FISH技術(shù)及其臨床應(yīng)用課件

1、1熒光原位雜交技術(shù)及其在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用FISH methods and its medical application一、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization,FISH)60年代 Pardue Gall 建立（一）方法與原理：制備DNA探針（用生物素或熒光素標(biāo)記）（下圖）變性制備CS或間期細(xì)胞標(biāo)本變性處理探針與待測DNA雜交洗脫用熒光素標(biāo)記的生物素親和蛋白使雜交區(qū)發(fā)熒光（信號放大）(下圖） 熒光顯微鏡檢測2（二）探針制備方法1.缺口平移法(Nick translatrion)用生物素（biotin)標(biāo)記dUTPDNA酶切口DNApolymerase

2、53外切酶活性DNApolymerase 53聚合酶活性3BdUTP45335DNAse5335OHpDNA聚合酶標(biāo)記核苷酸GGCOHOHOHOHpBBGCUAUA53355 33 5分子雜交與信號放大5BBB熒光素親和蛋白抗體探針待測基因CCGAGGCTGGCUCCGA(略）2.隨機(jī)引物法（random primer):6聚核苷酸 klenow酶6FISH ProcedureDenature the chromosomesDenature the probeHybridizationFluorescence stainingExamine slides or store in the dar

3、k7（三）探針種類1）探針池探針（cs涂抹探針）：可結(jié)合在整條CS上每一部位。24色（常CS22條XY）89Whole chromosome probes10Whole chromosome probes 112）著絲粒探針：結(jié)合于著絲粒處，檢測間期核內(nèi)DNA數(shù)（CS數(shù)）121314Repetitive sequence probes3）端粒探針：結(jié)合于端粒處15164) 特異位置探針 :cs某一具體位置探針 例：Yq12 repetitive probe1718位點(diǎn)特異性探針5）染色體臂涂抹探針：結(jié)合于cs的q或p上。19（四）探針標(biāo)記方法間接標(biāo)記（前述） 時間長 信號明顯直接標(biāo)記 時間短

4、信號弱20二、FISH種類： 以FISH過程中探針結(jié)合部位或探針顏色的不同，將FISH分為多種。21221.Centromere Single Color FISH232.Single Color FISH (Telomeres)243.Dual color FISH254 多色熒光原位雜交265.Spectral Karyotyping (SKY)（光譜核型分析）276. 24 colors FISH287.M-FISH with telomeres and centromeres29M-FISH with chromosome banding specific probes308.間期FI

5、SH三、 FISH優(yōu)點(diǎn)（ Advantage）: less labor-intensive method for confirming the presence of a DNA segment within an entire genome than other conventional methods31FISH - a process which vividly paints chromosomes or portions of chromosomes with fluorescent moleculesidentify the presence and location of a re

6、gion of DNA within morphologically preserved chromosome preparations, then can identifies chromosomal abnormalitiesoften used during M phase but is now used on interphase as well32四、FISH在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用舉例1、用已知探針檢測未知CS畸變332、用顯微切割方法檢測未知CS畸變 顯微切割PCR CS特異探針池(黃色熒光) 與正常人CS雜交(例:2號染色體某段發(fā)黃色熒光) 結(jié)果？343、產(chǎn)前診斷 例:檢測間期細(xì)胞內(nèi)DN

7、A分子數(shù) 例：21三體例：18三體354、植入前診斷36Preimplantation Genetic Diagnosis (PGD)37圖示1例13/14羅式易位攜帶者的胚胎植入前FISH診斷資料：一對6年不育，女，32歲，cs正常，男34歲，核型：45，XY,t(13;14)(q10;q10),并伴少、弱精。采用單精子卵泡漿（intracytoplasmicsperm injection,ICSI)輔助授精，胚胎發(fā)育到3天6-8細(xì)胞期取出一個細(xì)胞進(jìn)行雙色FISH檢測。參圖：用13q和14q探針，見核中2個13號（綠色）和2個14號（紅色）信號細(xì)胞，表明？38移植后18周做羊水細(xì)胞CS檢查3

8、9PGD5、腫瘤診斷 腫瘤診斷探針檢測間期細(xì)胞內(nèi)DNA分子數(shù)腫瘤細(xì)胞內(nèi)有癌基因擴(kuò)增4041腫瘤診斷42慢性粒細(xì)胞白血病43慢性粒細(xì)胞白血病44慢性粒細(xì)胞白血病456.微小染色體畸變檢測46Microdeletion 7.遺傳病診斷 （圖）例1：家系1 FISH結(jié)果用Xcs著絲粒探針（綠色）和DMD exon46探針(紅色）雜交。圖示DMD男患者FISH結(jié)果：只有Xcs著絲粒綠色信號，無DMD exon46紅色信號，說明？477.遺傳病診斷 （圖）48 圖示：DMD男患者姐姐2條Xcs均有DMD Exon46信號(紅色）。表明？7.遺傳病診斷 （圖）49圖示：DMD男患者妹妹只有1條Xcs上有D

9、MD Exon46信號。表明？7.遺傳病診斷 （圖）50例2：家系2FISH結(jié)果在DMD患者母親1/3淋巴細(xì)胞中僅有1條Xcs上有DMD Exon46雜交信號，另一條上無。7.遺傳病診斷 （圖）51圖示：在DMD患者母親2/3淋巴細(xì)胞中在2條Xcs上有DMDExon46雜交信號。A和B結(jié)果表明？7.遺傳病診斷 （圖）52例3：圖示1復(fù)雜易位患者FISH結(jié)果（該患者致妻流產(chǎn)3次）核型：46，XY，t（5；20；16）(q35;p13;q21)三色FISH（5q綠色;16q橙色；20p藍(lán)色）結(jié)果參圖：a:5號;b:衍生5號;c:16號;d:衍生16號;e：20號;f：衍生20號.53例4 FISH

10、技術(shù)從母血中檢測胎兒有核紅細(xì)胞圖示：孕早期母血中胎兒有核紅細(xì)胞，可見YCS特異雜交信號。54例5 13q部分三體致斜頸、不對稱臉、右臉小，用13q探針檢測（黃色信號）。圖示：2條13號CS，另一13號接到1號短臂上。55圖示：該患者G帶核型56例6 白血病患者骨髓細(xì)胞雙色FISH 8、基因定位(略)（參下頁圖)附:FISH試劑盒例子（參資料）5758IB665B376B12IB568D11S4170D11S1348D11S921D11S1322D11S935D11S4045D11S3969D11S1779D11S1330B344A5D11S4205IB3011D11S4172D11S1362AFM337TC5D11S4143D11S1886D11S1343D11S4078D11S1793D11S4129D11S4107D11S4089D11S4402D11S4094D11S439