第三代基因測(cè)序技術(shù)比較與總結(jié)

1、第三代基因測(cè)序技術(shù)比較與總結(jié)摘要在第二代測(cè)序技術(shù)的協(xié)助下，個(gè)人基因組圖譜正在如火如荼地繪制中。在第二代測(cè)序技術(shù)的協(xié)助下，個(gè)人基因組圖譜正在如火如荼地繪制中。但第二代測(cè)序技術(shù)很快就遇上了強(qiáng)勁的對(duì)手一一第三代測(cè)序技術(shù)，也被稱為“下、下一代 的測(cè)序(n ext -n ext- gen eratio n seque ncin g) ”。第三代測(cè)序技術(shù)是基于納 米孔(nanopore)的單分子讀取技術(shù)，有著更快的數(shù)據(jù)讀取速度，應(yīng)用潛能也勢(shì)必 超越測(cè)序。2012年2月5日，基因組科學(xué)家們齊聚美國(guó)佛羅里達(dá)州的基因組生物和技術(shù)進(jìn)展會(huì)議，來了解哪家公司的第三代測(cè)序技術(shù)能實(shí)現(xiàn)人類基因組的3分鐘測(cè)序或以5000美元

2、的價(jià)格出售。盡管科學(xué)家們對(duì)公布的數(shù)據(jù)表示謹(jǐn)慎樂觀，但他們 對(duì)于此類測(cè)序儀的優(yōu)越之處仍心存疑慮。Complete Geno mics在2008年10月，美國(guó)加利福尼亞州的 Complete Genomics公司曾宣稱他們 將在2009年以5000美元的價(jià)格售賣人類基因組，但當(dāng)時(shí)沒有公布支持?jǐn)?shù)據(jù)。在 這次會(huì)議上，該公司公布了一個(gè)人類基因組，據(jù)稱是用9臺(tái)儀器在8天內(nèi)完成的。該公司的CEO Clifford Reid 表示，他們將254GB的數(shù)據(jù)拼接成草圖，覆 蓋某個(gè)匿名男性基因組的92%每個(gè)堿基平均讀取了 91次。與目前應(yīng)用中的高 速測(cè)序，即第二代測(cè)序類 似，Complete Genomics也產(chǎn)生

3、短的DNA賣長(zhǎng)。通過 對(duì)每個(gè)堿基的多次測(cè)序，它的目標(biāo)是排除悄悄混入的可能錯(cuò)誤。Reid認(rèn)為這項(xiàng)技術(shù)非常準(zhǔn)確，堿基錯(cuò)誤的概率低 于0.33%。這與目前的測(cè)序儀相當(dāng)。Complete Gen omics并不出售測(cè)序儀，但用自己的測(cè)序儀來完成所有的內(nèi)部 工作。這讓某些科學(xué)家質(zhì)疑，但另一些卻深受鼓舞。速度和費(fèi)用成為Complete Genomics的最大賣點(diǎn)。該公司并沒有透露基因組 測(cè)序的確切費(fèi)用，但據(jù)稱每個(gè)基因組的原材料費(fèi)用低至 1000美元。它的目標(biāo)是 在上個(gè)月推出市場(chǎng)，今年對(duì)1000個(gè)基因組進(jìn)行測(cè)序，明年測(cè)序數(shù)量達(dá)到 20000 個(gè)。Pacific Bioscie nces在Complete G

4、enomics做報(bào)告前的一小時(shí)，Pacific Biosciences的首席技術(shù)官Stephen Turner展示了大腸桿菌的完整基因組，并稱每個(gè)堿基的平均讀取 了 38次，準(zhǔn)確率大于99.9999%。Pacific Biosciences利用了單分子技術(shù)和DNA聚合酶，在反應(yīng)的同時(shí)讀取 測(cè)序產(chǎn)物。盡管目前儀器的讀取速度僅為 3堿基/秒，但它的目標(biāo)是在2013年 前實(shí)現(xiàn)三分鐘讀完人類基因組。它還有望實(shí)現(xiàn)更長(zhǎng)的讀長(zhǎng)。 Tuner表示大腸桿菌 基因組的平均讀長(zhǎng)是586 bp,有些能達(dá)到2805 bp。某些科學(xué)家期望長(zhǎng)讀長(zhǎng)能排 除錯(cuò)誤，讓他們了解到難以讀取的部分。Pacific Bioscience

5、s 打算在明年正式推向市場(chǎng)。同時(shí),目前的測(cè)序技術(shù), 如lllumina、Applied Biosystems 和Roche也正以驚人的速度制造數(shù)據(jù)，在單 次幾天的運(yùn)行中產(chǎn)生相當(dāng)于多個(gè)人類基因組的數(shù)據(jù)。 速率不斷增長(zhǎng)的同時(shí), 費(fèi)用 也在下降。例 如， lllumina 在會(huì)議中表示它在今年年底能實(shí)現(xiàn) 10000美元的人 類基因組測(cè)序。要實(shí)現(xiàn)單分子實(shí)時(shí)測(cè)序，有三個(gè)關(guān)鍵的技術(shù)。第一個(gè)是熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸。 顯微鏡現(xiàn)在再厲害， 也不可能真的實(shí)時(shí)看 到“單分子”。 但是它可以實(shí)時(shí)記錄熒光的強(qiáng)度變化。 當(dāng)熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸 被摻 入DNA鏈的時(shí)候，它的熒光就同時(shí)能在 DNA鏈上探測(cè)到。當(dāng)它與DNA鏈形

6、 成化學(xué)鍵的時(shí)候，它的熒光基團(tuán)就被DNA聚合酶切除，熒光消失。這種熒光標(biāo)記 的脫 氧核苷酸不會(huì)影響DNA聚合酶的活性，并且在熒光被切除之后，合成的DNA 鏈和天然的DNA鏈完全一樣。第二個(gè)是納米微孔。因?yàn)樵陲@微鏡實(shí)時(shí)記錄 DNAg上的熒光的時(shí)候，DNA鏈 周圍的眾多的熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸形成了非常強(qiáng)大的熒光背景。 這種強(qiáng)大的熒 光背景使單分子的熒光探測(cè)成為不可能。 Pacific Biosciences 公司發(fā)明了一種 直徑只有幾十納米的納米孔zero-mode waveguides (ZMWs)，單分子的DNA聚 合酶被固定在這個(gè)孔內(nèi)。在這么小的孔內(nèi)，DNA鏈周圍的熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸 有限

7、，而且由于A, T，C, G這四種熒光標(biāo) 記的脫氧核苷酸非?？焖俚貜耐饷孢M(jìn) 入到孔內(nèi)又出去， 它們形成了非常穩(wěn)定的背景熒光信號(hào)。 而當(dāng)某一種熒光標(biāo)記的 脫氧核苷酸被摻入到DNA鏈時(shí)，這種特定顏色 的熒光會(huì)持續(xù)一小段時(shí)間，直到 新的化學(xué)鍵形成，熒光基團(tuán)被 DNA聚合酶切除為止(見圖)。第三個(gè)是共聚焦顯微鏡實(shí)時(shí)地快速地對(duì)集成在板上的無數(shù)的納米小孔同時(shí) 進(jìn)行記錄。由于我對(duì)顯微原理的物理知識(shí)匱乏，而 Pacific Biosciences 公司又 沒有非常強(qiáng)調(diào)在這方面的發(fā)明，不做進(jìn)一步探討。他們還對(duì)這一技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。第一個(gè)是把雙鏈DNA環(huán)化反復(fù)測(cè)序。人們可以在雙鏈DNA勺兩頭連上發(fā)夾結(jié) 構(gòu)的D

8、NAadaptor，從而使DNA環(huán)化。而DNA聚合酶就能夠以環(huán)化的DNA乍為模 板滾環(huán)復(fù)制，反復(fù)測(cè)一段DNA序列。這種反復(fù)測(cè)序，糾正了偶爾出現(xiàn)的復(fù)制錯(cuò) 誤， 從而使測(cè)序精度非常高。第二個(gè)是激發(fā)光中斷測(cè)序法。DNA聚合酶雖然很穩(wěn)定，但是在強(qiáng)大的激發(fā)光 乍用下酶也是有一定壽命的。如果把激發(fā)光中斷一段時(shí)間，在這段時(shí)間內(nèi) DNA 聚合酶繼續(xù)復(fù)制DNA當(dāng)激發(fā)光重新開啟以后，人們就可以測(cè)到長(zhǎng) DNA1后面的 序列。第三代測(cè)序技術(shù)非?？膳?。1它實(shí)現(xiàn)了 DNA聚合酶內(nèi)在自身的反應(yīng)速度， 一秒可以測(cè)10個(gè)堿基，測(cè)序速度是化學(xué)法測(cè)序的2萬倍。2、它實(shí)現(xiàn)了 DNA聚合 酶內(nèi)在自身的processivity（延續(xù)性，

9、也就是DNA聚合酶一次可以合成很長(zhǎng)的片段），一個(gè)反應(yīng)就可以測(cè)非常長(zhǎng)的序列。 二代測(cè)序現(xiàn)在可以測(cè)到上百個(gè)堿基， 但 是三代測(cè)序現(xiàn)在就可以測(cè)幾千個(gè)堿基。 這為基因組的重復(fù)序列的拼接提供了非常 好的條件。 3、它的精度非常高，達(dá)到 99.9999% 。此外，它還有兩個(gè)應(yīng)用是二代測(cè)序所不具備的第一個(gè)是直接測(cè)RNA的序列。既然DNA聚合酶能夠?qū)崟r(shí)觀測(cè)，那么以 RNA 為模板復(fù)制DNA的逆轉(zhuǎn)錄酶也同樣可以。RNA的直接測(cè)序，將大大降低體外逆轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差。第二個(gè)是直接測(cè)甲基化的 DNA序列。實(shí)際上DNA聚合酶復(fù)制A、T、C、G的 速度是不一樣的。正常的C或者甲基化的C為模板，DNA聚合酶停頓的時(shí)間不

10、同。 根據(jù)這個(gè)不同的時(shí)間，可以判斷模板的 C是否甲基化。Pacific Biosciences 公司預(yù)計(jì) 2010 年或者 2011年就會(huì)推出商業(yè)化的測(cè)序 儀器。在不遠(yuǎn)的將來， 如果他們能和二代測(cè)序一樣集成 100萬個(gè)納米微孔， 那 么 一臺(tái)儀器 15 分鐘就能夠準(zhǔn)確地測(cè)出一個(gè)人的基因組。以后每個(gè)人的基因組測(cè)序 成本將變成 100美元，人人都可以消費(fèi)得起。想想人類基因組計(jì)劃耗資 30億美 元，費(fèi)時(shí)十幾年，無數(shù)科學(xué)家參與其中，技術(shù)的革新意義是多么重大啊 !Helicos Biosciences并不是每家測(cè)序公司都這么幸運(yùn)。 Helicos Biosciences 制造的第三代測(cè)序 儀就被測(cè)序錯(cuò)誤

11、所困擾。就在會(huì)議前幾天， Helicos 透露它的第一名顧客已經(jīng)將 測(cè)序儀退還。在這次會(huì)議上，該公 司表示它已經(jīng)拼接了線蟲的基因組。但是它 的歷史問題和高昂的儀器費(fèi)用，即使降低至 99.9999 萬美元，與其他測(cè)序儀的 50萬美元左右的價(jià)格相比，仍然讓 許多科學(xué)家望而卻步。在會(huì)議前的研討會(huì)上，來自多倫多安大略癌癥研究所的 John McPherson 說 出了大家的心聲：“ Helicos 是單分子測(cè)序的先鋒，但我認(rèn)為他們還沒有達(dá)到預(yù) 定的目標(biāo)?！钡?Helicos 的首席技術(shù)官 William Efcavitch 卻不認(rèn)同這種說法， “關(guān)于我們不行的傳聞太夸張了”。許多科學(xué)家希望他是對(duì)的，

12、他們期待著 Helicos 與其他公司繼續(xù)競(jìng)爭(zhēng)， 以更 低的價(jià)格獲得更多的數(shù)據(jù)。 一位科學(xué)家表示： “這種競(jìng)爭(zhēng)是良性的。 無論這些公 司干得多好，我們都期望更多?！被诩{米孔的單分子讀取技術(shù)， 英國(guó)牛津納米孔公司成功研發(fā)出第三代基因 測(cè)序技術(shù)。 該測(cè)序技術(shù)讀取數(shù)據(jù)更快、 有望大大降低測(cè)序成本， 改變個(gè)人醫(yī)療的 前景。當(dāng)前，基因測(cè)序工作費(fèi)時(shí)且昂貴，測(cè)序時(shí)，分子必須進(jìn)行多次復(fù)制 （ 這一步 被稱為擴(kuò)增 ） ，同時(shí)進(jìn)行熒光示蹤標(biāo)記，這一過程會(huì)帶來錯(cuò)誤，因此，一個(gè)基因 要被測(cè)序多次才能得到值得信賴的結(jié)果。 此外，購買和操作測(cè)序儀器的費(fèi)用也不 菲，目前，測(cè)定一個(gè)完整的基因組需要上萬美元。在納米孔測(cè)序技術(shù)

13、中，DNA分子依靠被稱為核酸外切酶的蛋白質(zhì)以一次一個(gè) 堿基的速度通過小孔。這個(gè)酶能清楚地區(qū)分出4個(gè)DNA堿基編碼：A、C、G T,也可以檢測(cè)出該堿基是否被甲基化，一個(gè)單孔能在大約 70 天左右測(cè)定一個(gè)完整 的基因序列。納米孔技術(shù)不需要熒光標(biāo)記物并且很可能不需要進(jìn)行擴(kuò)增，能直接并快速“讀”出DNA同時(shí)足夠廉價(jià)，使進(jìn)行大量重復(fù)實(shí)驗(yàn)成為可能。納米孔公司已經(jīng)研發(fā)出包含幾百個(gè)納米孔的芯片， 該芯片可以用在一臺(tái)機(jī)器 上，快速且廉價(jià)地給大量 DNA進(jìn)行排序?；驕y(cè)序于上世紀(jì)70年代由弗雷德桑格爾發(fā)明，他因此獲得了諾貝爾獎(jiǎng)， 第一份人類基因草圖于 2001年繪制成功，花費(fèi)了 40億美元。納米孔公司總裁戈登桑赫

14、納說，該技術(shù)預(yù)示了基因測(cè)序領(lǐng)域的一個(gè)跳躍變 化，花費(fèi)不到 1000美元就可以完成一個(gè)基因測(cè)序。 借助該技術(shù)， 在未來 5 年內(nèi)， 測(cè)序費(fèi)用將有可能降至 500美元。到那時(shí)，基因測(cè)序可以成為英國(guó)國(guó)民健康保險(xiǎn) 制度的一部分，民營(yíng)保險(xiǎn)公司也支付得起。該技術(shù)也可以讓醫(yī)生使用DNA來預(yù)測(cè) 并且預(yù)防諸如心臟病、糖尿病等疾病，更加有效地開藥。世界著名基因測(cè)序公司lllumi na的總裁杰伊弗拉特利稱，10年后，每一 個(gè)新生嬰兒都會(huì)被“配備”完整的基因排序，費(fèi)用不超過 5000美元。最早的 Sanger 測(cè)序在人類基因組計(jì)劃中立下赫赫戰(zhàn)功，但也給基因組測(cè)序 貼上了數(shù)億美元的價(jià)格標(biāo)簽，讓人生畏。這兩年發(fā)展迅猛的

15、第二代測(cè)序儀 lllumina 的 GenomeAnalyzer、Roche454 的 GS系列以及 ABI 的 SOLiD系統(tǒng)讓人類基因組重測(cè)序的費(fèi)用蹭地降低到 10萬美元以下?，F(xiàn)在，能對(duì)單個(gè) DNA分 子進(jìn)行測(cè)序的第三代測(cè)序儀也 加入到這場(chǎng)比賽中，讓競(jìng)爭(zhēng)更加激烈。目前，第三代測(cè)序主要有三種技術(shù)平臺(tái)。 兩種通過摻入并檢測(cè)熒光標(biāo)記的核 苷酸，來實(shí)現(xiàn)單分子測(cè)序。 Helicos 的遺傳分析系統(tǒng)已上市，而 Pacific Biosciences準(zhǔn)備在明年推出單分子實(shí)時(shí)（SMRT技術(shù)。第三種 Oxford Nanopore 的納米孔 （nanopore） 測(cè)序還尚未有推出的時(shí)間表， 但有可能是這三種

16、當(dāng)中最便宜 的。納米孔測(cè)序的優(yōu)勢(shì)在于它不需要對(duì) DNA進(jìn)行標(biāo) 記，也就省去了昂貴的熒光 試劑和CCD照相機(jī)。最近， Oxford Nanopore Technologies 的 Hagan Bayley 及他的研究小組正 致力于改善納米孔。根據(jù)他們之前的工作，他們以a-溶血素來設(shè)計(jì)納米孔，并將環(huán)式糊精共價(jià)結(jié)合在孔的內(nèi)側(cè)（下圖）。當(dāng)核酸外 切酶消化單鏈DNA后，單個(gè) 堿基落入孔中， 它們瞬間與環(huán)式糊精相互作用， 并阻礙了穿過孔中的電流。 每個(gè) 堿基ATGC以及甲基胞嘧啶都有自己特有的電流振 幅，因此很容易轉(zhuǎn)化成DNA 序列。每個(gè)堿基也有特有的平均停留時(shí)間， 它的解離速率常數(shù)是電壓依賴的， +180 mV的電位能確保堿基從孔的另一側(cè)離開。a-溶血素納米孔（剖面圖）以及共價(jià)結(jié)合的環(huán)式糊精（淺藍(lán)色）瞬間結(jié)合落入 孔中的堿基 （紅色）。以往對(duì)甲基胞嘧啶進(jìn)行測(cè)序， 都要先進(jìn)行重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化， 而納米孔技術(shù)能 直接讀出這第五種堿基。這對(duì)表觀基因組測(cè)序的研究人員來說可謂是個(gè)好消息。納米孔測(cè)序預(yù)計(jì)能滿足大部分測(cè)序用戶的需求： 99.8%的準(zhǔn)確性相當(dāng)高，且 錯(cuò)誤很容易通過計(jì)算來糾正。 均