-miRNA講稿學生用-PPT課件

1、miRNA簡介miRNA定義： 微小RNA(microRNA，miRNA)是一種長度約為22-28 nt的非編碼小分子RNA，miRNA通過與靶mRNA 3UTR(Untranslated Regions,即非翻譯區(qū)，是mRNA分子兩端的非編碼片段)完全或不完全的互補結合，導致靶mRNA降解或翻譯抑制，從而調控靶基因的表達，影響細胞增殖、分化和凋亡.它們通過miRNA介導的特異性的基因沉默導致靶mRNA降解及抑制蛋白質的合成調控轉錄后基因表達水平。miRNA對細胞的增殖、分化和凋亡有重要的調節(jié)作用。 miRNA定義：在基因組中有被翻譯成蛋白質的區(qū)域也有非翻譯的區(qū)域而翻譯區(qū)域僅占全基因組的1 4

2、 。為何存在大部分非翻譯區(qū)域呢？ m i R N A 是來自非翻譯區(qū)域的單鏈R N A ， 存在于細胞內部。是基因調控的重要分子。miRNA*定義RNase-III酶Dicer將pre-microRNA剪切成不完全配對的雙鏈RNA雙體（miRNA:miRNA*),即成熟microRNA和其互補序列所組成的二聚體，起作用的是miRNA,選擇性整合RISC中設別靶基因而起作用，而miRNA*會降解。miRNA和siRNA區(qū)別把疾病相關R N A 作為靶點的藥物中，s i R N A 藥物15個已經進入實質性的臨床研究。s i R N A 為雙鏈R N A ， 具有與靶點R N A 互補的結構，完全

3、互補靶向抑制基因表達，長度與m i R N A類似， 約為19-25 個堿基對。s i R N A 在體內由酶解旋為單鏈 與靶點mR N A 結合后降解。s i R N A 和m i R N A 都會抑制m R N A 向蛋白質的翻譯 但是其作用方式卻差別頗大。一般認為siRNA 的特異性很高 不會發(fā)生結合于非目標mR N A 的脫靶情況(off -targeting) 。但是 研究發(fā)現miRNA的結合能力存在擺動 1 個miRNA可抑制多個mRNA 的功能。研究人員預測在miRNA 靶點藥物開發(fā)方面,這一特點具有重要意義,因此miRNA的作用效果可能更高，但是作用機理更復雜，對基因調控的網絡

4、作用往往難以研究清楚。miRNA作用方式miRNA對其功能靶點的最低要求是，至少7個堿基與5端互補結合，就可調控其靶基因。miRNA與靶mRNA的作用方式有兩種。當兩者完全互補時，miRNA的作用方式與RNA干擾相似，即與完全互補的同源mRNA配對結合，導致靶mRNA降解。而當miRNA與靶mRNA不完全互補時，miRNA則通過與靶mRNA的3端非翻譯區(qū)結合，阻遏轉錄后翻譯。由于許多miRNA與靶mRNA并不完全互補，所以主要的作用模式是轉錄后的翻譯阻遏（調控）。張辰宇:吃什么補什么發(fā)現植物的微小核糖核酸（microRNA）可以通過日常食物攝取的方式進入人體血液和組織器官。并且，一旦進入體內，

5、它們將通過調控人體內靶基因表達的方式影響人體的生理功能，進而發(fā)揮生物學作用。這一研究成果公布在Cell research雜志上。 生物通 ebiotrade 這一研究成果公布后吸引了媒體關注，美國大眾科學網站對此也進行了報道，稱研究人員發(fā)現蔬菜里的核糖核酸(RNA)在食入后會進入體內循環(huán)的血液，而且一旦進入我們體內，就能改變我們的基因表達。證明植物miRNA可能是食物中的“第七種營養(yǎng)成分”（其他六種分別是水、蛋白質、脂肪酸、碳水化合物、維他命和稀有元素）；張辰宇:微小RNA的人體之旅在實驗中，研究人員給小鼠喂的是生米，而人類日常進食吃的是熟米，食物經過加熱之后是否會破壞其微小RNA呢？張辰宇指

6、出，煮過的米飯中仍然含有很多微小RNA，經過油炸才能破壞掉大部分的微小RNA。他們還發(fā)現，中藥在經過煎煮之后，藥湯里的微小RNA的濃度很高。給小鼠喂藥之后24小時，就發(fā)現小鼠肺部相應的微小RNA濃度增高。他們認為，這些發(fā)現為在傳統(tǒng)的中草藥中發(fā)現一類全新的活性分子提供了依據。對于生物學來說，更大的意義可能在于，這些研究為我們理解跨“界”的相互作用提供了新的線索?！皠游?、植物之間如何的借著微小RNA互相調控的？大家說不定共進化（co-evolution）了。”張辰宇說。miRNA網站miRNA發(fā)揮對約3 0 人類蛋白質的表達調節(jié)作用。序列分析表明，至少有1/3的人類基因與miRNA調控相關，而且越

7、來越多的試驗證據表明，miRNA還有很多功能未被發(fā)現。MiRNA最早在1993年在線蟲體內發(fā)現。迄今在人體已經發(fā)現并命名的miRNA 超過了1萬 個。除了早期發(fā)現的let一7等保留命名外，一般命名為miR-數字。見網站：/ starBase：一個高通量實驗數據CLIP-Seq（或稱為HITS-CLIP）和mRNA降解組測序數據支持的microRNA靶標數據庫，整合和構建多個流行的靶標預測軟件的交集和調控關系。網址：/Tarbase：一個收集已被實驗驗證的microRNA靶標數據庫。網址：microrna.gr/tarbase/ miRec

8、ords：一個整合的microRNA靶標數據庫。整合多個靶標預測軟件的調控關系。網址：/targetScan: 基于靶mRNA序列的進化保守等特征搜尋動物的microRNA靶基因。是預測microRNA靶標假陽性率較低的軟件。而且是microRNA領域大牛Bartel實驗室開發(fā)的。網址/PicTar：基于microRNA或microRNA靶標聯(lián)合作用等特征開發(fā)的搜尋動物的microRNA靶基因的軟件，假陽性率也較低。是microRNA領域大牛Rajewsky實驗室開發(fā)的。該文章位列miRNA相關文章引用Top5。網址：pic

9、tar.mdc-berlin.de/ PITA：基于靶位點的可接性（target-site accessibility）和自由能預測microRNA的靶標。是著名的生物信息學家Segal實驗室開發(fā)的。網址：genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_data.html RNA22：基于序列特征預測microRNA的結合位點。是幾個流行的microRNA靶標預測軟件的其中一個。IBM公司的研究團隊開發(fā)的。網址：cbcsrv.watson.ibm/rna22.htmlmiRanda和microRNA.org：是著名的Memorial Sloan-Kettering

10、癌癥研究中心的研究人員開發(fā)的軟件和數據庫。miRanda的最新版本又叫mirSVR。網址： MicroCosm：EMBL-EBI的Enright 實驗室開發(fā)的microRNA靶標數據庫。網址：miRTarBase：整合實驗證實的microRNA靶標的數據庫。網址： miRGator v2.0：整合microRNA表達、靶標和疾病相關信息的數據庫。網址：MiRNAMap:動物的microRNA基因及其靶標的數據庫。網址： miRDB: 動物microRNA靶標預測和功能注釋數據庫。網址： RNAhybrid：一個基于miRNA-target配對自由能預測microRNA的靶標的軟件。網址： mi

11、RGen：microRNA基因和microRNA靶標數據庫。網址：m i R N A與腫瘤研究m i R N A 的研究普遍集中于監(jiān)測腫瘤的發(fā)生發(fā)展和靶向腫瘤治療。( 1 ) m i R N A 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用， 參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個階段。結腸癌發(fā)生發(fā)展的各個階段， 經歷了不典型增生、腺瘤、癌及腫瘤轉移等一系列變化， 每一個階段都有相應的基因發(fā)生改變， 同時也有調控這些基因的m i R N A 發(fā)生變化。事實上， m i R N A 與基因之間相互調控，共同突破平衡， 才導致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。作為腫瘤發(fā)生的重要信號通路。 m i R N A與腫瘤研究( 2 ) m i R

12、N A 具有很好的組織特異性。經篩查檢測4 8 個m i R N A 確定腫瘤的組織來源準確率達9 0 。( 3 ) m i R N A 具有腫瘤發(fā)生的階段特異性， 同一種腫瘤在發(fā)生發(fā)展不同分期階段具有不同的m i R N A 表達譜。 ( 4 ) m i R N A 分子較小， 在石蠟包埋的組織中較m R N A 更為穩(wěn)定， 對于石蠟保存的組織檢測m i R N A 將更為準確。( 5 ) 最近有報道證實血清或者血漿中游離m i R N A 也是有價值的腫瘤監(jiān)測指標， 能夠穩(wěn)定地被檢測并且提示腫瘤狀態(tài)，使m i R N A 作為新的腫瘤標志物具有較好的應用前景。m i R N A與腫瘤研究部

13、分腫瘤與miRNA變化（2倍高，0.5低）A549/T與A549細胞miRNA芯片的qPCR驗證miRNA在腫瘤治療中的希望miRNAs在腫瘤發(fā)生發(fā)展中所起的重要作用給新型抗癌藥物的開發(fā)帶來了希望。改變腫瘤中miRNAs的表達量被視為一種新的治療策略，主要包括引入抑癌基因性miRNAs、敲除或削減癌基因性miRNAs早期發(fā)現的miRNAmiRNA可以作為腫瘤抑制因子或者癌基因，在癌癥中發(fā)揮其功能，let一7在肺癌中表達降低，是腫瘤預后較差的生物標記。在體外轉染let一7g可以抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞死亡。在免疫缺陷小鼠體內，let-7g可以抑制腫瘤形成。let-7對一些癌基因(如Kras

14、、HMGA2)以及抑癌基因(如BRCA1)均可起到重要的調節(jié)作用 ，miR-200在腫瘤表達低，生存率低，表達高，生存率高。作為腫瘤抑制因子miR一122可以抑制癌細胞的某些特性，例如克隆存活、不依賴支持物生長、轉移、侵襲、上皮-間質轉化、裸鼠成瘤。這些結果表明，在肝臟中miR-122作為腫瘤抑制因子行使其功能。在體外miR-122可以直接抑制內皮細胞生成血管。在鼠肝細胞癌模型中，證實了miR-122以ADAM17為靶點發(fā)揮其抑瘤活性。 作用機理miR-143和miR-145在結腸腺瘤形成早期，表達下調，促使腺瘤形成。對其3端突起處進行化學修飾，使其活性增強、抵抗核酸酶。這種經化學修飾后的mi

15、R-143復合物可以抑制人DLD一1結腸癌細胞移植瘤形成，有可能成為治療結腸癌的RNA藥物 作為癌基因m i R - 2 1 是目前唯一的在幾乎所有腫瘤中表達上調的m i R N A ， 其參與了腫瘤細胞的增殖、遷移、浸潤以及腫瘤的血管生成等多個環(huán)節(jié)，并且在體外已經證實與多個抗腫瘤藥物的敏感性有關。目前認為，m i R-2 1 調控腫瘤細胞的多種藥物敏感性的機制主要與m i R-2 1 參與調控細胞周期， 抑制細胞凋亡有關。迄今為止，m i R - 2 1 比較明確的靶分子有P T E N 、P D C D 4 、M a s p i n 、T P M I 、N F I B 、R E C K 、

16、S P R Y 2 及M A R C K S 等。 作為腫瘤診斷用miRNA作為分子標記作為腫瘤的診斷準確率達90 。僅用1個miR-205指標來區(qū)分肺鱗癌及非鱗癌的敏感性就達96 ，特異性達90。在實際應用方面，miRNA的表達水平可以從石蠟包埋的腫瘤組織 、血清、胸腹腔積液，甚至痰液中檢測，應用范圍廣，甚至可以實現無創(chuàng)檢測，符合人們對理想分子標志的所有要求。經典的miRNA合成途徑miRNA 可能來自于基因組的基因間隔區(qū)或者編碼基因的內含子中。首先在細胞核內編碼miRNA 的基因通過RNA 聚合酶II 或RNA 聚合酶III 轉錄生成初級miRNA(pri-miRNA)，pri-miRNA

17、與來自蛋白質編碼基因mRNA相似，有5 端帽式結構和3 端多聚腺苷酸尾結構，長度可達數千個堿基。接著p r i -miRNA 在一種RNaseIII(Drosha 酶)和它的伴侶分子(DiGeorge syndrome critical region gene 8, DGCR8)組成的復合物作用下，剪切為7080 個核苷酸長度、具有莖環(huán)結構的miRNA 前體(pre-miRNA)。 作用機理miRNA 前體在Ran-GTP 依賴的核質/ 細胞質轉運蛋白輸出蛋白5(exportin 5)的作用下，從核內運輸到胞質中。隨后miRNA前體在另一種RNaseIII(Dicer酶)的作用下被剪切成21-

18、28 個核苷酸長度，而且其5端磷酸化和3端有2 nt 的懸垂序列，類似于siRNA 的不完全配對的雙鏈RNA，它們是由成熟miRNA與miRNA* 組成的二聚體，miRNA*是pre-miRNA中的一段RNA，其位置恰好與成熟的miRNA 相對。最后在RNA 解旋酶作用下生成成熟miRNA 和miRNA*，成熟miRNA結合到RNA誘導的基因沉默復合物(RNA-induced silencingcomplex, RISC)中發(fā)揮作用，miRNA* 則被降解。 推測mirtron途徑 在無脊椎動物和哺乳動物中發(fā)現一種不依賴Drosha酶而產生miRNA的新途徑,即mirtron途徑。該途徑的發(fā)現

19、為進一步解釋miRNA的產生機制提供了重要資料以及新的研究思路。 疾病治療研究基因的功能通常是將其從基因組中敲除，然后觀察敲除前后的變化，但在破譯miRNA的功能，一般不會采用這種策略，而是通過增強或減弱該miRNA的表達來鑒定其功能。miRNA mimics是模擬生物體內源的miRNAs，運用化學合成的方法合成，能增強內源性miRNA的功能。miRNA mimics進一步增強內源miRNA的沉默作用，降低細胞內靶向蛋白表達量，進行功能獲得性（gain-of-function）研究 疾病治療 miRNA inhibitor是化學修飾的專門針對細胞中特異的靶miRNA的抑制劑。近年來人工合成的m

20、iRNA（artificial miRNA，amiRNA）已經成功應用于沉默預期靶基因的表達及其功能研究，人工合成的miRNAs既能夠特異性地沉默單一基因，也可以同時沉默多個相關但不相同的基因。miRNA inhibitors，特異的靶向和敲除單個的miRNA分子，可以削弱內源miRNA的基因沉默效應，提高蛋白表達量， 反義技術：miR21: 5-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3反義DNA:5-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3硫代、氟代、甲基化等修飾，L2000轉染。動物實驗。同以往的反義寡核苷酸技術類似。 反義藥物抑制過高表達的miRNA時，使用互補核酸的反義

21、藥物非常有效。主要在修飾上，用硫代、氟代、甲基化等修飾，也有用鎖核酸BNA(bridged nucleic)人工核酸將反義藥物的2位和4位碳通過橋結構連接而抗核酸酶分解。同基因的反義藥物類似，不同的是miRNA反義藥物是靶向miRNA正義鏈。首個在人體中試驗的miRNA藥物病毒中同樣發(fā)現了基因編碼的miRNAs，病毒miRNAs在蛋白質編碼基因中所起的調節(jié)作用可能是在病毒中維持復制、逃逸宿主免疫等。文獻報道，miR一122與靶基因的5-UTR相結合，可以促進丙型肝炎HCV的復制 ，目前已經開發(fā)miR-122作為抗病毒治療靶點，丹麥制藥公司Santafis Pharma宣布其開發(fā)的丙型肝炎新型治

22、療手段SPC3649(鎖核酸LNA-antimiRTM-122)開始進入人體第一階段臨床試驗，這是世界上首個在人體中試驗的miRNA藥物。miRNA藥物2019年5月28日，丹麥制藥公司Santaris Pharma的SPC3649為世界上首例miRNA藥物進入臨床研究，作用靶點為miR-122,為丙型肝炎藥物，miR-122是肝細胞中表達高的miRNA，與丙型肝炎病毒增殖有關。48例健康人參與了I期臨床試驗。2009年葛蘭素史克和美國Regulus公司合作進行反義抑制miRNA靶點藥物研究，合同金額6億美圓。 前景siRNA藥物出來后，對原來專一性反義抑制靶基因的反義藥物（例如抑制Bcl2基

23、因的G3139）研究認為沒有放大效應，抑制效果有限。認為siRNA藥物的靶向性也好，不會出現脫靶效應，并且有放大效應，比反義藥物作用敏感。但是同miRNA藥物比較，miRNA的結合能力變化大，1個miRNA可以抑制多個甚至幾十個mRNA的功能，因此認為miRNA靶點藥物的特點是1個靶點可能將該類疾病的相關因子一網打盡，因此可能比siRNA藥物具有更高的有效性。 同Bcl2相關的目前進行比較多的研究是過表達miR-181,145,15a,15b,16,34,或用反義抑制21 腫瘤耐藥性胃癌細胞系SGC7901和長春新堿耐藥細胞比較，后者24個miRNAs下調2倍以上，11個miRNAs 上調2倍

24、以上。Q-RTPCR進一步證明miR-181s下調4倍。耐藥可能通過miRNAs水平改變調節(jié)引起，CDDP引起卵巢癌細胞的let-7e,miR-30c,miR-25b,miR130a,miR335的不同表達水平變化，認為這6個可能相關于耐藥。 腫瘤耐藥性胃癌細胞系SGC7901和長春新堿耐藥細胞比較，后者MDR表達增加，miR-181b下調，Bcl2表達增加。高表達miR-181b使MDR表達增加下降，Bcl2蛋白水平下降，miR-181b的Q-RTPCR表達增加，對化療藥物敏感性增加和凋亡敏感性。耐藥可能通過miRNAs水平調節(jié)改變，CDDP引起的卵巢癌細胞let-7e,miR-30c,mi

25、R125b,miR-130a,miR335等不同表達水平變化，認為這6個miRNAs同耐藥直接相關。實際可能有相當多的miRNAs參加化療耐藥的影響，調節(jié)部分miRNAs可能增加化療耐藥的敏感性。cardiac fibroblasts directly to cardiomyocytesCirculation Research published online April 26, 2019心肌成纖維細胞-心肌細胞在實驗室器皿中首次將實驗鼠心臟病發(fā)作后留下的疤痕組織變成心肌細胞。最新研究一旦在人類身上試驗成功，將有助于科學家們研發(fā)出新的心臟衰竭療法。研究小組成功利用誘導性多能干細胞（iPS細胞）

26、人工制成癌干細胞并在小鼠身上得到驗證日本京都大學研究小組將Oct3/4,Sox2,c-myc,klf4通過逆轉錄病毒載體轉入小鼠的成纖維細胞，把成纖維細胞變成類似胚胎干細胞的多能干細胞，并將其命名為iPS.研究一般方法miRNA表達低，轉染過表達方法：（1） 載體方法，慢病毒方法（2）miRNA mimics模擬物， 成熟sense，Antisense 為兩條合成，不完全配對，文獻miR-181b，成熟sense連模擬物為一條鏈，單鏈，可以委托合成，有現成庫，成熟sense，Antisense在/找到，成熟sense就為紅色區(qū)，Antisense則在后面2個不配對區(qū)改成配

27、對，并且鏈用3-benzen-pyridine(BP)修飾。已進行動物實驗（文獻miR143） 抑制相關基因表達siRNA與miRNA藥物不同1、根據mRNA序列，寫出siRNA,aiRNA序列及可能的修飾方式：GUGGGACUUUGGAAAUACA2 miR-181b序列是: 5-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU -3，設計出反義藥物序列和miRNA藥物可能的序列和修飾方式結論miRNAs的發(fā)現無疑是對現有真核生物基因表達調控的補充，其在基因調控及生物發(fā)育中的作用正在被不斷研究并開發(fā)。miRNAs在體內不僅作為功能分子發(fā)揮作用，還參與并決定基因表達調控、蛋白質翻譯，從而影響細胞

28、代謝等所有生命進程。結論由miRNA介導的RNA干擾技術正迅速從基礎研究領域邁進臨床應用，相信不久的將來將有越來越多的RNA干擾藥物進入臨床研究和應用。循環(huán)miRNAs作為一種無創(chuàng)性檢測手段在疾病的早期診斷和預后中也展示出廣闊的應用前景。相信不久的將來將有越來越多的臨床檢測得到應用?；A研究方面的基因調控網絡的論文將越來越多。結論雖然miRNAs在疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用是“因”還是“果”仍需更多研究來證明，但可以認為對miRNAs的深入研究推動了從RNA、DNA和蛋白質三大生物分子方面對疾病進行預測、診斷和治療的進程。結論但是siRNA、miRNA的RNAi技術真正能應用于日常生活雖然為時尚早，還需要科學家們進一步廣泛深入細致持久的研究。盡管如此，我們依然可以預測，與其它基因技術一樣， siRNA 、miRNA的RNAi技術將在不久的將來會在基因治療和基因應用中發(fā)揮極大的作用，并將給整個生物理論帶來巨大而深遠的影響lnc