頁。植物細胞規(guī)?；囵B(yǎng)體系的建立種子細胞選擇種子細胞增殖與放大培養(yǎng)大規(guī)模培養(yǎng)體系建立第54頁，共121頁。種子細胞選擇外植體選擇植物類型：遺傳基礎(chǔ)。在確定生產(chǎn)某一種化合物以后，首先必須準確選擇那些能夠產(chǎn)生目的化合物的植物種類及品種或單株。組織器官：由于天

21、然產(chǎn)物一般為次生代謝產(chǎn)物，而植物次生代謝產(chǎn)物的積累具有組織器官的特異性，因此，在起始細胞培養(yǎng)時盡量選擇自然狀態(tài)下產(chǎn)生天然產(chǎn)物的器官、組織作為外植體。第55頁，共121頁。種子細胞選擇高產(chǎn)細胞系的篩選懸浮細胞系單細胞克隆種細胞增殖第56頁，共121頁。種子細胞增殖與放大培養(yǎng)目的準備材料提供技術(shù)參數(shù)過程搖瓶反應(yīng)器第57頁，共121頁。大規(guī)模培養(yǎng)體系的建立培養(yǎng)方式成批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)和半連續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)方式的選擇根據(jù)次生產(chǎn)物積累而定，通常還根據(jù)不同要求進行改進。如當(dāng)細胞生長和產(chǎn)物合成需要不同的培養(yǎng)基時，就需要采用兩步法培養(yǎng)，先在細胞生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)大批量細胞，當(dāng)細胞生長至合成產(chǎn)物的階段后，將其轉(zhuǎn)至產(chǎn)物合

22、成培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在產(chǎn)物合成階段又可采用連續(xù)培養(yǎng)方式以延長細胞生產(chǎn)時間。第58頁，共121頁。生物反應(yīng)器類型及特點是指用于高等生物細胞批量化培養(yǎng)的裝置及其相應(yīng)控制系統(tǒng)。適合植物細胞培養(yǎng)的反應(yīng)器應(yīng)該具有適宜的氧傳遞、良好的流動性和較低的剪切力。攪拌式氣動式固定化式其它光照生物反應(yīng)器，轉(zhuǎn)鼓式第59頁，共121頁。反應(yīng)器類型體積（L）培養(yǎng)植物種類攪拌式7，15D. carota 胡蘿卜攪拌式20，15500N. tabacum 煙草攪拌式5000C. roseus 長春花螺旋攪拌式20C. blumei 五彩蘇提升攪拌式2.5P. elliotii 濕地松鼓泡式20，30，130P .ginseng

23、人參鼓泡式65，1500N. tabacum 煙草外環(huán)氣升式10，30，85C. roseus 長春花導(dǎo)筒氣升式20，210D.lanata 狹葉毛地黃轉(zhuǎn)鼓式14V.rosea 長春花植物細胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器第60頁，共121頁。攪拌式反應(yīng)器是根據(jù)植物細胞特性在微生物發(fā)酵罐基礎(chǔ)上改進而成。攪拌裝置要減少剪切，一般改葉輪式為螺旋式。必須設(shè)計加液裝置必須設(shè)計通氣裝置適宜的取樣口第61頁，共121頁。第62頁，共121頁。氣動式反應(yīng)器又稱空氣提升式反應(yīng)器特點：剪切力小，但攪拌不很均勻。 Flash第63頁，共121頁。固定化反應(yīng)器特點：較容易地控制培養(yǎng)系統(tǒng)的理化環(huán)境，可以研究特定的代謝途徑，便于調(diào)節(jié)。

24、細胞位置的固定使其所處環(huán)境類似于在植物體中所處的狀態(tài)，相互間接觸密切，可形成一定的理化梯度，有利于次生產(chǎn)物合成?？梢詮呐囵B(yǎng)基中提取產(chǎn)物，免除了培養(yǎng)基中因初級代謝產(chǎn)物積累造成對代謝的反饋抑制，延長生產(chǎn)周期，進行連續(xù)生產(chǎn)。第64頁，共121頁。固定化反應(yīng)器種類：主要有流化床、膜反應(yīng)器和填充反應(yīng)器植物細胞固定化一般采取凝膠包埋、膜固定、網(wǎng)格和泡沫固定和表面吸附等。包埋式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物多采用瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽和聚丙烯酰胺等附著式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物多采用尼龍網(wǎng)、聚氨酯泡沫和中空纖維等。第65頁，共121頁。Alfermann等(1983)用氣升式系統(tǒng)，采用海藻鈣固定細胞成功地用30 L和2

25、00 L的反應(yīng)器生產(chǎn)地高辛。Jose等(1983)進一步用中空纖維反應(yīng)器培養(yǎng)胡蘿卜和碧東茄生產(chǎn)代謝產(chǎn)物酚類物質(zhì)Mavituna等（1987）使用板式反應(yīng)器和循環(huán)床反應(yīng)器培養(yǎng)固定化辣椒細胞，最大辣椒素生產(chǎn)速率（以干辣椒細胞計）達到0.5mggd，與成熟期辣椒合成辣椒素的速率相當(dāng)。第66頁，共121頁。規(guī)?；囵B(yǎng)中有關(guān)工程技術(shù)問題懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)必須適應(yīng)植物細胞特性細胞體積大。其平均直徑比細菌大幾十倍通常以2200個細胞，直徑2mm大小的非均勻小細胞團形式存在。抗剪切能力弱。生長速度慢，周期長，培養(yǎng)基成分復(fù)雜，有利于微生物生長，因此在培養(yǎng)中維持無菌環(huán)境難度較大但又十分重要。第67頁，共121頁。規(guī)?；?/p>

26、培養(yǎng)中有關(guān)工程技術(shù)問題培養(yǎng)液的流變特性粘度變化是由細胞密度和細胞狀態(tài)變化造成的煙草細胞培養(yǎng)，當(dāng)細胞密度低于7g/L時，培養(yǎng)液粘度基本不變，而高于此值時，培養(yǎng)液粘度增加。長春花細胞培養(yǎng)密度在10g/L時，培養(yǎng)液粘度有賴于細胞年齡、形態(tài)和細胞團大小。在相同物質(zhì)濃度下, 大細胞團的營養(yǎng)液表觀粘度明顯大于小細胞團的表觀粘度。第68頁，共121頁。規(guī)?；囵B(yǎng)中有關(guān)工程技術(shù)問題氧氣含量調(diào)節(jié)KLa（氧的傳遞系數(shù)， Nv=Kla(C*-C) ）：如在4L的氣升式反應(yīng)器中進行長春花細胞培養(yǎng)時，KLa在20h-1左右時。細胞生長與次生產(chǎn)物合成維持在良好狀態(tài)；在15L通風(fēng)式反應(yīng)器中培養(yǎng)的煙草細胞，當(dāng)KLa在510h

27、-1的范圍內(nèi)，生物量和代謝產(chǎn)物隨KLa增加而增加。溶氧濃度：毛地黃細胞培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)基氧濃度從10飽和度上升至30，細胞生長速率從0.15d-1上升至0.20d-1，如果繼續(xù)上升至 40，細胞生長速率反而下降至0.17d-1。第69頁，共121頁。規(guī)?；囵B(yǎng)中有關(guān)工程技術(shù)問題CO2調(diào)節(jié)在通氣過程中，混入24的CO2能消除高通氣速率對長春花細胞生長和次生代謝產(chǎn)物合成的不利影響。第70頁，共121頁。規(guī)?；囵B(yǎng)中有關(guān)工程技術(shù)問題泡沫和表面黏附性植物細胞培養(yǎng)中易產(chǎn)生泡沫，且覆蓋蛋白質(zhì)和粘多糖，細胞極易被包埋在其中從循環(huán)的培養(yǎng)液中帶出來，形成非均相培養(yǎng)而影響培養(yǎng)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和生產(chǎn)率。消除方法化學(xué)消泡：天

28、然油脂、高級醇類、聚醚類機械消泡第71頁，共121頁。提高植物細胞藥物產(chǎn)量的途徑選擇適宜的起始材料種類、部位梔子（Gardenia jasminoides）胚軸 銀杏子葉 當(dāng)歸根 紅豆杉 幼嫩的莖茜草 葉柄 第72頁，共121頁。高產(chǎn)細胞株的篩選直接篩選法 紅豆杉 紫杉醇玫瑰茄 花色苷（比對照提高14.5倍）誘變育種法伊貝母紫外光黃連 60Co （小檗堿含量達6.12%）紅豆杉 苯丙氨酸第73頁，共121頁。高產(chǎn)細胞株選擇梅興國（2001）通過在培養(yǎng)基中添加1.6mM的L-Phe，篩選出了抗Phe的紅豆杉細胞懸浮系，其紫杉醇含量高于原型細胞35倍。第74頁，共121頁。產(chǎn)生等于或高于親本植物藥

29、物含量的植物細胞培養(yǎng)系統(tǒng) 植物種類培養(yǎng)類型化合物含量（）干重 化合物植物人參愈傷 人參糖苷274.1海巴戟懸浮 蒽醌182.2洋紫蘇懸浮 迷迭香酸163.0紫草懸浮 紫草寧141-2唐松草 懸浮 小檗堿 10 0.01 日本黃連懸浮 小檗堿102-4蓬子菜懸浮 蒽醌5.41.2豬殃殃懸浮 蒽醌3.80.2煙草愈傷 煙堿3.42.0第75頁，共121頁。優(yōu)化培養(yǎng)基選擇合適培養(yǎng)基種類及植物生長調(diào)節(jié)劑桅子 藏紅花酸心臟病B5，MG-5利于細胞生長M-9利于黃色素合成 （鐘青平等1994）高山紅景天紅景天苷抗疲勞、抗缺氧NAA; BA好于2,4-D; IAA; KT（韓愛明等1997）胡蘿卜黃酮GA3

30、 抑制（Hindere et al.1984） 桔葉雞眼藤 蒽醌1mg/L NAA促； 1mg/L 2,4-D抑 （Linus等1995） 煙草 尼古丁 IAA促；2,4-D抑（Furuya1987） 第76頁，共121頁。不同植物激素對長春花細胞的懸浮培養(yǎng)物中生物堿產(chǎn)量的影響培養(yǎng)基最大生物堿產(chǎn)量(%干重)其它生物堿數(shù)量(化合物數(shù)量)生長培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)蛇根堿啊嗎堿B5+24D+KTB5+24D+KT0.000.000B5+24D+KTB5-無激素0.080.061B5+24D+KTB5+IAA+KT0.330.0810B5+24D+KTMS+IAA+KT0.040.022B5+24D+KTMS+

31、IAA+BA0.30.452M3-CMM3-CM0.580.1414B5+NAA+KTB5+NAA+KT0.240.0612M3-CMMS+IAA+BA1.000.049B5+NAA+KTMS+IAA+BA0.420.325第77頁，共121頁。優(yōu)化培養(yǎng)基(調(diào)節(jié)碳源 )增加碳源可促進次生代謝物質(zhì)的積累 彩葉草細胞 迷迭香葉寧酸 化妝品長春花細胞 阿馬里新、利血平高血壓紅豆杉細胞 紫杉醇 葡萄細胞 花青素血管的守護神第78頁，共121頁。優(yōu)化培養(yǎng)基(添加有機物 )在紅花（Carthamus linctorius）培養(yǎng)細胞中加入0.1水解酪蛋白，可使維生素E的產(chǎn)量提高約5倍（Yamamoto et

32、 al，1989）。10%椰乳，能明顯促進滇紫草愈傷組織紫草素的產(chǎn)生，其紫草素的含量是對照的24倍(周立剛等1991)。紫草素肝膽疾病輔助用藥甘煩遠等（1997）研究表明，云南紅豆杉懸浮細胞適宜的培養(yǎng)基為B5，當(dāng)添加椰子汁(CM)、酪蛋白氨基酸(CA)和水解乳蛋白(LH)3種有機物時，均能提高培養(yǎng)細胞中紫杉醇的含量，而且CM和CA還能促進細胞的生長。 第79頁，共121頁。調(diào)節(jié)pH值及光照 控制pH培養(yǎng)基將有利于藥物的生成。南方紅豆杉愈傷 pH 5.5 對愈傷組織生長最為有利pH 7.0 對紫杉醇積累最為有利大槭樹(APsendoplatanus)細胞降低pH將有利于煙堿的釋放 光對于藥物的積

33、累具有重要的作用玫瑰茄懸浮細胞花青素合成藍光促進；紅光和橙光無效長春花愈傷組織生物堿合成藍光促進；綠光抑制第80頁，共121頁。調(diào)節(jié)礦質(zhì)元素 氮和磷的作用氮源促進長春花細胞的生長抑制長春花生物堿的合成 (Knobloch1982）適當(dāng)?shù)腘H4+NO3-比例有助于葡萄細胞花青素的積累高濃度NH4+抑制云南紅豆杉愈傷生長，但顯著提高紫杉醇的含量。 （陳永勤等2000）磷促進長春花細胞生長抑制吲哚生物堿合成 (周立剛等，1991）第81頁，共121頁。其它元素高濃度的Co2+和Fe2+有利于花青素的積累（杜金華等，1997）CaCl2和MgSO4，能明顯提高蘿芙木咖啡堿的含量 在紫草細胞培養(yǎng)中，紫草

34、素的含量明顯受到Ca2+濃度的影響（Fujita et al. 1981） Cu2+可能對梔子黃色素的產(chǎn)生有促進作用，（鐘青萍等，1994） 第82頁，共121頁。提高植物細胞藥物產(chǎn)量的途徑前體（precursor）的應(yīng)用作用：提高目的產(chǎn)物產(chǎn)量。選擇對某一目的產(chǎn)物來講可能有多種前體物質(zhì)同一種前體物質(zhì)又可能有多條代謝路徑從而形成不同的代謝產(chǎn)物。針對其合成的關(guān)鍵生化過程進行前體物質(zhì)添加。多數(shù)前體物質(zhì)對細胞生長本身并不十分有力注意前體濃度。過量也可能產(chǎn)生反饋抑制。第83頁，共121頁。人參皂甙的生物合成途徑乙酰輔酶A 甲羥戊酸（MVA）反式角鯊烯（C30） 2,3-氧化鯊烯 環(huán)阿屯醇 達瑪烯二醇 香

35、樹素植物甾醇 人參皂甙Rg1 人參皂甙Ro第84頁，共121頁。外源L-苯丙氨酸槲皮素，玫瑰茄細胞花青苷產(chǎn)量提高1.3倍異丁子香酚 提高番椒的香蘭素、香草酸和阿魏酸的產(chǎn)量苯丙氨酸、苯甲酸、絲氨酸和甘氨酸能使東北紅豆杉中紫杉醇含量高出l4倍亮氨酸或BaccataIII能提高紫杉醇的含量(30%-100%)苯丙氨酸、肉桂酸和乙酸鈉，在水母雪蓮細胞培養(yǎng)中，在培養(yǎng)6d時，細胞進入快速生長期，此時加入前體物質(zhì)有利于細胞的生長和黃酮合成。肉桂酸可提高約1倍。第85頁，共121頁。提高植物細胞藥物產(chǎn)量的途徑激發(fā)子（elicitor）的應(yīng)用也稱誘導(dǎo)子，是指能夠誘導(dǎo)植物細胞中某些反應(yīng)，并形成細胞特征性自身反應(yīng)的

36、分子。非生物激發(fā)子，如輻射、金屬離子、茉莉酸類似物（茉莉酸甲酯，M-JA）等。生物激發(fā)子外源激發(fā)子：菌絲、微生物機體提取物及微生物產(chǎn)生的多糖、蛋白和脂肪酸等內(nèi)源性激發(fā)子：來源于植物結(jié)構(gòu)的化合物。如降解細胞壁的酶、細胞壁碎片、寡聚糖等有機分子。第86頁，共121頁。生物激發(fā)子蜜環(huán)菌發(fā)酵液在延胡索植物細胞培養(yǎng)中顯著促進了原鴉片堿的合成在丹參毛狀根細胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，加入蜜環(huán)菌發(fā)酵液培養(yǎng)34d后，細胞丹參酮的含量可提高至接近活體植物細胞的水平。寡糖素有利于人參和西洋參的細胞生長和皂甙的積累酵母提取物促進生物堿、黃酮類合成在長春花、葛和茶等多種植物細胞培養(yǎng)中已成功應(yīng)用提高植物細胞藥物產(chǎn)量的途徑第87頁，共

37、121頁。提高植物細胞藥物產(chǎn)量的途徑非生物激發(fā)子激發(fā)子對南方紅豆杉細胞培養(yǎng)合成紫杉醇的影響激發(fā)子適宜濃度（mM）與對照比提高產(chǎn)物效率（倍）M-JA0.17.0花生四烯酸0.16.5硝酸柿胺1.05.5水楊酸0.14.5硝酸鹽0.013.0第88頁，共121頁。M-JAMg/L0.00.110.01.0第89頁，共121頁。提高植物細胞藥物產(chǎn)量的途徑抑制劑的使用雙氯苯咪唑和氯化膽堿固醇生物合成抑制劑可使青蒿素合成量明顯提高。可達到與黃花蒿葉中所含的青蒿素處于同一個數(shù)量級嘧啶醇甾體合成代謝抑制劑可提高云南紅豆杉紫杉醇的含量矮壯素（CCC）赤霉素的生物合成抑制劑質(zhì)量濃度為 5.0 mgL的 CCC可

38、使紫杉醇含量提高60以上。第90頁，共121頁。提高植物細胞藥物產(chǎn)量的途徑培養(yǎng)技術(shù)的選擇包括反應(yīng)器的選擇和培養(yǎng)方式的選擇培養(yǎng)技術(shù)的選擇不僅要考慮細胞生長和產(chǎn)物積累的效率，同時還應(yīng)考慮技術(shù)基礎(chǔ)和生產(chǎn)成本。第91頁，共121頁。提高植物細胞藥物產(chǎn)量的途徑兩相培養(yǎng)指在植物細胞培養(yǎng)體系中加入水溶性或脂溶性的有機化合物，或者是具有吸附作用的多聚化合物，使培養(yǎng)體系由于分配系數(shù)不同而形成上、下兩相，細胞在其中一相中生長并合成次生代謝物，這些次生代謝物又通過主動或被動運輸?shù)姆绞结尫诺桨?，并被另一相所吸附。?2頁，共121頁。提高植物細胞藥物產(chǎn)量的途徑兩相培養(yǎng)組成：培養(yǎng)相和提取相組成類型：液-液系統(tǒng)和液-固

39、系統(tǒng)液-液系統(tǒng)：分離相主要使用液體石蠟、烷類化合物。分離相和培養(yǎng)基的化學(xué)性質(zhì)和比重不同。液-固系統(tǒng)：是指提取相以固態(tài)形式存在于系統(tǒng)中，主要通過吸附分離目的產(chǎn)物，目前使用的主要有活性炭、硅酸鎂載體、沸石、蠶絲以及樹脂。第93頁，共121頁。紅豆杉細胞兩相培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇實驗材料：東北紅豆杉細胞系培養(yǎng)基：第一相：B5培養(yǎng)基，第二相：5(v/v)的松油醇，產(chǎn)物釋放劑：5(v/v)二甲基亞砜。接種量:10g (鮮重)/100ml培養(yǎng)基/250mL 三角燒瓶。培養(yǎng)條件：25，120rpm，黑暗培養(yǎng)。第94頁，共121頁。細胞干重；紫杉醇產(chǎn)量；兩相系統(tǒng) ；單相系統(tǒng)第二相的加入，使得紫杉醇產(chǎn)量提高到30.19

40、mg/L，比對照增加103%；63的紫杉醇從胞內(nèi)的釋放出來，其中有75轉(zhuǎn)移至有機相。第95頁，共121頁。提高植物細胞藥物產(chǎn)量的途徑兩步培養(yǎng)在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞在生產(chǎn)培養(yǎng)基中積累產(chǎn)物第96頁，共121頁。提高植物細胞藥物產(chǎn)量的途徑器官組織的培養(yǎng)培養(yǎng)材料的分化程度，常常影響到藥物的含量。如在條葉龍膽愈傷組織中，龍膽著含量較低，而根的分化可以提高龍膽苦苷的含量發(fā)狀根（毛狀根，hairy root）培養(yǎng)生產(chǎn)次生產(chǎn)物，已在人參、丹參、紫草、顛茄和黃芪等植物中進行了探索性研究，并取得良好進展。體細胞胚規(guī)?；囵B(yǎng)用于次生產(chǎn)物的生產(chǎn)在少數(shù)植物中開展了研究。第97頁，共121頁。第98頁，共121頁。毛狀根

41、毛狀根(hairy roots)是發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes）感染雙子葉植物后，其Ri質(zhì)粒上的T-DNA片斷整合進植物細胞核基因組中誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種特殊表現(xiàn)型。 毛狀根可以不依賴激素快速生長，根多叢生，多分枝，多根毛，無向地性。 1934年，Hildebrand 報道了發(fā)根農(nóng)桿菌感染蘋果樹產(chǎn)生發(fā)根 第99頁，共121頁。生物反應(yīng)器培養(yǎng)青蒿毛狀根生產(chǎn)青蒿素青蒿：為雙子葉植物藥菊科植物青蒿素：倍半萜內(nèi)酯類化合物功效：治療瘧疾第100頁，共121頁。1.Bioreactor, 2.Concentric draught cylinder, 3.Stainless ste

42、ll mesh, 4.Air outlet, 5.Timer, 6.Mist nozzle, 7.Medium, 8.Air inlet, 9.Air filter, 10.Flowmeter, 11. Holes on draught cylinder, 12.Electromagnetic valve, 13.Air storage tank, 14.Nebulizing device, 15. 40W fluorescent lamp第101頁，共121頁。第102頁，共121頁。生物反應(yīng)器培養(yǎng)青蒿毛狀根生產(chǎn)青蒿素第103頁，共121頁。Growth feature of Artemis

43、ia annua adventitious shoot in the mist bioreactor (a) 0 d ; (b) 10 d ;10cm30cm第104頁，共121頁。生物反應(yīng)器培養(yǎng)青蒿毛狀根生產(chǎn)青蒿素實驗材料青蒿毛狀根：由發(fā)根農(nóng)桿菌R1601誘導(dǎo)青蒿葉片產(chǎn)生培養(yǎng)方法及條件1. 固體培養(yǎng)2030 mm青蒿毛狀根根尖MS固體培養(yǎng)基(添加30 g/L蔗糖)繼代時同為15d第105頁，共121頁。生物反應(yīng)器培養(yǎng)青蒿毛狀根生產(chǎn)青蒿素培養(yǎng)方法及條件2. 液體振蕩培養(yǎng)（三角瓶）接種量：每L培養(yǎng)液（MS）5 g 毛狀根培養(yǎng)物（分支多且細長的毛狀根）120-130 rpm，251 ，12 hd光照液體培養(yǎng)的繼代時間為10 d。 3. 反應(yīng)器培養(yǎng)12 hd培養(yǎng)，25I 。霧化間隔30 min，霧化2min。通氣量為0.5 Lmin，通氣時間為15 mln。第106頁，共121頁